Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Ретровирусная Заражение мышиной эмбриональных стволовых клеток клетки, полученные из эмбриональных орган для анализа кроветворной дифференциации

8.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52022

⸱

20 октября 2014 г.

 ,  ,  , 
1Harper Cancer Research Institute, 2Microbiology and Immunology, Indiana University School of Medicine, 3Department of Biological Sciences, University of Notre Dame

В этой статье

Краткое содержание

Манипулирование временной экспрессией генов в дифференцируемых эмбриональных стволовых клетках (ЭСК) может быть достигнуто с помощью индуцируемых систем генов. Однако создание этих клеточных линий является дорогостоящим и трудоемким процессом. Этот протокол обеспечивает быструю экспрессию трансгена в дифференцированных клетках, полученных из ES, и последующий анализ последующей гемопоэтической дифференцировки.

Аннотация

Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) являются выдающейся моделью для выяснения молекулярных механизмов клеточной дифференцировки. Они особенно полезны для исследования развития ранних гемопоэтических клеток-предшественников (ГПК). Экспрессией генов в ЭСК можно манипулировать с помощью нескольких методов, которые позволяют определить роль отдельных молекул в развитии. Одна из трудностей заключается в том, что экспрессия конкретных генов часто имеет различные фенотипические эффекты в зависимости от их временной экспрессии. Эту проблему можно обойти путем создания ЭСК, которые индуцируемо экспрессируют интересующий ген с помощью такой технологии, как доксициклин-индуцируемая трансгенная система. Тем не менее, создание этих индуцируемых клеточных линий является дорогостоящим и трудоемким процессом. Здесь описан метод дезагрегирования эмбриоидных телец (БЭ), полученных из ЭСК, в одиночные клеточные суспензии, ретровирусного инфицирования клеточных суспензий и последующего реформирования БЭ путем подвешивания. Затем дифференцировка на последующих этапах оценивается с помощью проточной цитометрии. С помощью этого протокола было продемонстрировано, что экзогенная экспрессия гена микроРНК в начале дифференцировки ESC блокирует генерацию HPC. Однако, при экспрессии в клетках, полученных от БЭ после того, как зарождается мезодерма, ген микроРНК усиливает гемопоэтическую дифференцировку. Этот метод полезен для изучения роли генов после получения определенной ткани зародышевого слоя.

Введение

Мышиные эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) являются плюрипотентными, оставаясь недифференцированными и самообновляющимися в присутствии ингибиторного фактора цитокинового лейкоза (LIF)1. При выводе LIF они спонтанно дифференцируются в трехмерные (3D) структуры, называемые эмбриоидными тельцами (БЭ)2. 3D-архитектура позволяет развивать три зародышевых слоя: эктодерму, энтодерму и мезодерму, которые затем дают начало зрелым тканям3 типа. ЭСК являются исключительной моделью для выяснения молекулярных механизмов клеточной дифференцировки, в частности, для исследования развития ранних гемопоэтических клеток-предшественников (ГПК)4.

Экспрессией генов в ЭСК можно манипулировать с помощью нескольких методов, которые позволяют определить роль отдельных молекул в развитии. Одним из наиболее распространенных методов является использование гомологичной рекомбинации для получения линий ESC, в которых отсутствует ген, представляющий интерес5,6. Существует также ряд методов, которые использовались для сверхэкспрессии генов. Первым методом, использованным для модификации экспрессии генов в ЭСК, было инфицирование их рекомбинантными ретровирусами7,8. Однако интересующий ген часто замалчивается, поскольку ЭСК дифференцируются на прогениторные и зрелые типы клеток. Использование лентивирусов оказалось успешным в ограничении сайленсинга вирусно экспрессируемых генов9. Другие вирусные векторы, используемые для сверхэкспрессии, включают аденовирус и аденоассоциированный вирус10. Кроме того, для экспрессии трансгена ESC широко используются стандартные методы трансфекции для стабильного введения экспрессии плазмид11. Одна из трудностей с этими системами заключается в том, что часто экспрессия конкретного гена имеет различные эффекты в зависимости от его временной экспрессии. Например, белок Smad1 по-разному влияет на развитие кроветворных клеток на разных стадиях развития БЭ12,13.

