Методическая статья

Эффективное Перенос генов в Чик сетчатки для первичной культуры клеток исследований: Экс-ово Электропорация подход

7.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52002

⸱

2 ноября 2015 г.

 ,  , 
1Wilmer Eye Institute, The Johns Hopkins University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Эмбриональные цыпленок культуры сетчатки клеток представляют собой ценный инструмент для изучения биологии фоторецепторов. Мы разработали эффективную методику переноса генов на основе экс ово плазмиды электропорации сетчатки, предшествующих культуры. Этот метод значительно повышает эффективность трансфекции по доступных в настоящее время протоколов, что делает генетические манипуляции посильную для этой системы.

Аннотация

Фоторецептора обогащенного культур конус, полученные из эмбриональных куриных сетчатки стали незаменимым инструментом для исследователей во всем мире, изучающих биологию нейронов сетчатки, в частности, фоторецепторов. Приложения этой системы выходят за рамки фундаментальных исследований, так как они легко могут быть приспособлены к высоким технологиям пропускную способность для разработки лекарств. Тем не менее, генетическая манипуляция фоторецепторов сетчатки в этих культурах оказалась очень сложным, что создает важное ограничение полезность системы. Мы недавно разработаны и утверждены бывший ово техники плазмиды электропорации, что увеличивает скорость трансфекции клеток сетчатки в этих культурах в пять раз по сравнению с другими доступных в настоящее время протоколов 1. В этом методе эмбриональных куриных глаза энуклеировали на стадии 27, ПЭС удаляется, и сетчатки чашки помещают в плазмиду раствор, содержащий и электропорации с использованием легко построить нестандартнойиз электродов. Сетчатки затем диссоциируют и культивируют с использованием стандартных процедур. Эта техника может быть применена к избыточной экспрессии исследований, а также подавлением экспрессии гена, например посредством использования плазмиды приводом технологии RNAi, обычно достижении экспрессии трансгена в 25% населения фоторецепторов. Видео формат данной публикации будет сделать эту технологию легко доступны для исследователей в этой области, что позволяет исследование функции гена в первичных сетчатки культур. Мы также включили подробные объяснения важных шагов этой процедуры для успешного исхода и воспроизводимости.

Введение

Диссоциированные клеточные культуры из эмбриональных куриных сетчатки были широко используется для изучения различных аспектов фоторецепторов клеточной биологии, в том числе их выживания 2-9 дифференциации 10-12 роста невритов 13 и более. Преимущества этой системы, разработанные в 1980-х годах Рубен Адлер и сотрудников и совершенствуется его и других групп 14-20, проживают в собственных характеристик кур в качестве животной модели 21. Большой размер куриного глаза, даже при эмбриональных стадиях, обеспечивает большое количество материала для культур. Более того, когда культуры осуществляется с помощью эмбриональных день (ED) 5 - 6 сетчатки, 55 - 80% от их клеток-предшественников дифференцировать, как фоторецепторов 14,15,18,22,23, и примерно с 86% фоторецепторов этого животного конусы 24, эти культуры являются особенно подходящими для исследований, направленных на этом типе клеток.

Мы недавно развитPED и характеризуется простой метод, который позволяет для высокой эффективности плазмиды трансфекции клеток в этих культурах, тем самым расширяя полезности этой системы путем содействия генетическая missexpression исследования 1. Развитие этой методики вытекает из пустоты в научной литературе методов, которые обеспечили бы приемлемый уровень трансфекции, чтобы позволить для изучения функции генов в автономном режиме клеток. Это отчасти потому, что первичные нейронов культуры, как известно, трудно трансфекции 25,26. Некоторые из наиболее часто используемых методов, ранее доступные для этой цели включены химические методы трансфекции, такие как липофекции или опосредованную фосфатом кальция трансфекции, что приводит к повышению эффективности в порядке 3-5% и может оказывать значительное токсичности 27-32. Хотя использование плазмид с ферментативной системой репортер может обойти проблему низкой эффективности трансфекции путем амплификации сигнала, они недискриминацию эффекты соты, и их результаты основаны на небольшом клеточной популяции, которая не может быть представителем в целом. Другим широко используемым методом в куриных, RCAS вирусная инфекция, это применимо только к пролиферирующих клеток и, таким образом, не подходит для этой первичной сетчатки системы культуры 33.

