Высокоэффективная Трансфекцию человека THP-1 макрофагов по Nucleofection

Краткое содержание

Этот протокол представляет собой эффективный и надежный способ для трансфекции человека ТНР-1 макрофагов с миРНК или плазмидной ДНК путем электропорации с высокой эффективности трансфекции, сохраняя при этом высокую жизнеспособность клеток и макрофагов полный потенциал для дифференциации и поляризации.

Аннотация

Макрофаги, как ключевых игроков врожденного иммунного ответа, являются в фокусе исследований, касающихся использования тканевого гомеостаза или различных патологий. Трансфекцию с миРНК и ДНК плазмиды является эффективным инструментом для изучения их функции, но трансфекции макрофагов не тривиальный вопрос. Хотя много разных подходов для трансфекции эукариотических клеток имеются, лишь немногие позволяют надежной и эффективной трансфекции макрофагов, но снижение жизнеспособность клеток и сильно измененное поведение клеток, как уменьшенной способности к дифференциации или поляризации часто наблюдается. Поэтому протокол трансфекции требуется, что способен передавать миРНК и плазмидной ДНК в макрофаги, не вызывая серьезные побочные эффекты, тем самым позволяя исследование эффекта от миРНК или плазмиды в контексте нормальное поведение клеток. Протокол, представленные здесь, относится к способу надежно и эффективно трансфекции человека ТНР-1 макрофагов и Моnocytes с высокой жизнеспособности клеток, высокой эффективности трансфекции, и минимальное воздействие на поведение клеток. Этот подход основан на Nucleofection и протокол был оптимизирован для обеспечения максимальной возможности для активации клеток после трансфекции. Протокол является достаточным для адгезивных клеток после отрыва, а также клеток в суспензии, и может быть использован для малых и средних чисел выборок. Таким образом, метод, представленный полезен для изучения генных регуляторных эффектов во время макрофагов дифференциации и поляризации. Помимо представления результатов, характеризующих макрофаги трансфектированных соответствии с этим протоколом в сравнении с альтернативным методом химической, также обсуждается влияние культуры клеток Выбор среды после трансфекции на поведение клеток. Представленные данные указывают на важность проверки выбор для различных экспериментальных условиях.

Введение

Среди клеточных компонентов иммунной системы человека, макрофаги имеют большое значение для врожденного иммунного ответа. В их задачи разнообразны; они участвуют в фагоцитозе патогенов и некротического материала, они играют важную роль в гомеостазе ткани и продуцируют и секретируют большое количество цитокинов, чтобы регулировать и организовать иммунного ответа ^1. Поэтому макрофаги как единое участвует во многих физиологических процессов и патофизиологических условиях. В связи с разнообразием своих задач, макрофаги являются очень неоднородна и многогранна тип клеток. Это достигается за счет различной поляризации; в зависимости от внешних раздражителей макрофагов может перерасти в различных фенотипов ^2. Изменчивость макрофаги "и влияние на иммунный ответ сделать их очень интересный предмет исследования. Для того чтобы выяснить их сложную метаболические и регуляторные функции, соответствующий макрофагов в моделях пробирке являются Требуеuired которые правильно отражают макрофагов неоднородность и изменчивость.

Трансфекции клеток векторов плазмидной ДНК или малых интерферирующих РНК (миРНК), чтобы изменить выражение клеточного гена стал широко используемым и мощный инструмент в клеточной биологии для исследования как регуляции генов и функции гена. В настоящее время существует большой выбор различных инструментов, доступных для трансфекции эукариотических клеток. Эти инструменты включают в себя применение вирусных векторов, механических методов (например, генов орудий), на химических подходов (которые полагаются на полимеры или липиды, которые могут образовывать комплексы с нуклеиновыми кислотами), и электропорации клеток ^3. Все эти подходы имеют свои преимущества и недостатки, и выбор лучше всего подходит из этого широкого спектра для определенного типа клеток и применения может быть трудной и длительный процесс,.