Эту проблему можно обойти, создав ESC, которые индуцируемо экспрессируют интересующий ген. Наиболее распространенной системой индуцируемой экспрессии трансгенов в ЭСК является оперон резистентности к тетрациклинам из E. coli (Escherichia coli). Было разработано несколько различных тетрациклиновых систем. Одна из наиболее популярных стратегий была разработана Кибой и коллегами14. Они создали линию ESC (Ainv15), в которой ген обратного тетрациклинового трансактиватора вставлен в конститутивно активный локус ROSA26. В локус HPRT (гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы) на Х-хромосоме вводили элемент тетрациклинового ответа (TRE), расположенный ниже по потоку сайт LoxP (локус X-over P1 от бактериофага P1) и непромотерную неомициновую кассету. Используя рекомбинационный подход CRE, ген, представляющий интерес, вместе с эукариотическим промотором, стимулирующим экспрессию гена устойчивости к неомицину, может быть вставлен в сайт LoxP. Правильно нацеленные ЭСК выделяются с помощью выбора G418. Эти целевые клоны затем должны быть проверены на индуцируемую доксициклином (или тетрациклином) экспрессию трансгена. Этот подход позволил успешно генерировать линии ESC, которые индуцируемо экспрессируют HoxB4, Stat5, SCL и Smad714-17. Тем не менее, создание этих индуцируемых клеточных линий занимает много времени. Здесь описан метод дезагрегации эмбриоидных телец (БЭ), полученных из ЭСК, на одиночные клеточные суспензии, ретровирусного инфицирования клеточных суспензий в разные дни развития, а затем реформирования БЭ путем подвешивания капель. Дифференцировка на последующих этапах позже оценивается с помощью проточной цитометрии. В данной статье показан пример того, как экспрессия микроРНК в клетках, полученных из БЭ, влияет на гемопоэтическую дифференцировку. Этот метод полезен для изучения роли генов после получения определенной ткани зародышевого слоя.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1 эмбриоида тела (EB) Формирование

  1. Желатин-адаптации ЭСК, которые были сохранены на мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ). Пассаж ЭСК 3 раза по 6 луночного планшета для культуры, покрытые 0,1% желатина удалить MEFs.
    1. Рост клеток в ESC обслуживания сред с LIF для поддержания недифференцированного клетки (Таблица 1). Убедитесь, что клетки никогда не превышает 80% слияния. Используйте низкий проход (10 или менее отрывки после удаления из MEFs) клеток к дифференциации.
  2. За день до ЭСК культивируют для EB дифференциации, прохождение клетки таким образом они будут примерно 50-70% сливной на следующий день. Продолжить культивирования клеток в ESC поддерживающую среду, чтобы сохранить сотовый плюрипотентности.
  3. В день дифференциации, технического обслуживания средств массовой информации аспирации ESC и промывают 1 мл фосфатно-солевом буфере (PBS: 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, и 11,9 мМ фосфатном буфере, рН 7,4) на лунку 6-луночного планшета.
    1. Добавить 200 мкл 0,25% trypsв / ЭДТА в каждую лунку и инкубируют при 37 ° С в течение 3 мин.
    2. Инактивации трипсина / ЭДТА с 800 мкл дифференцировки. Пипеткой вверх и вниз в 2 мл серологической пипеткой с наконечником P200, чтобы сломать вверх клеток в суспензии отдельных клеток. Убедитесь, что наконечник p200 плотно на конце, поэтому СМИ не подняться между пипеткой и интерфейсе проводов.
    3. Внесите вверх и вниз примерно в 5-10 раз. Позаботьтесь, чтобы не создавать пузыри во время пипетки.
  4. Передача клетки 15 мл коническую трубку. Принесите объема до 10 мл PBS. Центрифуга при 315 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
  5. Удалить супернатант. Мыть два раза с 5 мл PBS, чтобы удалить остатки бумаги, содержащие LIF. Центрифуга, как в шаге 1.4 для каждой стирки.
    1. Ресуспендируют конечный осадок клеток в 2 мл в среде для дифференцировки (таблица 2).
  6. Граф клеток с гемоцитометра или мобильный прилавок и пластины 6,000-10,000 клеток / мл в 10 см чашку Петри(Не тканевой культуры обработанных).
    1. Определить точное клеток / мл эмпирически для каждой линии ESC. Используйте стерильные чашки Петри, обычно используемые для бактериальной работы или низкой приверженности пластин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения наилучших результатов дифференциации, что ЭТ должны формировать сферы, которые остаются во взвешенном состоянии, не подключая к пластине. Проверьте несколько марок плит, чтобы найти те, с наименьшим приверженности.
    2. Выдержите дифференцирующие ЭСК в C культуры ткани инкубаторе с 5% CO 2 37 °.
Реагент Фото Конечная концентрация Объем Компания Номер по каталогу
DMEM 1x 410 мл S IGMA / Aldrich D5796
FBS (ES экранированный) 100% 15% 75 мл Hyclone SH30070.03E
Номера для незаменимых аминокислот 100x 1x 5 мл Life Technologies 11140
L-глютамин 100x 1x 5 мл Life Technologies 35050
Penncillin / стрептомицина 100x 1x 5 мл Life Technologies 15070
β-меркаптоэтанол 14.3 M 114 мкМ 4 мкл Sigma / Aldrich M3148
Фактор ингибирования лейкоза (LIF) 10 7 единиц / мл 1000 ед / мл 50 мкл Millipore ESG1107
ontent "> Таблица 1: ESC Техническое обслуживание СМИ.