В текущем протоколе эмбриональных куриных глаза энуклеировали на этапе 27 (ED 5), сетчатки пигментного эпителия (РПЭ) удаляется, и сетчатки чашки помещают в электропорации камере, заполненной плазмиды, содержащей раствор и подвергали электропорации с использованием заказ Электроды с последующим сетчатки диссоциации и культуры с использованием стандартных методик. 21 После оптимизации этой процедуры, мы были в состоянии последовательно достичь эффективности трансфекции порядка 22% от общего числа клеток в культуре и 25% в фоторецепторов населения только, без ущерба для выживания и дифференцировки характеристикикультуры 1. Здесь мы предлагаем подробный протокол с изложением все важные этапы этой процедуры для того, чтобы обеспечить успех и воспроизводимость этого метода.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры, описанные в данной работе были выполнены в соответствии с руководящими принципами, рекомендованными уходу и использованию животных комитета в Университете Джонса Хопкинса.

1. Впереди времени: Подготовка приборов, реактивов и блюда

  1. Подготовка яйца: оплодотворенные Выдержите Белый Ливорно куриные яйца на 37,5 ° C и 60% относительной влажности в течение 5 дней в яйце инкубатора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: инкубатор с качалки потенциала может быть полезным для стандартизации и синхронизации эмбрионального развития, но качалки не является строго необходимым для исхода этого протокола.
  2. Плазмиды Приготовление:
    1. Дизайн плазмидной конструкции для генной экспрессией или подавлением (например за счет использования технологии RNAi 1,34) по мере необходимости. Включите ген-репортер (например, EGFP, RFP или LacZ) в конструкции, когда это возможно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые часто используемые промоторы, такие как CMV, могут стать замолчать за разом. CAG-PROMOTэ (курица бета-актина с ЦМВ усилитель) является очень хорошей альтернативой, обеспечивая эффективную долгосрочную экспрессию гена интереса 35-37.
    2. Подготовка раствора плазмиды, в концентрации 1,5 мкг / мкл стерильной PBS в. ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ: Подготовка раствора плазмиды, загодя и не хранить его в замороженном виде до готов к использованию.
      Примечание: более высокие концентрации плазмиды не приведет к значительному повышению эффективности, тогда как использование более низкие концентрации плазмиды снизить эффективность трансфекции 1.
  3. Электроды:
    1. Для использования анодного толстый золотой наконечником электрода (табл конкретных материалов / оборудования). Протирать 70% этанола.
      Примечание: Изоляция золота наконечником электрода, в результате чего примерно 0,5 мм открытой, желательно свести к минимуму утечку электрического тока. Информация для изоляционного материала можно найти в таблице конкретных материалов.
    2. Сделать катод из 2,5 мм квадратный ббык нити, широкий 4,5 мм (обычно используется в микропипетки гребцы). С помощью щипцов, отменить квадрате и выпрямить нить в длинной полосы. Затем, под микроскопом рассечение и с помощью линейки в качестве руководства, согните нить в квадратной 'U' формы длиной 3 мм в основании и высокое 2 мм на одной стороне, с другой стороны остальные длины нити (рис 1 , C - D). Использование щипцов, окуните электрод в 96% этанола и пламени стерилизовать. Затем приложить электрическое свинца с небольшой крокодил в более длинном электроде.
  4. Электропорация палата установки:
    1. Подготовка электропорации камеру резанием крышку стерильного 1,5 мл микроцентрифужных трубки и прикрепление его плоской стороной вниз, на 100 мм чашку Петри с помощью ленты (рис 1E).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Другие контейнер в виде колодца подобного размера будет работать; Однако, крышка микроцентрифуга трубка легко доступны и автоклавируемый. Хорошодолжно быть достаточно для размещения куриных глаз и катодного электрода большой, но не настолько большой, как привести в отходов плазмиды решения.