Макрофаги как известно, трудно трансфекции как почти все устоявшиеся transfeие подходы резко сократить жизнеспособность макрофагов »или вмешиваться в их поведении, т.е. дифференциации и, в частности поляризации. Поэтому, мы представляем здесь эффективную, невирусный протокол для трансфекции человека THP-1 макрофагов с помощью электропорации основе технологии Nucleofector, которая представляет собой оптимизированный электропорации подход, требующий уменьшенные количества ДНК. Nucleofection хорошо подходит для чувствительных клеток, таких как моноциты и макрофаги. Этот протокол является адаптацией ранее опубликованных версий ^4,5.

Вкратце, форбол 12-миристат-13-ацетата (РМА) используется для различения человека ТНР-1 моноцитов в течение 48 ч в недоношенных макрофагов до трансфекции с миРНК или плазмидной ДНК. Для трансфекции predifferentiated макрофаги отдельно ферментативно обработкой Accutase I. Трансфекцию проводили с использованием устройства 2b Nucleofector для электропорации клеток. После трансфекции, отличаетсяentiation продолжают в течение еще 24 до 48 часов по мере необходимости. И, наконец, зрелые макрофаги, трансфицированные инкубируют с различными видами соединений для функциональных исследований.

Такой подход позволяет трансфекции клеточных линий, таких как человека THP-1 моноцитов и макрофагов и успешно применяется в прошлом ^6-10. В отличие от большинства подходов химической трансфекции, наша изменение процедуры Nucleofection с помощью преждевременных макрофаги дает высокую эффективность трансфекции в сочетании с ненарушенной жизнеспособности клеток, без необходимости использовать вирусные векторы или добавить дополнительные соединения, несущие с неизвестными побочными эффектами. Кроме того, макрофаги сохраняют свой ​​потенциал для дифференцировки, а также поляризацию таким образом позволяя беспрепятственно функциональных исследований после трансфекции ^11.

Кроме того, среда для культивирования клеток применяется после Nucleofection сильно влияет функциональных исследований следующую транзакциюsfection; в частности, способность макрофагов »для поляризации может зависеть от приложенного культуральной среды. Здесь четыре различных типа для культивирования клеток (IMDM, X-VIVO 20, LGM3 и мышь T Cell Nucleofector среднего) были испытаны в дезактивирующих условиях с использованием интерлейкина (ИЛ) 10. Использование ТНР-1 макрофагов, мы обнаружили, что клетки отзывчивость на IL10 является сильнее, когда мышь Т-клеток Nucleofector среда используется в сравнении с другой культуральной среде, упомянутых выше. Эти результаты показывают, что необходимости оптимизации всех условиях культивирования клеток имеет важное значение для успешной трансфекции унд последующих функциональных исследований, так как они могут значительно улучшить результаты эксперимента.

Как макрофаги участвуют в различных человеческих заболеваний, гораздо исследования направлены на выяснение макрофагов поведение, а также регулирующим механизмы, влияющие макрофаги или, в свою очередь, контролируемые макрофагов. Таким образом, этот протокол имеет прямое отношениемного различных научные направления.

Протокол

1 Predifferentiation из ТНР-1 макрофагов

1. Выращивают клетки ТНР-1 в среде RPMI-1640 с добавлением 10% (об / об) фетальной сыворотки теленка (FCS) и 1% (объем / объем) пенициллина / стрептомицина / л-глутамин (PSG) в СО ₂ (5% )-инкубатор при 37 ° С.
2. Перед трансфекцией разделить ячейки и передавать их на свежий RPMI среде, как и раньше. Выращивают клетки в течение 24 часов.
3. Семя 1,0-1,5 х 10 ⁷ клеток в 75 см ² тканевой культуральной колбы или 2,5 х 10 ⁷ клеток в 150-см ² тканевой культуральной колбы в среде RPMI-1640 и добавить 10% (объем / объем) FCS, 1% (об / V) ПСГ, 1% (об / об) пирувата натрия, 1% (об / об) несущественных аминокислот, 10 нг / мл РМА и 50 мкМ β-меркаптоэтанола в течение 48 часов.