Реагент Фото Конечная концентрация Объем Компания Номер по каталогу
DMEM 1x 410 мл Sigma / Aldrich D5796
FBS (Пользователь скринингу на оптимальное дифференциации) 100% 15% 75 мл Hyclone SH30070.03E
Номера для незаменимых аминокислот 100x 1x 5 мл Life Technologies 11140
L-глютамин 100x 1x 5 мл Жизнь Technoloгии 35050
Penncillin / стрептомицина 100x 1x 5 мл Life Technologies 15070
β-меркаптоэтанол 14.3 M 114 мкМ 4 мкл Sigma / Aldrich M3148

Таблица 2: среде для дифференцировки.

2. Подготовка EB Клетки для вирусной инфекции

  1. На определенной стадии развития (между 2-й день и 3 дня), передать ЭТ от 10 см чашки Петри с 15 мл коническую трубку. Промыть пластины с 5 мл PBS и добавить мытье в конической трубе.
  2. Гранул ЭТ на 315 мкг при комнатной температуре в течение 5 мин. Вымойте клетки EB с 5 мл PBS.
  3. Добавьте 1 мл талой раствора клеточной отряда (Содержит протеолитических и коллагенолитических ферментов) и поместить пробирки в водяной бане при 37 ° (или инкубатор) в течение 30 мин с OCCasional агитация (от стряхивая или светло встряхиванием).
  4. Добавьте 1 мл дифференцировки. Внесите вверх и вниз с 2 мл пипеткой с наконечником p200 пипетки. Поместите пробирку в водяной бане 37 ° снова в течение 30-60 мин.
  5. Спин вниз клетки при 315 мкг в течение 5 мин и промыть клетки с PBS.

3 Вирус Инфекция

  1. Ресуспендируют клеток в 1,5 мл в среде для дифференцировки. Передача клеточной суспензии в 6-луночный не-культуры ткани, обработанной пластины.
  2. Подготовьте ретровирус при помощи стандартных приемов загодя. Добавить 5 до 100 мкл вирусного супернатанта клеток в зависимости от титра вируса. Не добавляйте полибрена, чтобы добавлять инфекции, поскольку это тормозит последующее реформирование ЭТ.
  3. Spinoculate клетки с вирусом центрифугированием при 2120 х г в течение 90 мин при комнатной температуре.