2. Экс ово процедуры электропорации

  1. Подготовка инструментов:
    1. Стерилизовать микро-рассечение инструментов (2 пары больших изогнутых Молони щипцов для открытия яичную скорлупу и черпая из эмбрионов, 2 пары тонкой наконечником изогнутые Дюмон пинцетом для удаления НПП, одна пара Бонне зубчатые щипцы для снятия хрусталик и стекловидное) путем погружения Советы в 96% этанола и пламенным. Чистый объем рассечение помощью салфетки, смоченной в 70% -ном этаноле. Теплый бутылку стерильной кальция, магния и свободного Хэнка сбалансированном солевом растворе (CMF-HBSS) в водяной бане при 37 ° C. Заполните 100 мм стерильные чашки Петри в 3/4 теплой CMF-HBSS.
    2. Поместите камеру электропорации в соответствии с другой чистой микроскопом рассечение и залейте 120 мкл раствора плазмиды. Подключите электроды к электропорации аппарата, что делаетуверен заказ электрод соединен с отрицательным полюсом и золото наконечником электрода к положительному полюсу.
  2. Эмбрионов:
    1. Очистите яйца, вытирая раковины с салфетками, смоченных в 70% этанола. Поддерживать стерильную процедуру на протяжении остальной части протокола, чтобы избежать проведения загрязнения в культурах. Использование большие изогнутые щипцы Молони осторожно откройте отверстие в яичной скорлупы, аккуратно нажав на закругленным кончиком яйца (по воздушной камеры), а затем захвата и потянув оболочки штук.
    2. С другой пинцет удалить мембраны и собирать эмбриона черпая его из яйца (будьте осторожны, чтобы не повредить зародыш). Поместите его в блюдо с CMF-HBSS.
      Примечание: собрать как можно больше эмбрионов по мере необходимости, чтобы получить желаемое количество чашек сетчатки для электропорации, как указано в 2.4.4
    3. Важным шагом: Этап эмбрионов в соответствии с Гамбургер и Гамильтон 38.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения оптимальных эмбрионов эффективностидолжны быть стадии 27 (фиг.2А).
    4. Эвтаназии эмбрионов от обезглавливания, используя щипцы Молони.
  3. Получение сетчатки Кубки:
    1. Использование тонких Дюмон пинцетом, осторожно выяснять глаза и передать на новое CMF-HBSS блюдо.
    2. Начиная с задней части каждого глаза, недалеко от зрительного нерва, и с помощью двух тонких Дюмон пинцетом, ввести один кончик каждого пинцетом между нервной сетчатки и ПЭС и тщательно анализировать из ПЭС быть осторожным, чтобы не повредить нервные Сетчатка (фиг.2В).
      ПРИМЕЧАНИЕ: отсутствие Ca 2+ и Mg 2+ в растворе поможет ПЭС отсоединить от нервного сетчатки более легко.
  4. Электропорация:
    1. Настройте параметры электропоратора, чтобы доставить 5 квадратных импульсов 15 Вольт, 50 мсек, и 950 мс интервала. Место «U» в форме отрицательного электрода внутри камеры электропорации (микроцентрифужную крышки заливкиред 120 мкл плазмиды, содержащей раствора).
    2. Использование изогнутые Дюмон пинцетом передачи одного сетчатки чашку электропорации камере (по черпая, не нажимая), и поместите его в формы электрода 'U', с задней части сетчатки к нижней части электрода и объективом вверх ( Рисунок 2D).
    3. Поместите анод, так что это касается передней части глаза, рядом с объективом, и с помощью ножной педали электропоратора в доставить электрические импульсы.
    4. Передача электропорации сетчатки чашку к новому чашку Петри с CMF-HBSS и повторить процедуру электропорации каждой из остальных сетчатки чашки.
      Примечание: до 6 чашек сетчатки может быть электропорации с той же плазмиды раствора без значительного уменьшения эффективности трансфекции.
    5. Снимите объектив и стекловидного тела каждого электропорации сетчатки чашки, захватывая их с Бонн зубчатых щипцов и аккуратно потянув через тон ученику открытие удерживая глаз в месте с задней изогнутых Дюмон пинцетом.
    6. Приступить к диссоциации и культуры электропорации клеток сетчатки следующих стандартных процедур.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для более детального протокола о диссоциации и культуры куриных клеток сетчатки относятся к Вергара и Canto-Soler 2012, дополнительный файл 4 21 В этом протоколе клетки высевают при низкой плотности на полиорнитин покрытием 6-луночных планшетах или 35. -MM блюда (6 х 10 5 клеток / 35 мм диаметр ну или блюдо). Среда, используемая среднего 199 пенициллином / глутамина, 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS), и линолевая кислота-BSA в 100 мкг / мл. Культуры поддерживают в увлажненном 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2. С помощью этой процедуры 5 - 6 х 10 6 клеток, как правило, могут быть получены в каждой стадии 27 электропорации глаз.
      Примечание: В идеале, не более 3 ч должно проходить между получения эмбрионов и клеток покрытием, чтобы обеспечить хорошую выживаемость клетоки свести к минимуму стресс. Типичный времени для наблюдения и дальнейшего анализа после 4 дней в культуре, так как в этой точке клетки добились хорошего морфологического и молекулярно-дифференциацию и выживание по-прежнему высок.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Здесь мы представляем простой протокол для плазмиды трансфекции энуклеированные куриных сетчатки чашки для последующего диссоциированного культуре клеток. Трансфекция достигается с помощью легко сделать пользовательские электродов (Рисунки 1 - 2) путем электропорации. Параметры, описанные в этом протоколе были оптимизированы для получения эффективности трансфекции, которые варьируются от 20 до 27% (в среднем 22%) (рис 3D). Обратите внимание, что, по причинам, указанным выше, эти результ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Наиболее важным шагом для успеха этого протокола выбрав соответствующий этап эмбрионов. В предыдущих публикациях, ряд эмбриональных стадиях дается для этих культур, как правило, определяется дней инкубации или эмбриональных дней (ED); Таким образом, он, как правило, предполагается, что с помощью ЭД 5 ЭД 6 эмбрионов даст эквивалентные результаты. Однако мы обнаружили, что на этапе 27 (ED 5), эффективность трансфекции будет около 22% от общего количества клеток, как указано выше; пока эффективность снизится до 16% при исп...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов или других конфликтов интересов.