2 Получение Nucleofection

1. Поместите Accutase I и все носители в водяной бане при 37 ° С.
2. Аспирируйте культуры из колбы и заменить 6 мл (75 см ² колбу) или 12 мл (150 см ² колбу) изAccutase я и инкубируют в течение 30 мин при 37 ° С в течение полного отрыва клеток. Соблюдайте клеток морфологию после лечения Accutase I для того, чтобы клетки имеют круглую внешний вид. Если некоторые клетки еще, кажется, придает, тщательно промыть колбу микропипеткой или слегка постучите его завершить отряд. Не использовать сотовые скребки, так как это будет иметь негативное влияние на жизнеспособность клеток. Передача клеточной суспензии в 15 мл пробирку.
3. Во время лечения Accutase I, подготовить следующую СМИ:
   1. Подготовка трансфекции среду: клеточную культуральную среду добавка с 1% (объем / объем) PSG, 1% (об / об) несущественных аминокислот, 1% (об / об) пирувата натрия, 5% (об / об) сыворотки человека (для миРНК) или 20% (об / об) сыворотки крови человека (для плазмидной ДНК); подготовить конечный объем каждой 3 мл / в течение одного образца 6-луночный планшет или 4 мл / образец в течение двух 12-луночных планшетах.
   2. Подготовьте среду культивирования: Дополнение культуральную среду с 1% (объем / объем) PSG, 1% (об / об) несущественных аминокислот, 1% (об / об) пирувата натрия, 5% (объем / объем) хуЧеловек в сыворотке крови (по миРНК) или 20% (об / об) сыворотки человека (плазмиды), 2,5 нг / мл РМА и 50 мкМ β-меркаптоэтанола; подготовить конечный объем каждой 3 мл / в течение одного образца 6-луночный планшет или 4 мл / образец в течение двух 12-луночных планшетах.
4. Центрифуга клеточной суспензии в течение 5 мин при 300 х г при комнатной температуре.
5. Клетки Аспирируйте Accutase I и ресуспендируют в 1 мл RPMI среде предварительно нагревают до 37 ° С; Количество клеток для определения количества клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При быстрые автоматизированные процедуры учета клеток используются, шаги 2.4 и 2.5 могут быть опущены и клетки можно пересчитать сразу после отряд при условии, что длительное воздействие Accutase I избежать.
6. Для каждого образца трансфекции подготовить аликвоты в центрифужные пробирки, содержащие 2,0-2,5 х 10 ⁶ клеток.

3 Nucleofection из ТНР-1 макрофагов

1. Центрифуга все аликвоты течение 10 мин при 250 х г при комнатной температуре.
2. Развести ДНК плазмиды или миРНК в нуклеазы безвода или соответствующем буфере. Держите необходимый объем ДНК плазмиды или миРНК как можно меньше.
3. Подготовьте одну кювету Nucleofector либо 1 мкг миРНК или 0,5 мкг плазмидной ДНК для каждой трансфекции.
4. Выполните одно трансфекции в то время. Аспирируйте супернатант от клеток аликвоту.
5. Ресуспендируют клетки осаждали в растворе Nucleofector, чтобы получить общий объем 100 мкл ДНК / миРНК и раствор Nucleofector. Держите время воздействия чистого раствора Nucleofector к минимуму и обеспечить время экспозиции не превышает 15 мин.
6. Смешайте ресуспендировали клетки и ДНК / миРНК в Nucleofector кювете нежным разговоров.
7. Трансфекции клеток, выполняя программы Y-001 в Nucleofector 2b устройства.
8. Трансфер трансфекции клеток в реакционную пробирку, используя одноразовые пластиковые пипетки Пастера.
9. Сразу же добавить 500 мкл приготовленной трансфекции среду.
10. Повторите этапы от 3,4 до 3,9 для каждого образца трансфекции.

4. Сообщение-Nucleofection Уход

1. Подготовка либо 6-луночных или 12-луночных планшетах в течение трансфицированных клеток. Пипетка 2,5 мл трансфекции среды в каждую лунку 6-луночного планшета (1 и / трансфекции) или 1,75 мл трансфекции среды в каждую лунку 12-луночного планшета (2 скважины / трансфекции).
2. Смешайте клеточные суспензии тщательно микропипеткой.
3. Перенесите трансфекции клеток в подготовленные лунки (либо один хорошо в 6-луночного планшета или два в луночного планшета 12).
4. Выдержите пластины для 4 часов в увлажненном инкубаторе (5% СО _2, 37 ° C).
5. Проверьте воссоединении клеток под микроскопом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: большинство клеток должно быть приверженцем снова. Иногда, расширяя инкубационный период от 1 часа увеличивает количество прикрепленных клеток в случае недостаточного прикрепления.
6. Тщательно аспирата трансфекции среду микропипеткой и заменить равным количеством питательной среды. Только один Аспирируйте также одновременно.
<литий> Инкубируйте клетки для требуемого периода времени для максимального эффекта плазмиды или миРНК (24-72 ч). Если инкубационный период превышает 48 ч, заменить среду после 48 часов.
7. Для дополнительного лечения с эффекторов (например., Цитокины, агонисты, антагонисты и ингибиторы) использовать безсывороточную среду без PMA и β-меркаптоэтанола. Время конце инкубационного периода эффектора с момента максимального эффекта плазмиды или миРНК и планируют изменение среды и добавлением эффектора соответственно. Не поддерживать клетки под бессывороточных условиях дольше 24 часов.