4 Дифференцируя Вирусные инфицированных клеток EB в висячей капли

  1. Добавить 2 мл дифференцировки в каждую лунку Infected EB клеточной суспензии.
  2. Внесите 3,5 мл зараженной EB клеточной суспензии в стерильной водохранилища реагентов для multipipettors. Используйте multipipettor в пипетируйте 15-20 строк восьми 20 мкл капли на перевернутой крышке 15 см чашку Петри.
  3. Добавьте 10 мл стерильного PBS или воды в нижней части чашки Петри. Тогда инвертировать крышку с каплями и место на чашку Петри. Убедитесь, что капли висит вниз головой с крышкой с PBS или воды ниже, чтобы держать камеру увлажняется.
  4. Поместите посуду в 37 ° C культуре ткани инкубаторе с 5,0% СО 2.
  5. После 2 дней, собирают ЭТ, образованных в висячей капли путем инвертирования крышку и промывки 4,5 мл в среде для дифференцировки.
    1. Передача информации и ЭТ на новый 10 см без культуры ткани чашку Петри. Вымойте крышку еще раз с 3 мл дифференциации средств массовой информации и передачи в 10 см пластины.
  6. Урожай клетки для анализа с помощью проточной цитометрии после в общей сложности 8дней культуры, начиная с первоначального перевода клеток в среде для дифференцировки (-LIF).

5. Подготовка Клетки для анализа расхода Цитометр

  1. Передача клеток в 15 мл коническую пробирку с пипеткой 10 мл. Промыть пластины с 5 мл PBS и передать то же коническую трубку.
  2. Пелле клетки в 315 х г. Вымойте гранул с 10 мл PBS.
  3. Добавить 1 мл раствора талой открепления клеток и поместите пробирки в водяной бане при 37 ° С в течение 30 мин при периодическом перемешивании. Для обнаружения некоторых антигенов клеточной поверхности, трипсин, может быть использован вместо.
  4. Добавить 1 мл дифференциации СМИ и пипетки вверх и вниз с 2 мл пипетки. Используйте кончик P200 к концу пипетки, чтобы помочь разбить-переваривают до EB в суспензии отдельных клеток.
    1. Поместите пробирку в водяной бане при 37 ° в течение 60 мин для того, чтобы интегральные мембранные белки, чтобы переработать на поверхность клетки.
  5. Гранул клетки при 315 мкг в течение 5 мин.
  6. Вымойте Wi клетокго 0,1% бычьего сывороточного альбумина фракции V (БСА) подготовлена ​​в PBS (PBS / BSA) и инкубировали клетки с конкретными флуоресцентно помеченные антитела.

