От быстрого флуоресценции визуализации к молекулярной диффузии Закона о живых клеточных мембран в торговом микроскоп

Carmine Di Rienzo; Enrico Gratton; Fabio Beltram; Francesco Cardarelli

doi:10.3791/51994

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

От быстрого флуоресценции визуализации к молекулярной диффузии Закона о живых клеточных мембран в торговом микроскоп

11.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/51994

⸱

9 октября 2014 г.

Carmine Di Rienzo¹^,² , Enrico Gratton³ , Fabio Beltram¹ , Francesco Cardarelli²

¹NEST Laboratory, Scuola Normale Superiore, ²Center for Nanotechnology Innovation, Instituto Italiano di Tecnologia, ³Laboratory for Fluorescence Dynamics, Department of Biomedical Engineering, University of California, Irvine

В этой статье

Краткое содержание

Пространственное распределение и временная динамика белков и липидов плазматических мембран является актуальной темой в биологии. Здесь эта проблема решается с помощью пространственно-временного анализа флуктуаций изображения, который обеспечивает концептуально те же физические величины отслеживания отдельных частиц, но использует малые молекулярные метки и стандартные микроскопические установки.

Аннотация

Это становится все более очевидным, что пространственное распределение и движение мембранных компонентов, таких как липидов и белков являются ключевыми факторами в регуляции многих клеточных функций. Однако в связи с быстрым динамики и крошечных структур, вовлеченных, очень высокой пространственно-временное разрешение требуется, чтобы поймать реальное поведение молекул. Здесь мы представляем экспериментальный протокол для изучения динамики флуоресцентно меченных плазмы мембраны белков и липидов в живых клетках с высокой пространственно-временной резолюции. Следует отметить, что этот подход не требует, чтобы отслеживать каждую молекулу, но он вычисляет поведение населения, использующего все молекулы в данной области мембраны. Отправной точкой является быстрый визуализация данного региона на мембране. Впоследствии, полный пространственно-временной автокорреляционной функции рассчитывается корреляции полученных изображений на повышение временные задержки, например каждые 2, 3, N повторений. Можно показать, что ширинапика пространственных увеличивается автокорреляционной функции при увеличении времени задержки в зависимости от движения частиц за счет диффузии. Поэтому, фитинг серии функций автокорреляции позволяет извлечь фактический белка средний квадрат смещения от изображения (IMSD), здесь представлены в виде кажущегося коэффициента диффузии против среднего водоизмещения. Это дает количественную вид средних динамики одиночных молекул с нанометровой точностью. При использовании GFP-меченый вариант рецептора трансферрина (СКР) и ATTO488 меченого 1-пальмитоил-2-гидрокси-SN глицеро-3-фосфоэтаноламин (ИСЗ), то можно заметить, пространственно-временной регуляции липидного и белкового диффузии на микронных мембранных регионы в диапазоне времени микро-к-милли-второй.

Введение

Начиная с первоначального "мозаики жидкости" модели Зингера и Николсона, картина сотовой мембране постоянно обновляется в течение последних десятилетий, чтобы включить возрастающую роль цитоскелета и липидных доменов ^1,2.

Первые наблюдения были получены методом флуоресцентной восстановления после фотообесцвечивания (FRAP) открытие, что значительная часть мембранных белков неподвижен ^3-5. Эти пионерские исследования, хотя и очень информативным, пострадали от относительно низкого разрешения в пространстве (микрон) и время (в секундах) FRAP установок. Кроме того, будучи ансамбля измерение усреднения, FRAP не хватает в п....