Результаты

Используя этот протокол для трансфекции ТНР-1 макрофагов с миРНК мы обычно достигают трансфекции темпы выше 90% без существенного снижения клеточной жизнеспособности. Рисунок 1 показывает репрезентативные данные, характеризующие состояние клеток 24 ч после трансфекции флуоресцентную метку миРНК против нетрансфицированные контроль, который не лечили Nucleofection реагентов и импульсный или миРНК но получил все изменения питательных сред как трансфектированных образцов. В фиг.1А клеточной морфологии показано соответствии с измерением проточной цитометрии. Микроскопические изображения показаны на рисунке 1b Цифры 1С и 1D представляют низкие цены для апоптоза (контроль: 1,5%; Nucleofection: 5,4%). И некроз (контроль: 2.0%; Nucleofection: 3,2%), определяющее необработанный жизнеспособность клеток. Некроза и апоптоза немного выше, для трансфекции трансфицированные образца, как ТНР-1 макрофагами болеетрудно отделить, чем нетрансфицированных клеток, тем самым вероятности повреждения клеток во время отрыва увеличивается. И, наконец эффективность трансфекции представлена ​​на рисунке 1E. Как весь трансфицировали население сдвигается по сравнению с контролем, это указывает на то, что все клетки трансфицируют что подтверждается флуоресценции микроскопических изображений (фиг.2В). Оба проточной цитометрии данных, а также флуоресценции микроскопических изображений, показывают, что все клетки стабильно трансфицировали однородным распределением миРНК среди клеток, а также в клетках. Это в отличие от многих химических реагентов трансфекции, для сравнения фиг.2А и 2В показывают соответствующие данные проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопических изображений для химического агента трансфекции с использованием подхода, основанного липидов. Эти данные показывают, что две различные популяции клеток, трансфицированных могут быть обнаружены. Первый население похожа на трансфицированных клетках Фоллокрыло Nucleofection. Они характеризуются низкой общей флуоресценции и однородным распределением миРНК в клетках. Второй населения отмечен более интенсивный флуоресценции, которая берет начало от очень ярких внутриклеточных агломератов миРНК. Клеточная морфология остается неизменным для обоих подходов трансфекции, как показано с помощью дифференциальной интерференционной отличие в фиг.2С. Трансфекции с использованием плазмиды ДНК выход эффективно аналогичные результаты, примеры можно найти в Robenek соавт. (2009) ⁹ или Се и соавт. (2006) ^7.

