Методическая статья

Выращивание клетках млекопитающих с использованием одноразовых Пневматический биореактора системы

26.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52008

⸱

10 октября 2014 г.

 ,  ,  ,  , 
1Center for Biotechnology Education, Johns Hopkins University, 2PBS Biotech, Inc.

В этой статье

Краткое содержание

Используя пневматический биореактор, мы демонстрируем сборку, работу и производительность этой одноразовой биореакторной системы для выращивания клеток млекопитающих.

Аннотация

Последние достижения в области культивирования и масштабирования млекопитающих, насекомых и стволовых клеток создали огромные возможности для новых методов лечения и инноваций в персонализированной медицине. Тем не менее, для преобразования этих достижений в терапевтические приложения потребуются системы in vitro, которые позволят создать надежные, гибкие и экономически эффективные биореакторные системы. В настоящее время существует несколько биореакторных систем, используемых в исследовательских и коммерческих целях; Тем не менее, многие из этих систем не являются оптимальными для создания, расширения и мониторинга роста различных типов клеток. Наиболее сложными для контроля в этих системах параметрами культивирования являются минимизация гидродинамического сдвига, предотвращение образования градиента питательных веществ, обеспечение равномерной аэрации питательной среды, предотвращение микробного загрязнения, а также мониторинг и корректировка условий культивирования в режиме реального времени. Используя пневматическую систему одноразового биореактора, мы демонстрируем сборку и работу этого нового биореактора для клеток млекопитающих, выращенных на микроносителях. Эта биореакторная система устраняет многие проблемы, связанные с существующими в настоящее время системами, сводя к минимуму гидродинамический сдвиг и образование градиента питательных веществ, а также обеспечивая равномерную аэрацию питательной среды. Кроме того, программное обеспечение биореактора позволяет осуществлять дистанционный мониторинг в режиме реального времени и корректировать параметры работы биореактора. Эта биореакторная система также обладает огромным потенциалом для масштабирования адгезивных и суспензионных клеток млекопитающих для производства различных терапевтических белков, моноклональных антител, стволовых клеток, биоаналогов и вакцин.

Введение

Клетки млекопитающих линии могут быть отнесены к одной из трех категорий в зависимости от их характеристик роста: клетки, которые растут в суспензии, клеток, которые растут в виде агрегатов, а клетки, которые растут на якорь на подложку. Хотя воздух колеса биореактор показано в этом видео может расти все три типа клеток, это видео будет продемонстрировать использование биореактора для выращивания фиксационно-зависимых клеток на микро-носителей. Анкоридж зависимые клетки млекопитающих могут быть выращены с целью производить больше клеток - когда сами клетки являются продуктом. Например, костного мозга человека мезенхимальных стволовых клеток в настоящее время культивируют с целью сбора клеток и их инжекции в пораженной ткани. Пневматическая биореактор показано в этом видео доказала подходит для производства таких мезенхимальных стволовых клеток для этого приложения (Серра и соавт., Частное сообщение, 2013).

Анкоридж DEPendent клетки млекопитающих обычно выращиваются небольшой масштаб в 2D сосудов для культивирования таких как культуры клеток пластин, культуры клеток колбах или роллер-флаконах, где они придерживаются специально обработанной поверхности роста 1. При более ячеек желательно, пластины или колбы могут быть расширены с помощью более или большие суда. Тем не менее, для более экономичного выращивания больших количеств крепления зависимых клеток, увеличивая площадь поверхности для крепления сотового может быть достигнуто с помощью небольших твердых бусин называемые микро-носители. В зависимости от характеристик прикрепления клетки, несколько различных типов микро-носителей являются коммерчески доступными, например, декстран, пептид, или коллаген покрытием. Микро-носители имеют большую площадь поверхности к объему, обеспечивающей большую площадь поверхности для роста клеток; и микро-носители могут быть сохранены в виде суспензии при перемешивании, что позволяет клеткам культивироваться до высоких плотностей в биореакторе систем 2. В настоящее время, виды bioreactors где прикрепленные клетки, выращенные на микро-носителей включают вращающихся колбах и перемешивают нефтехранилище, которые используют осевые рабочие колеса для поддержания суспензии клеток покрытием микро-носителей.