6 проточной цитометрии для гемопоэтических прародителей

  1. Поместите 10 6 EB полученные клетки в 5 мл 12 х 75 мм с круглым дном трубки. Для регулировки проточной цитометрии установками компенсации, использовать компенсационные бусы соответствии с инструкциями производителя.
  2. Пелле клетки в 315 х г. Слить супернатант и ресуспендируют осадок в остаточном растворе PBS / BSA в трубке.
  3. Для обнаружения ESC HPCS, инкубировать клетки с люминесцентными меченые антитела: анти-мышь CD41-PE (R-Phycoerytherin) и анти-мышь CD117 (cKit) -APC / CY7 (аллофикоцианин цианиновых 7).
    1. Развести антител 1: 100 в ЗФР ​​/ БСА. Добавьте 100 мкл разведенного антитела к каждому образцу. Определите правильное разведение антител для каждого поставщика, клона, и много или антитела. Определить оптимальную разбавления для маркировки клеток индивидуально.
  4. Инкубируйте образцы на льду в темноте в течение 30 мин.
  5. Добавить 2 мл PBS / BSA и пеллет клетки при 315 мкг в течение 5 мин.
  6. Аспирируйте супернатант и ресуспендируют осадок в 300 мкл PBS или другой изотонического буфера.
  7. Фильтр ресуспендировали клетки через ячейки сетчатого фильтра крышкой (0,35 мкМ) для удаления крупных клеточных агрегатов.
  8. Анализ клеток на цитометром потока.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В этих исследованиях желатинированных RW4 (Производные от деформации 129X1 / SVJ мыши) ЭСК были использованы. ЭТ были выделены на 3 суток дифференцировки. Для достижения наилучших результатов в ЭТ должна быть сферической и не соблюдают (1А, Б). После spinoculation с вирусом совместно экспрессирующих флуоресцентный маркер GFP вместе с интересующего гена, ЭТ были преобразованы с помощью метода висячей капли. ЭТ были успешно реформирована из клеточных суспензий, приготовленных из 2,0, 2,5 и 3,0 дня EBS. Те...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Как обсуждалось выше, ESC клоны, которые экспрессируют индуцибельно представляющий интерес ген может быть сгенерирован с использованием доксициклина системы, однако, поколение этих линий отнимает много времени и трудоемким. Описанные в данном протоколе это метод для экспрессии гена интереса к суспензии отдельных клеток, полученной из ESC полученной ЭТ. Эти инфицированные клетки затем преобразовано в ЭТ по висячей капли изучить последующую дифференциацию. В примере (рисунок 3), было показано, что выражен...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют конкурирующие финансовые интересы раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами на пилотный проект и технико-экономическое обоснование от Медицинского центра Школы Университета Индианы (IUSM) за выдающиеся достижения в молекулярной гематологии (NIDDK, 5P30DK090948). Дополнительное финансирование было предоставлено за счет гранта на биомедицинское усовершенствование от IUSM. Мы хотели бы поблагодарить доктора Карен Кауден Даль за комментарии к рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
DMEMSigma/AldrichD5796
β-меркаптоэтанолSigma/AldrichM3148
FBS (ES Screened)HycloneSH30070.03E
FBS (Defined)HycloneSH30070.03
Заменимые аминокислотыLife Technologies11140
L-GlutamineLife Технологии35050
Penn/StrepLife Technologies15070
Трипсин/EDTALife Technologies25200
LIF ESGROMilliporeESG1107
ACCUMAXMilliporeSCR006
Trypsin/EDTALife Technologies25200
Falcon Tissue Culture Plates 6- wellFisher Scientific08-772-1B
Falcon Необработанные тарелки 6-луночныеFisher Scientific08-772-49
Falcon чашка Петри 10 смFisher Scientific08-757-100D
Falcon чашка Петри 15 смFisher Scientific08-757-148
Falcon Tube 5 млFisher Scientific14-959-11A
Falcon Tube 5 мл с Cell Strainer CapFisher Scientific08-771-23
Белый стерильный ресевуарСША Scientific111-0700
Крысиный антимышиный CD41 PE-конъюгированныйBiolegend133906
Крысиный антимышиный CD117 APC/CY7-конъюгированныйBiolegend105826
RW4 ESCsATCCCRL-12418