Выбор среду для культивирования клеток после трансфекции имеет большое значение; Поэтому разные среды для культивирования клеток были испытаны в сравнении. Выбранные носители все подходит для выращивания клеток ТНР-1 и были выбраны в соответствии с рекомендациями Lonza как действующим СМИ для пост-Nucleofection выращивания. Рисунок 3 представляет собой mediat миРНКред нокдаун эффективности использования миРНК, направленную против IL10RB (интерлейкин 10 рецепторов цепи β) мРНК. Для всех тестируемых СМИ выражение IL10RB был значительно сокращен до примерно 10 до 20% от контрольного уровня (рисунок 3). Тем не менее трансфицированные клетки отличаться в зависимости от культуральной среде в их потенциал для поляризации. ТНР-1 макрофаги трансфектированные либо неспецифическая миРНК управления или IL10RB-специфических миРНК культивировали в различных средах после трансфекции и обрабатывают IL10. Впоследствии уровни экспрессии IL10-индуцированного гена SOCS3 (супрессор цитокинов сигнализации 3) на уровне мРНК были измерены с помощью RT-количественной ПЦР. Различия между культуральной среде происходят в отношении степени индукции экспрессии SOCS3 мРНК (Рисунок 4), в индукции для каждой из протестированных СМИ мышь T Cell Nucleofector Medium, LGM3, X-VIVO 20 и IMDM были 19,5 [17.7-21.5 ], 11,5 [8.5-15.7], 8,0 [4.6-14.2] и 7.2 [5.6-9.5] раза, соответственно.refore применение мышь T Cell Nucleofector среды имеет жизненно важное значение. Кроме того, различия в эффекта нокдауна IL10RB на экспрессию SOCS3 после обработки IL10 были наблюдаемы, уровни экспрессии мРНК SOCS3 были снижены до 9,5 [8.8-10.3] раза в мышь Т-клеток Nucleofector среде, 2.1 [1.1-4.1] раза в LGM3, 4.8 [3.2-7.2] раз в X-VIVO 20 и 3.3 [2.7-3.9] сложить в IMDM. Эти значения соответствуют сокращениям выражения SOCS3 в различных средах до 49%, 18%, 60% и 45%, соответственно. Сокращение ИЛ-10-индуцированной SOCS3 выражения после трансфекции IL10RB миРНК подтверждает успешное понижающей IL10RB по трансфекции.

Рисунок 1 Характеристика трансфицированных ТНР-1 макрофагами. Характеристика состояния клеток не влияет как показали световой микроскопии и проточной цитометрии анализ нетрансфицированных соуправляете клетки в сравнении с ТНР-1 макрофагов трансфицировали в соответствии с представленной протокола. ТНР-1 макрофаги дифференцируются с 10 нг / мл РМА в течение 48 ч и трансфицировали флуоресцентно меченных (Alexa 488) неспецифическое управления миРНК. 24 ч после трансфекции либо образы живых клеток были взяты (В), или клетки были отделены от Accutase I лечения и анализировали с помощью проточной цитометрии (A). Апоптоза и некроза окрашивание проводили с использованием Аннексин V-фикоэритрин (РЕ) (C) и 7-aminoactinomycin (7-AAD) (D). Эффективность трансфекции (Е) определяли с помощью проточной цитометрии с использованием флуоресцентной метки, прикрепленный к миРНК. Сигнал флуоресценции из трансфицированных клеток (черные) показан против управляющего сигнала (серый). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Фигура 2 Сравнение внутриклеточное распределение миРНК после Nucleofection против липофекцией. THP-1 клетки были дифференцированы в течение 48 часов в соответствии с этим протоколом, и трансфекции либо Nucleofection или липофекцией. Представленные результаты Липофекция были получены с использованием набора Xtremegene миРНК в соответствии с рекомендациями завода-изготовителя с соотношении зарядов реагента к миРНК 4: 1. 24 часа после трансфекции клетки либо отдельно с Accutase I для анализа проточной цитометрии или оценивается под микроскопом с живыми клетками. (А) эффективность и распределение миРНК на клетку Трансфекцию среди населения была определена цитометрическим используя этикетку флуоресценции, прикрепленный к миРНК, управления трансфектированные без миРНК выделены серым цветом, образцы трансфектированные миРНК показаны на черный. (B) люминесцентной микроскопииизображения, показывающие внутриклеточное распределение флуоресцентную метку миРНК (Alexa Fluor 488); Масштабная линейка составляет 40 мкм. (С) дифференциального интерференционного контраста изображения, соответствующие изображению флуоресценции; Масштабная линейка представляет 40 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3 миРНК опосредованного нокдаун IL10RB в трансфектированных THP-1 макрофагов. ТНР-1 макрофаги трансфецировали в соответствии с изложенной протокола. После трансфекции клетки культивируют в четырех различных культуральных сред, а именно Т-клеток мыши Nucleofector среды (А), IMDM (B), LGM3 (С), и Х-VIVO 20 (D), дополненной как описано в разделе протокола. Cлоктей были либо трансфецировали неспецифическая управления миРНК (Ctrl) или IL10RB конкретным миРНК (IL10RB). В качестве дополнительных элементов управления следующие образцы были включены: импульсное управление, то есть. Клетки, которые подверглись трансфекции в отсутствие миРНК (Pulse), и контроля среды, т.е.. клетки, которые получили только изменения культуры СМИ, но остались в противном случае лечить. 24 ч после трансфекции клетки инкубировали в бессывороточной среде с добавлением или без 50 нг / мл IL10 для дальнейшего 24 часов. IL10RB выражение измерялась RT-КПЦР; Диаграммы показывают среднее из трех независимых экспериментов, планки погрешностей представляют стандартное отклонение от среднего; * Р <0,05; ** Р <0,01; *** Р <0,001 по сравнению с Ctrl. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4 IL10-зависимой регулирование SOCS3 после нокдауна IL10RB в трансфицированных ТНР-1 макрофагами. ТНР-1 макрофаги трансфицировали в соответствии с описанным протоколом. После трансфекции клетки культивируют в четырех различных питательных сред мышь Т-клеток Nucleofector среды (А), IMDM (B), LGM3 (С) и Х-VIVO 20 (D), дополненной как описано в разделе протокола. Клетки либо трансфецировали неспецифическая управления миРНК (Ctrl) или IL10RB конкретным миРНК (IL10RB). В качестве дополнительных элементов управления следующие образцы были включены: импульсное управление, то есть клеток, подвергшихся трансфекции в отсутствие siNRA (Pulse), и контроля среды, т.е.. клетки, которые получили только изменения культуры СМИ, но остались в противном случае лечить. 24 ч после трансфекции клетки инкубировали в бессывороточной среде с добавлением или без 50 нг / мл IL10 для дальнейшего 24 часов. SOCS3 Expreделения измерялась RT-КПЦР; Диаграммы показывают среднее из трех независимых экспериментов, планки погрешностей представляют стандартное отклонение от среднего; *, # Р <0,05; **, ## Р <0,01; ***, ### Р <0,001 по сравнению с Ctrl и против Ctrl + IL-10, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