Несколько факторы важны для успешного выращивания клеток, включая напряжения кислорода, напряжение сдвига, поверхности матрицы, и питательных веществ и метаболитов концентрациях. Использование биореакторов позволяет контролировать в режиме реального времени в условиях роста и потенциал для значительного снижения производственных затрат 1. Есть несколько проектов общей биореактор для выращивания в пробирке клеток в том числе, перемешивают суспензию, вращающейся стенки сосуда, полого волокна, мешок биореакторе на рокера платформы, и системах с кипящим слоем 3. Многие из этих систем представляют уникальные проблемы для выращивания клеток и масштабировать посуды, такие как высокая стоимость, питательных градиентов концентрации, гидродинамического сдвига, агрегации клеток, а также трудности в отборе проб, мониторинга и контрольного сотовыхл масштаб деятельности.

Различные клеточные линии, прилипшие используются в производстве вирусов, либо в производстве вирусных вакцин или для производства вирусных векторов для применения генной терапии. В этом видео, используя одноразовый пневматические (Air-колеса) биореактор системы, мы демонстрируем культуру клеток человека карциномы легкого (А549) клеток на микро-носителей для производства в онколитических аденовируса. Пневматическая конструкции биореактора использует вертикальное колесо перемешивания, что питается от плавучести газа разбрызгивают в нижней части биореактора. Это щадящий метод перемешивание ограничивает гидродинамические силы сдвига, но все еще ​​обеспечивает оптимальной средой и клетки смешивания 4. По сравнению с реактор с мешалкой, пневматический реактор имеет низкую напряжения сдвига стены даже с большими объемами систем воздушного колеса биореактора (рисунок 1). В отличие от перемешивают биореакторах цистерн, вертикальное колесо этого одноразового использования реактора включен потоком пузырьков газа внутриСудно, которое позволяет нежный и равномерного перемешивания среды (рисунок 2).

Протокол

1 Войти

  1. Мощность до биореактора. Щелкните в любом месте, чтобы открыть страницу входа в систему. Выберите имя пользователя и введите пароль и нажмите кнопку "Войти".

2 Калибровка

  1. Калибровка датчика рН (2 точки перед автоклавированием).
  2. Проверьте датчик рН и подтвердить наконечник датчика заполнена раствором электролита. Приготовьте два стаканы с калибровки рН растворов (электролитов) рН 4 и рН 7 и иметь в своем распоряжении бутыль дистиллированной водой.
  3. Подключите кабель рН к датчику рН. Перейдите на вкладку "Действия" на интерфейсе Hello и нажмите "калибровки". Введите температуру буфера в области Temp калибровочного раствора.
  4. Поместите датчик рН в буфере 1 (рН 4) и введите значение в поле «нулевой». Подождите графике, чтобы стабилизировать и нажмите кнопку "калибровки 1". Промыть датчик рН дистиллированной водой.
  5. Датчик Место в буфере 2 (рН 7). Введите буфер2 Значение в поле "Диапазон". Подождите графа для стабилизации и нажмите калибровки 2 кнопки.
  6. Нажмите "Сохранить", а затем нажмите кнопку "Закрыть".
  7. Калибровка растворенного кислорода (DO) датчик.
  8. Убедитесь, что датчик DO была поляризована, будучи подключены к системе в течение нескольких часов. Перейдите на вкладку "Действия" на интерфейсе Hello и нажмите калибровки. Нажмите кнопку "Выполнить".
  9. Отключите датчик DO и введите 0 в поле «нулевой». Подождите графике, чтобы стабилизировать и нажмите кнопку "Калибровка 1".
  10. Снова подключите датчик DO и введите 100 в поле "Диапазон". Подождите графике, чтобы стабилизировать и нажмите кнопку "Калибровка 2".
  11. Нажмите "Сохранить", а затем нажмите кнопку "Закрыть".