Благодарности

Мы хотели бы выразить признательность Дэвиду О'Брайену за его поддержку в анализе данных, а также всем членам лаборатории Canto-Soler за их критические дискуссии. Эта работа была поддержана грантами NIH EY004859 and EY022631 (MVCS), основным грантом EY1765 и неограниченным грантом департамента от Research to Prevent Blindness, Inc.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ECM 830 Электроквадратный пораторBTX / Гарвардский аппарат45-0052
Genetrode, L-образный, 5 мм с золотым наконечникомBTX / Гарвардский аппарат45-0115 модель 512Электрод с золотым наконечником используется в качестве анода
Полиимидная трубкаVention Medicalизготовлен на заказВнутренний диаметр: 0,5 мм / толщина стенки: 0,15 - 0,2 мм. Используется для изоляции электрода
с золотым наконечникомКвадратная коробчатая нить 2,5 мм, ширина 4,5 ммSutter Instrument CompanyFB245BИспользуется для изготовления катодного электрода
HBSS, без кальция, без магния, без фенола красныйGibco - Life Technologies14175-095
Moloney щипцыRobozRS-8254Зубчатый; небольшой изгиб; Длина
пинцета Dumont 4,5 дюйма 5/45RobozRS-5058шаблон #5, угол 45 градусов; размер наконечника 0,10 x 0,06 мм; длина 109 мм
микрощипцы Bonn, 1x2 зубца ПлатформаRobozRS-5172; 1x2 зуба, зубья 0,12 мм; длина 3,75 дюйма; ширина наконечника 0,3 мм
для связывания