Протокол описано здесь, представляет собой надежную и эффективный способ для трансфекции ТНР-1 макрофаги, которые, как правило, довольно трудно трансфекции. Трансфекция может быть достигнуто с эффективности трансфекции выше 90% в течение миРНК без значительного снижения жизнеспособности клеток. Эффективность для плазмид может быть меньше за счет их размера, но трансфекции КПД около 70% может быть, как правило, достигнутых. Эффективность миРНК опосредованного нокдауна может достигать от 80 до 90% в зависимости от приложенного миРНК. Основным преимуществом этого протокола является то, что он не мешает дифференциации клеток. После трансфекции клетки еще нормально реагировать на дифференциации агента PMA (рис 1А 1Б и рисунок 4) ^12. В капельную сотовой поляризации цитокинов стимулы, такие как LPS или IL10 / IFN, не зависит ^12, хотя это также сильно зависит от среды, выбранной для выращивания после трансфекции аы показано на рисунке 4.

Есть несколько вариантов, в рамках процедуры, которая может быть изменена, чтобы приспособить протокол к конкретным требованиям. Как показано на фиг.4, клетки-разному реагируют на той же IL10 стимула в зависимости от культуральной среде, выбранной после трансфекции. Это показывает, что носитель композиция имеет сильное влияние на клеточном поведения. Поскольку эффект введенного среды могут отличаться для различных экспериментальных стимулов, вполне возможно, что оптимальная среда может измениться и, следовательно, существует необходимость проверить пригодность среды для различных экспериментов независимо. Однако RPMI-1640, который является средней по умолчанию используется для выращивания клеток ТНР-1, оказалась плохо подходит для выращивания после трансфекции как это наблюдалось значительная потеря в клеточной жизнеспособности. Кроме того, протокол также может быть применено к ТНР-1 моноцитов без предварительного РМА-индуцированной дифференциации этогоОчевидно, устраняет необходимость для открепления клеток во время процедуры, но все остальные шаги не должны быть скорректированы. Моноциты ТНР-1 могут быть дифференцированы после этого, если необходимо.