3 автоклав и установить датчики и реагентов Суда

  1. После калибровки, место датчиков и тепловой ямы в AUTOCLave сумки и автоклав в течение 30 мин при 121 ° С, 15 фунтов на кв.
  2. Sanitize автоклаве мешочки с 70% изопропилового спирта (IPA) и передачи мешочках до биологической безопасности кабинета (BSC). Снимите внешнюю упаковку судна.
  3. Sanitize внутреннюю упаковку с 70% IPA и передать судно в бокс биологической безопасности (BSC). Снять внутренний упаковку и осмотреть судно и трубки за ущерб, причиненный во время транспортировки.
  4. Установите рН и DO датчики в двух передних портов. Установите тепловой колодец на левой задней порта. Откройте крышку датчика.
  5. Руководство датчик через порт датчика. Автор датчик плотно в порт.
  6. Трансфер судно из BSC.
  7. Повесьте DO и датчиков рН кабелей вне сосуда рукава и убедитесь, что нет ничего в рукаве. Авто судно в рукав, ногами вперед.
  8. Осторожно установите датчик температуры в сосуд тепловой скважины. Убедитесь, что в нижней части судна упирается нагревателей.
  9. Удалитьтрубка устанавливает из сумок. Матч цветовое кодирование на трубки к соответствующим разъемам и насосов на блоке управления биореактор.
  10. Установите основной газовой магистрали, нажав разъем в его выходе газа. Установите микро газовую линию, крутя разъем по часовой стрелке в выходе газа. Установите трубки выходного фильтра:
  11. Откройте фильтр духовку. Закрепите фильтр выходящего воздуха на U-канала таким образом, его трубка проходит через двух крючков до фильтра и из духовки.
  12. Установите трубку на конденсаторе мешок в держателе труб. Закрой дверь.
  13. Маршрут присоединения линии A и B, оба СМИ линии, и урожай линия позади датчика DO и на скамью рядом с блоком управления биореактор.
  14. Подключите кабели к DO и рН датчиков.

4. Добавление Средние и Micro-носители

  1. Перейдите на вкладку "Действия" и нажмите "Управление Насосы" на компьютерный интерфейс.
  2. Сформируйте STERIле связь между неиспользованный среднего сложения линии (1 оранжевая полоса) и среднесрочной источника бутылка / мешок сваркой трубки или с помощью Luer заглушки.
  3. Нажмите ползунок для включения медиа насоса на. Нажмите ползунок для включения СМИ насос выключен после сложения желании количества среды.
  4. Поместите микроносителю бусины в Ca 2 +, Mg 2 + бесплатный PBS в течение 3 часов при комнатной температуре.
  5. Вымойте бисером несколько раз с Са 2 +, Mg 2 + бесплатно PBS.
  6. Автоклав течение 15 мин при 115 ° С, 15 фунтов на квадратный дюйм.
    Примечание: Добавить 3 г / л (сухого веса) в этом эксперименте.
  7. Насос в микро-носителей, которые были увлажненной, промывают и обрабатывали в автоклаве в реактор таким же образом, была добавлена ​​среда на стадии 4.1.

5 Уравновешивание и по одной точке проводить калибровку

  1. Установите контроллеры на Auto и введите требуемые уставки. Здесь, использовать агитации уставки (SP) = 15 оборотов в минуту, температура SP = 37,0 ° C, рН = 7,2, DO = 100%. Дождитесь рarameters уравновешиваться.
  2. Подтвердите датчик полностью поляризован. Подтвердите DO текущую стоимость стабилизировалась.
  3. Перейдите на вкладку "Действия" и нажмите "калибровки". Нажмите кнопку "Выполнить", нажмите "One-точка".
  4. Введите '100' в поле "Диапазон". Нажмите кнопку "Калибровка 1", нажмите кнопку "Сохранить" и нажмите кнопку "Закрыть":

6 Запуск Выполнить

  1. Перейдите на вкладку Действия. Нажмите "Batch". Используйте экранную клавиатуру или внешнюю клавиатуру для ввода имя пакета 16 символов или менее.
  2. Нажмите кнопку "Скрыть" клавиатуры на экране. Нажмите кнопку "Пуск партию" подтвердить, нажав "Пуск" в наложении.

7 Привить с ячейками

  1. Форма стерильный соединение между неиспользованные среднего дополнение линии (1 оранжевой полосы) и бутылки клеток / источник сумку сваркитрубки или с помощью фитингов Luer.
  2. Установите раздел силикона трубки в СМИ насоса так стрелка в сторону трубки между насосом и судна.
  3. Проверьте зажим трубки открыт и его разветвленной зажим трубки закрыт. Нажмите ползунок для включения медиа-насос и нажмите "Off" после добавления клеток.
  4. Перейдите на вкладку "Действия" и нажмите "Насосы Control".