Ссылки

  1. Vergara, M. N., Gutierrez, C., O'Brien, D. R., Canto-Soler, M. V. Ex vivo electroporation of retinal cells: a novel, high efficiency method for functional studies in primary retinal cultures. Exp Eye Res. 109, 40-50 (2013).
  2. Chalmel, F., et al. Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential. BMC Mol Biol. 8, 74(2007).
  3. Goureau, O., Regnier-Ricard, F., Desire, L., Courtois, Y. Role of nitric oxide in photoreceptor survival in embryonic chick retinal cell culture. J Neurosci Res. 55 (4), 423-431 (1999).
  4. Hewitt, A. T., Lindsey, J. D., Carbott, D., Adler, R. Photoreceptor survival-promoting activity in interphotoreceptor matrix preparations: characterization and partial purification. Exp Eye Res. 50 (1), 79-88 (1990).
  5. Leveillard, T., et al. Identification and characterization of rod-derived cone viability factor. Nat Genet. 36, 755-759 (2004).
  6. Lorentz, O., Sahel, J., Mohand-Said, S., Leveillard, T. Cone survival: identification of RdCVF. Adv Exp Med Biol. 572, 315-319 (2006).
  7. Nakamura, M., Singh, D. P., Kubo, E., Chylack Jr, L. T., Shinohara, T. LEDGF: survival of embryonic chick retinal photoreceptor cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (5), 1168-1175 (2000).
  8. Paes-de-Carvalho, R., Maia, G. A., Ferreira, J. M. Adenosine regulates the survival of avian retinal neurons and photoreceptors in culture. Neurochem Res. 28 (10), 1583-1590 (2003).
  9. Stenkamp, D. L., Gregory, J. K., Adler, R. Retinoid effects in purified cultures of chick embryo retina neurons and photoreceptors. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (8), 2425-2436 (1993).
  10. Fuhrmann, S., Kirsch, M., Hofmann, H. D. Ciliary neurotrophic factor promotes chick photoreceptor development in vitro. Development. 121 (8), 2695-2706 (1995).
  11. Toy, J., Norton, J. S., Jibodh, S. R., Adler, R. Effects of homeobox genes on the differentiation of photoreceptor and nonphotoreceptor neurons. Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (11), 3522-3529 (2002).
  12. Yan, R. T., He, L., Wang, S. Z. Pro-photoreceptor activity of chick neurogenin1. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (12), 5567-5576 (2009).
  13. Adler, R. Regulation of neurite growth in purified retina neuronal cultures: Effects of PNPF, a substratum-bound, neurite-promoting factor. J Neurosci Res. 8 (2-3), 165-177 (1982).
  14. Adler, R. A model of retinal cell differentiation in the chick embryo. Prog Retin Eye Res. 19 (5), 529-557 (2000).
  15. Adler, R., Hatlee, M. Plasticity and differentiation of embryonic retinal cells after terminal mitosis. Science. 243 (4889), 391-393 (1989).
  16. Adler, R., Lindsey, J. D., Elsner, C. L. Expression of cone-like properties by chick embryo neural retina cells in glial-free monolayer cultures. J Cell Biol. 99 (3), 1173-1178 (1984).
  17. Adler, R., Magistretti, P. J., Hyndman, A. G., Shoemaker, W. J. Purification and cytochemical identification of neuronal and non-neuronal cells in chick embryo retina cultures. Dev Neurosci. 5 (1), 27-39 (1982).
  18. Belecky-Adams, T., Cook, B., Adler, R. Correlations between terminal mitosis and differentiated fate of retinal precursor cells in vivo and in vitro: analysis with the 'window-labeling' technique. Dev Biol. 178 (2), 304-315 (1996).