Наиболее важными элементами протокола, во-первых отряд и вторых время, необходимое для трансфекции. Отделение должно быть выполнено как можно более осторожно, чтобы сохранить высокую жизнеспособность клеток. Поэтому мы рекомендуем сравнительно мягкий ферментативную отряд по Accutase I над довольно агрессивные методы, такие как трипсинизации. Дальнейшие отряд методы, такие как лечение лидокаин или выскабливание оказались весьма вредно и не должны использоваться. В случае, 30 мин лечения Accutase я не должен быть достаточным, чтобы снять все клетки правильно это обычно признак неправильно хранится или истек решения Accutase I или слишком много циклов замораживания-оттаивания. Мы получили хорошие результаты, сохраняя небольшие аликвоты Accutase I при -20 °С уменьшить количество циклов замораживания-оттаивания. Однако при недостаточном отряд либо заменить Accutase я с пресной Accutase или увеличить время инкубации до 1 часа. В дополнение нежным разговоров или ополаскивания колбы или пластины могут помочь отряд. Что касается необходимого времени для трансфекции время экспозиции клеток с чистым раствором Nucleofector получил большое влияние на выживаемость клеток и, таким образом, должны быть как можно короче. Лучший способ добиться этого для выполнения каждой трансфекции в то время (этапы 2,10 до 2,15) и не нескольких трансфекций параллельно.

Если нокдаун эффективность низка, это, как правило, не связана с низкой эффективностью трансфекции, но это можно легко проверить с помощью проточной цитометрии или флуоресцентной микроскопии и флуоресцентную метку миРНК или кодирования GFP плазмиды. Небольшая причиной является неэффективная миРНК или ДНК плазмиды. В этих условиях следует учитывать, чтобы увеличить количество миРНК (до 2-3 мкг), либоплазмидной ДНК (до 1-2 мкг), либо использовать другой миРНК или вектор экспрессии, если доступно. Кроме того, удовлетворительные результаты могут быть также достигнуты с помощью пул нескольких различных киРНК, направленных против той же цели. Кроме того, эксперименты курс времени может потребоваться, чтобы точно определить период максимального эффекта, который обычно достигается после того, как от 24 до 72 ч после трансфекции.

Кроме трансфекции методом электропорации есть еще и установленные методы трансфекции клеток млекопитающих. Часто применяемые системы химических агентов трансфекции, которые могут образовывать комплексы с грузовой нуклеиновой кислоты, а затем облегчить транспортировку в клетки. Наиболее часто используемые реагенты либо на основе различных видов липидов или может быть выбран из числа катионных полимеров ^3. Для обоих подходов разнообразный выбор имеется в продаже. Эти трансфекции реагенты имеют преимущество, что они, как правило,простой в использовании, не требует много времени, и работать с прикрепленных клеток, а, тем самым устраняя необходимость отряда. К сожалению, макрофаги довольно трудно для трансфекции с помощью этих методов, поскольку они существенно не пролиферируют в пробирке и обладают защитные механизмы, направленные против внешней цитозольного ДНК ^13-15. Таким образом, химическое трансфекции подход часто приводит к резкому сокращению жизнеспособности клеток. Тем не менее, как показано на рисунке 2, существуют химические агенты трансфекции, которые могут успешно переносить миРНК в макрофаги, а также проточной цитометрии (Фиг.2А) и флуоресцентной микроскопических (2В) анализ показывают, что они не в состоянии достигнуть того же равномерное распределение миРНК в клетках, как получен Nucleofection. В самом деле, данные проточной цитометрии показали, что две различные популяции клеток, трансфицированных происходит, в первую очередь с населением с аналогичным флуоресценции в клетках после Nucleofectiна обнаружении и вторых есть население с более интенсивную флуоресценцию. Определенный подтверждение все еще требуется, но мы предполагаем, что первый население в флуоресцентной микроскопии идентичной с тех клеток, которые показывают равномерное распределение флуоресцентного миРНК в пределах цитозоле а вторая население всего соответствует клеток с очень яркими агломераты. Данные Цитометрический показанные на рисунке 2А предположить, что результаты nucleofection в меньшей миРНК на клетку, чем альтернативный подход липофекции. Однако данные на фиг.3 показывает, что даже сравнительно небольшое количество миРНК включены Nucleofection уже достаточно для 80 до 90% нокдауна гена-мишени. Поэтому дополнительное количество миРНК включены второй населения после химической трансфекции весьма вероятно, профицит и, таким образом, скорее всего, причиной нежелательных побочных эффектов, чем на дальнейшее повышение эффективности нокдаун. Кроме тогоформирование внутриклеточных агломераты уже нежелательно само по себе, так как эти молекулы миРНК, скорее всего не работает или, по крайней мере, менее эффективны, чем свободных молекул миРНК и может привести от целевых эффектов. Кроме истинная природа этих агломератов пока не ясно. Вполне возможно, что эти яркие пятна представляют эндосомы, указывающие, что миРНК был усвоен клеток, но впоследствии освободить от эндосомах не удалось, и миРНК остается в ловушке, и поэтому неэффективны. В качестве альтернативы пятна может быть агломераты, которые образуются внутри клеток. Функциональные оценки химической трансфекции находятся на рассмотрении, поэтому нет окончательных заявлений по бросовой эффективности не могут быть сделаны не менее, до сих пор существование двух различных популяций уже неблагоприятными, так как это означает, что все результаты описывают среднее обеих группах, это, следовательно, не соответствуют либо из популяций. По этой причине Nucleofection является более предпочтительным решением.