8 Отбор проб

  1. После прививки и так часто, как желательно, чтобы следить за культуру, сделать выборку из культуры в следующем порядке:
  2. Перейдите на вкладку "Действия" и нажмите "принять образец". Поместите трубки отбора проб в насосе для отбора проб и манипулировать кран отбора проб в соответствии с инструкциями на экране.
  3. Выполните по крайней мере ежедневный микроскопический наблюдение и подсчет клеток на этих образцах.
  4. Когда клетки достигли желаемой плотности, в этом сASE 1,2 × 10 6 клеток / мл, инфицировать клетки с добавлением вируса посевного материала.
  5. В асептических условиях добавить инокулята в 20 мл шприц, и соединить шприц с одним из запасных присоединения портов реактора. Введем инокулята в реактор при нажатии на поршень шприца.
  6. Продолжить выборки и анализа культуру для аденовируса концентрации внутриклеточного частиц.

Результаты

На рисунке 3, параметры для инициирования биореактора перспективе показаны. Эта цифра показывает экран до настройка параметров температуры, растворенного кислорода, рН и агитации. После того, как параметры заданы, параметры Run постоянно контролируются и поправки могут быть сделаны, чтобы поддерживать необходимые условия. Программное обеспечение производит непрерывное считывание, что позволяет легко идентифицировать проблемы. В этом эксперименте с использованием 2,5 л DMEM, содержащей 10% FBS, 250 частей на миллион SAFC антипенные С, 2 мМ L-глутамина и 3 г / л микро-носителей, система стабилизировалась, так что процентов кислорода составляет 50%, температура 37 ° С и рН 7,2. Реактор засевают клетками А549 в концентрации 7 × 10 4 клеток / мл (или 10 клеток / микро-носителей). Выбранные для этой перспективе параметры привело большинства клеток, прилипших к микро-носителей в пределах 2 ч (рисунок 4). После 12 ч клетки демоныtrating признаки выравнивания и распространения на поверхности микро-носителя (Рисунок 5). По 24 часов, микро-носители имеют относительно равномерное распределение клеток, без микро-носителей без клеток и без крупных комков клеток на микро-носителей (Рисунок 6). Процент колонизации микро-носителя на клетках А549 на 75% на 24 ч и после этого 90% (фиг.7). Клетки продолжали расти в геометрической прогрессии в ~ 1000000 клеток / мл через 48 часов (рисунок 8). После заражения дозе онколитических аденовируса (2 х 10 8 вирионов / мл) при 50 ч, плотность увеличивается до 1,2 млн клеток / мл, а затем начал снижаться, как литическую инфекция прогрессировала. Был ~ 10000 раз амплификации вирусного посевного материала.

В предыдущих экспериментах мы обнаружили, что мониторинг и регулировать поток газа имеет решающее значение для максимизации роста клеток (неопубликованные данные). Быстро растущие клетки могут привести к истощению системы кислорода с уровень DO падает до нуля. В то время как клетки продолжали расти, это было в гораздо более медленными темпами. Это имеет решающее значение для мониторинга и регулировать поток кислорода для удовлетворения клеток требования во время логарифмической фазы роста. Каждый прогон могут быть проанализированы для оптимального роста путем сравнения рН, DO, и температуру со счетчиками ежедневных клеток.

figure-results-1
Рисунок 1 гидродинамика биореактора Пневматическая система (PBS) по сравнению с резервуарным биореакторе с мешалкой измерения стены поперечных сил при различных объемах реакторов.

figure-results-2
Рисунок 2 Пневматика-колеса реактор колесо.

52008 / 52008fig3highres.jpg "/>
Рис.3 Пневматика колеса программного снимок экрана параметров для запуска биореактора пробег.

figure-results-3
Рисунок 4 Micro-носитель колонизация А549 2 ч после прививки. (Средний диаметр микро-носитель ~ 180 мкм.) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-4
Рисунок 5 12 ч после начала культивировани А549 клетки есть, сплющивание и распространения на микро-носителей.5highres.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-5
Рисунок 6. Микро-носители, покрытые клетками после 24 часов в культуре. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-6
Рисунок 7 Процент колонизации микро-носителей на А549 после инокуляции.

figure-results-7
Рисунок 8 жизнеспособных клеток А549 в культуральной предварительно сообщение инфекция число и с adenovirнам. Обратите внимание, что вирусная шаг заражение произошло при 50 час.