  19. Hyndman, A. G., Adler, R. Neural retina development in vitro. Effects of tissue extracts on cell survival and neuritic development in purified neuronal cultures. Dev Neurosci. 5 (1), 40-53 (1982).
  20. Politi, L. E., Adler, R. Generation of enriched populations of cultured photoreceptor cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 27 (5), 656-665 (1986).
  21. Vergara, M. N., Canto-Soler, M. V. Rediscovering the chick embryo as a model to study retinal development. Neural Dev. 7, 22(2012).
  22. Adler, R. Determination of cellular types in the retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (5), 1677-1682 (1993).
  23. Repka, A., Adler, R. Differentiation of retinal precursor cells born in vitro. Dev Biol. 153 (2), 242-249 (1992).
  24. Morris, V. B. Symmetry in a receptor mosaic demonstrated in the chick from the frequencies, spacing and arrangement of the types of retinal receptor. J Comp Neurol. 140 (3), 359-398 (1970).
  25. Li, H., Chan, S. T. H., Tang, F. Transfection of rat brain cells by electroporation. J Neurosci Methods. 75 (1), 29-32 (1997).
  26. Martinez, C. Y., Hollenbeck, P. J. Transfection of primary central and peripheral nervous system neurons by electroporation. Methods Cell Biol. 71, 339-351 (2003).
  27. Boatright, J. H., et al. The 5' flanking regions of IRBP and arrestin have promoter activity in primary embryonic chicken retina cell cultures. Exp Eye Res. 64 (2), 269-277 (1997).
  28. Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture. Curr Protoc Neurosci. Chapter 3, Unit 3.11(2001).
  29. Kumar, R., et al. The bZIP transcription factor Nrl stimulates rhodopsin promoter activity in primary retinal cell cultures. J Biol Chem. 271 (47), 29612-29618 (1996).
  30. Toy, J., Bradford, R. L., Adler, R. Lipid-mediated gene transfection into chick embryo retinal cells in ovo and in vitro. J Neurosci Methods. 104 (1), 1-8 (2000).
  31. Werner, M., Madreperla, S., Lieberman, P., Adler, R. Expression of transfected genes by differentiated, postmitotic neurons and photoreceptors in primary cell cultures. J Neurosci Res. 25 (1), 50-57 (1990).
  32. Yuan, L., Kawada, M., Havlioglu, N., Tang, H., Wu, J. Y. Mutations in PRPF31 inhibit pre-mRNA splicing of rhodopsin gene and cause apoptosis of retinal cells. J Neurosci. 25 (3), 748-757 (2005).
  33. Hughes, S. H. The RCAS vector system. Folia Biol (Praha). 50 (3-4), 107-119 (2004).
  34. Das, R. M., et al. A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon. Dev Biol. 294 (2), 554-563 (2006).
  35. Nguyen, A. T., Dow, A. C., Kupiec-Weglinski, J., Busuttil, R. W., Lipshutz, G. S. Evaluation of gene promoters for liver expression by hydrodynamic gene transfer. J Surg Res. 148 (1), 60-66 (2008).
  36. Xu, L., et al. CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice. Hum Gene Ther. 12 (5), 563-573 (2001).
  37. You, L. M., et al. A hybrid promoter-containing vector for direct cloning and enhanced expression of PCR-amplified ORFs in mammalian cells. Mol Biol Rep. 37 (6), 2757-2765 (2009).
  38. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Dev Dyn. 195 (4), 231-272 (1992).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

27

Похожие статьи