Тем не менее есть и ограничения на процедуры трансфекции, описанной здесь. Поскольку клетки должны быть в виде суспензии Nucleofection прилипшие клетки должны быть отделены, который представляет собой дополнительный фактор напряжения к клеткам. Кроме того, вся протокол, а отнимает много времени. Поскольку трансфекции не может быть выполнена одновременно, но должны быть выполнены быстро, чтобы избежать повреждения клеток, количество образцов ограничено до примерно 8 - 10 в эксперименте. Таким образом, этот протокол не подходит для высокой пропускной скрининга проектов. Для применения при высоких пропускной различные системы Nucleofector доступны. Во-первых, существует система 4D-Nucleofector что предлагает формат полосы 16 а. Для еще большего пропускной способности, есть система Shuttle 96 хорошо и 384 также система HT Nucleofector. Однако, поскольку эти новые системы работают с проводящими полимерными электродами вместо алюминия и поэтому электрических условиях, то есть программ и COMPOSсуперпозицию раствора Nucleofector, были изменены соответствующим образом, она должна быть определена, если наш протокол может быть переведен в этих системах.

Тем не менее, несмотря на эти ограничения протокол, представленный здесь действительно поддается надежной и эффективной трансфекции клеток ТНР-1, который превосходит все другие невирусных подходов. Этот протокол позволяет производить исследование последствий выражения измененного гена в ТНР-1 клеток, которые во всех других аспектах дифференцируются и поляризовать нормально и, таким образом, показать, как маленькие побочные эффекты трансфекции, как это возможно.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Accutase I	Sigma-Aldrich	A6964
Аминокислоты, заменимые	PAA	M11-003
Центрифужные пробирки (15 мл)	TPP	TPP91015
Фетальная сыворотка теленка (FCS gold)	PAA	A15-151
Набор для моноцитарных нуклеофлекторов человека	Lonza	VPA-1007	содержит раствор нуклеофектора, кюветы и Пастера пипетки
Сыворотка крови человека из тромба	Lonza	C11-020
Isove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) с 25 мМ HEPES и 25 мМ L-глутамина	Lonza	12-722F
Lymphocyte Growth Medium 3 (LGM3)	Lonza	CC-3211
Мышиный Т-клеточный нуклеофектор Среда	Lonza	VZB-1001
Нуклеофектор 2b	Lonza	AAD-1001
Пенициллин / стрептомицин / L-глутамин (100x)	Sigma-Aldrich	G1146
Форбол 12-миристат 13-ацетат (PMA)	Fisher Scientific	BP685
Мемориальный институт Розуэлл Парк 1640 Medium (RPMI 1640)	PAA	E15-840
миРНК / плазмида
Пируват натрия (100 мМ)	Sigma-Aldrich	S8636
THP-1 моноциты человеческого лейкоза	CLS	300356
колбы для культуры тканей (75 см²; 150 cm²)	Планшеты для	TPP90076/TPP90151
(6-луночные; 12-луночные)	Пробирки TPP	TPP92406/TPP92012
(1,5 мл)	StarLab	S 1615-5500
Вода (без нуклеаз) или подходящий миРНК/плазмидный буфер
X-Vivo 20 с гентамицином	Lonza	BE04-448Q
β-меркаптоэтанол	Сигма-Олдрич	M3148