Обсуждение

Это одноразовая система биореактора является относительно простым в использовании и позволяет в реальном времени аналитики для мониторинга и анализа реактора. Это очень хорошо подходит для млекопитающих и насекомых клеточной культуры с плотностью клеток, достигающих более 30 миллионов клеток / мл. Кроме того А549 описано в настоящем докладе 11, мы выросли SF-9 клеток насекомых в биореакторе, а также. Бережное смешивание обеспечивается пневматическим воздуха колеса уменьшает повреждения клеток. Несколько шагов имеют решающее значение при настройке этого реактора. Во-первых, собственно калибровки рН и DO датчики важно для оптимального мониторинга культуры и добавлением реагентов для доведения рН или кислорода в системе. Во-вторых, реагента и семенные бутылки должны быть заполнены и вложения Luer сделано в стерильной среде, такой как BSC. После того, как бутылки с реагентами перемещаются из стерильной среде, соединения с линиями подачи биореактора должно быть сделано с осторожностью, чтобы избежать микробного загрязнения.

Хотя это биореактор система хорошо работает для млекопитающих и насекомых клеточных линий, не предназначенных для бактериальных культур. Система не может обеспечить быстрое перемешивание и кислородом, который необходим для бактериальных клеток. Рост бактерий лучше всего достигается в биореакторе мешалкой. По сравнению с другими биореакторах одноразового использования для млекопитающих или насекомых культуре клеток, эта система проста в использовании, обеспечивает достаточные данные для анализа трасс, и имеет сходную или лучшую рост клеток, чем другой одноразового использования системы мы оценивали.

Одноразовый Пневматическая система биореактор имеет потенциал для удовлетворения многих исследований и клинического применения в областях биотерапевтических, вакцин, стволовые клетки, и персонализированной медицины 4. Кроме того, гибкость этой системы позволяет единовременной загрузке, при периодическом, перфузии, и трансфекции на основе биореактора приложений 5. Наконец, одноразовые одноразовые биореакторные системы имеют POTENтомобиля удовлетворения потребностей крупномасштабного промышленного производства и придерживаться принципов и рекомендаций национальных и международных регулирующих органов 6-10.

Раскрытие информации

Авторы Д. Жиру и Y. Hashimura являются сотрудниками ФСБ Biotech, которая производит реагенты и инструменты, используемые в этой статье.

Благодарности

Этот проект был частично поддержан Университетом Джона Хопкинса, офисом проректора через Gateway Science Initiative.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ПБС 3 PBS
Одноразовая сборкаPBS
Клетки карциномы легких человека (A549)ATCCCCL-185
DMEM Среда с высоким содержанием глюкозы Фетальная
сыворотка крупного рогатого скота трипсин
ЭДТА, 0,25%
Цитодекс 1 МикроносителиGE3781
Пеногаситель CSigmaA8011

Ссылки

  1. Freshney, R. I. Culture of Animal Cells A Manual of Basic Techniques and Specialized Applications. , 6th edition, John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. (2010).
  2. Healthcare, G. E. Microcarrier Cell Culture Principles and Methods. GE Healthcare Data File 18-1140-62. , (2005).
  3. Simaria, A. S., et al. Allogeneic cell therapy bioprocess economics and optimization Single-Use cell expansion Technologies. Biotechnol and Bioeng. 111 (1), 69-83 (2014).
  4. Lee, B., Fang, D., Croughan, M., Carrondo, M., Paik, S. -H. Characterization of novel pneumatic mixing for single-use bioreactor application. BMC Proc. 5 (S8), O12(2011).
  5. Eibl, R., Eibl, D. Disposable bioreactors in cell culture-based upstream processing. BioProcess Int. 7 (S1), 18-23 (2009).
  6. Chaubard, J. F., et al. Disposable bioreactors for viral vaccine production challenges and opportunities. Biopharm Int Supp. , (2010).
  7. Croughan, M. S., Hamel, J. F., Wang, D. I. C. Hydrodynamic Effects on Animal Cells Grown in Microcarrier Cultures. Biotechnol and Bioeng. 95 (2), 295-305 (2006).
  8. DePalma, A. Single-use Equipment on Cusp of Industrialization. Genet Eng Biotechnol News. 32 (1), (2012).
  9. Baltz, R. H., Demain, A. L., Davies, J. E. Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. , 3rd ed, ASM Press. Washington, DC. (2010).
  10. Applied Technical Bioreactors, , Seminole (FL), USA. http://www.infors-ht.com/index.php/en/products/bioreactors/bench-top-bioreactors/minifors (2012).
  11. Sousa, M. F., Giroux, D., Clemente, J., Lee, B., Carrondo, M. J., Alves, P. M. Impact of Bioreactor Design on the Performance of Microcarrier Cultures. , 3rd ed, Abstract. Cell Culture Engineering XIII. Scottsdale, Arizona. (2012).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

pH

Похожие статьи