Ссылки

  1. Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, 684-687 (1988).
  2. Desbaillets, I., Ziegler, U., Groscurth, P., Gassmann, M. Embryoid bodies: an in vitro model of mouse embryogenesis. Experimental physiology. 85, 645-651 (2000).
  3. Hopfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Methods Mol Biol. 254, 79-98 (2004).
  4. Tian, X., Kaufman, D. S. Differentiation of embryonic stem cells towards hematopoietic cells: progress and pitfalls. Curr Opin Hematol. 15, 312-318 (2008).
  5. Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell. 51, 503-512 (1987).
  6. Mansour, S. L., Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse embryo-derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non-selectable genes. Nature. 336, 348-352 (1988).
  7. Robertson, E., Bradley, A., Kuehn, M., Evans, M. Germ-line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector. Nature. 323, 445-448 (1986).
  8. Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. Retroviral expression in embryonic stem cells and hematopoietic stem cells. Mol Cell Biol. 20, 7419-7426 (2000).
  9. Pfeifer, A., Ikawa, M., Dayn, Y., Verma, I. M. Transgenesis by lentiviral vectors: lack of gene silencing in mammalian embryonic stem cells and preimplantation embryos. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 2140-2145 (2002).
  10. Smith-Arica, J. R., et al. Infection efficiency of human and mouse embryonic stem cells using adenoviral and adeno-associated viral vectors. Cloning and stem cells. 5, 51-62 (2003).
  11. Lakshmipathy, U., et al. Efficient transfection of embryonic and adult stem cells. Stem Cells. 22, 531-543 (2004).
  12. Cook, B. D., Liu, S., Evans, T. Smad1 signaling restricts hematopoietic potential after promoting hemangioblast commitment. Blood. 117, 6489-6497 (2011).
  13. Zafonte, B. T., et al. Smad1 expands the hemangioblast population within a limited developmental window. Blood. 109, 516-523 (2007).
  14. Kyba, M., Perlingeiro, R. C., Daley, G. Q. HoxB4 confers definitive lymphoid-myeloid engraftment potential on embryonic stem cell and yolk sac hematopoietic progenitors. Cell. 109, 29-37 (2002).
  15. Galvin, K. E., Travis, E. D., Yee, D., Magnuson, T., Vivian, J. L. Nodal signaling regulates the bone morphogenic protein pluripotency pathway in mouse embryonic stem cells. J Biol Chem. 285, 19747-19756 (2010).
  16. Ismailoglu, I., Yeamans, G., Daley, G. Q., Perlingeiro, R. C., Kyba, M. Mesodermal patterning activity of SCL. Exp Hematol. 36, 1593-1603 (2008).
  17. Kyba, M., et al. Enhanced hematopoietic differentiation of embryonic stem cells conditionally expressing Stat5. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 11904-11910 (2003).
  18. Cao, M., et al. MiR-23a regulates TGF-beta-induced epithelial-mesenchymal transition by targeting E-cadherin in lung cancer cells. Int J Oncol. 41, 869-875 (2012).
  19. Chan, M. C., et al. Molecular basis for antagonism between PDGF and the TGFbeta family of signalling pathways by control of miR-24 expression. EMBO J. 29, 559-573 (2010).
  20. Huang, S., et al. Upregulation of miR-23a approximately 27a approximately 24 decreases transforming growth factor-beta-induced tumor-suppressive activities in human hepatocellular carcinoma cells. Int J Cancer. 123, (2008).
  21. Min, S., et al. TGF-beta-associated miR-27a inhibits dendritic cell-mediated differentiation of Th1 and Th17 cells by TAB3, p38 MAPK, MAP2K4 and MAP2K7. Genes Immun. 13, 621-631 (2012).
  22. Mikkola, H. K., Fujiwara, Y., Schlaeger, T. M., Traver, D., Orkin, S. H. Expression of CD41 marks the initiation of definitive hematopoiesis in the mouse embryo. Blood. 101, 508-516 (2003).
  23. Mitjavila-Garcia, M. T., et al. Expression of CD41 on hematopoietic progenitors derived from embryonic hematopoietic cells. Development. 129, 2003-2013 (2002).
  24. Warr, M. R., Pietras, E. M., Passegue, E. Mechanisms controlling hematopoietic stem cell functions during normal hematopoiesis and hematological malignancies. Wiley interdisciplinary reviews. Systems biology and medicine. 3, 681-701 (2011).
  25. Dahl, R., Ramirez-Bergeron, D. L., Rao, S., Simon, M. C. Spi-B can functionally replace PU.1 in myeloid but not lymphoid development. Embo J. 21, 2220-2230 (2002).
  26. Dahl, R., et al. Regulation of macrophage and neutrophil cell fates by the PU.1:C/EBPalpha ratio and granulocyte colony-stimulating factor. Nat Immunol. 4, 1029-1036 (2003).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Эмбриональные стволовые клеткиформирование эмбриоидных телецанализ методом проточной цитометрииприготовление клеточной суспензииметод висячей каплифлуоресцентное окрашивание антителамимаркеры CD41 CD17ткани зародышевых листков
Ретровирусная Заражение мышиной эмбриональных стволовых клеток клетки, полученные из эмбриональных орган для анализа кроветворной дифференциации
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.