Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Анализ нейрососудистой ремоделирования в Entorhino-гиппокампа культуры Органотипической Slice

9.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52023

⸱

23 октября 2014 г.

 ,  , 
1Anatomical Institute, Department of Biomedicine Basel, University of Basel, 2Department of Neonatology, University Children's Hospital (UKBB), University of Basel

В этой статье

Краткое содержание

Протокол для entorhino-гиппокампа органотипической срез культуры, который позволяет воспроизводить многие аспекты ишемического повреждения головного мозга, представлен. Изучая изменения в neurovasculature в дополнение к изменениям в нейронах, этот протокол является универсальным инструментом для изучения пластиковые изменения в нервной ткани после травмы.

Аннотация

Ишемического повреждения головного мозга является одним из наиболее распространенных и разрушительных условиях компрометирующих нормальной работы мозга и часто приводит к сохраняющиеся функциональные дефициты в пострадавших пациентов. Несмотря на интенсивные усилия научно-исследовательских, там до сих пор нет эффективной вариант лечения, что снижает повреждение нейронов и защищает нейроны в ишемических областях от отсроченного вторичного смерти. Исследования в этой области, как правило, включает в себя использование сложных и проблемных животных моделях. Entorhino-гиппокампа органотипической срез культуры оспаривались с кислородом и лишения глюкозы (OGD) устанавливаются в моделях пробирке, которые имитируют церебральной ишемии. Новым аспектом данного исследования является то, что изменения в кровеносных сосудов головного мозга изучаются в дополнение к нейронных изменений и реакции как нейронов отсека и сосудистой отсека можно сравнить и взаимосвязаны. Методы, представленные в данном протоколе существенно расширить возможности применения илиganotypic ломтик культура подход. Индукция OGD или только гипоксии может быть применено достаточно простыми средствами в органотипических срез культуры и приводит к надежным и воспроизводимым повреждения в нервной ткани. Это резко контрастирует с сложных и проблемных экспериментах на животных, вызывающих инсульт и ишемии в естественных условиях. Расширяя анализ включить изучение реакции сосудистой могут обеспечить новые способы, как сохранить и восстановить функции мозга. Подход ломтик культура представлена ​​здесь может развиваться в привлекательный и важный инструмент для изучения ишемического повреждения головного мозга и могут быть полезны для тестирования потенциальных терапевтических мер, направленных на нейропротекции.

Введение

Центральная нервная система особенно чувствительна к потере или снижению кислорода и питания глюкозы сосудистой. Даже довольно короткий перерыв кровоснабжения мозга может вызвать постоянную потерю функции соответствующих областях мозга, ведущих к типичных синдромов инсульта. В дополнение к гибели нейронов в первичных пораженные участки, что, как правило, является дополнительной задержкой гибель нейронов за счет вторичного повреждения. К сожалению, до сих пор ни нейропротекторное лечение для снижения среднего гибели нейронов был доступен 1. Научно-исследовательская для изучения механизмов вторичного повреждения полагаться на использование животных моделях церебральной ишемии как окклюзии средней мозговой артерии и различных тромботических методов окклюзии (для недавнем обзоре см 2). Параллельно, также вследствие ограничений и этических проблем с применением моделей животных, органотипической культуре Кусочек различных тканей ЦНС были использованы, что позволяет Stuду нейронных реакций на различного типа травм 3-5.

Для изучения нейронов реакцию в условиях, которые имитируют ишемического повреждения головного мозга, модель системы в виде лишения глюкозы кислорода (OGD) была разработана. В этой модели, срез культуры временно воздействию среды, который испытывает недостаток глюкозы и была уравновешена газообразным азотом при отсутствии кислорода. При таком лечении, можно вызвать повреждение нейронов и потерю который довольно похож на тот, наблюдаемого после ишемического повреждения в естественных 6, 7. В гиппокампе, такая обработка вызывает потерю нейронов в частности, в СА1, но не в CA3 площадь или зубчатая извилина гиппокампа. В отличие от этого, изучение сосудистых реакций в срез культуры до сих пор широко не проводилось. Очевидная причина является отсутствие циркуляции и кровеносных сосудов перфузии в модели ломтик культуры. Тем не менее, мы показали ранее, что можно поддерживать BLOOD сосуды в ЦНС срез культуры в течение нескольких дней 8, 9.

Общая цель этого метода является не только следить за судьбу нейронов после OGD но расширить исследование с судьбой и ремоделирования сосудистой которая является важной частью ответа травмы. До сих пор такие исследования не требует использования экспериментов на животных (Де Йонг и др., 1999; Cavaglia др, 2001.). В протокол, представленные здесь, мы будем подробно, как такие исследования можно сделать в entorhino-гиппокампа органотипических культур срез вызов либо с гипоксией или экзайтотоксическим поражений с последующим анализом обоих нервных реакций выживания и кровеносных сосудов. Этот протокол основан на ранее опубликованном исследовании на эту тему 10 и могут быть полезны для любой лаборатории, заинтересованного в сосудисто-нервных взаимодействий в ЦНС.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Эксперименты на животных были проведены в соответствии с Директивой Совета Европейских Сообществ от 22 сентября 2010 года (2010/63 / ЕС) и были рассмотрены и разрешены швейцарскими властями.

1 Настройка Органотипической Entorhino-гиппокампа срез культуры

  1. Подготовьте entorhino-гиппокампа органотипической срез культур (EHOSCs) от послеродовых щенков день 4 (P4) мыши, используя статический метод инкубации 4,11. Здесь, использовать C57BL6 и CB6F1 мышей.
    1. Берут примерно 30 мин на мыши щенка для подготовки срез культуры, то есть 3 часа для помете 6 щенков мыши. Выполнить все операции в стерильных условиях в потока верстаке ламинарного со стерильными хирургическими инструментами.
    2. Для того, чтобы избежать возможных помех с позиции среза вдоль септо- временная оси, использовать только гиппокампа ломтики септальной половине. Если не указано иное, выполнять все действия при комнатной температуре.
  2. Отрежьте тГлава армянского щенка P4 мыши с хирургическими ножницами. Анестезия не требуется для этого шага.
    1. Снимите череп вокруг мозга и определить трещину между хвостового конца больших полушарий и среднего мозга. Осторожно снимите часть ростральнее мозга в среднем мозге от черепа и поместить его в ледяной подготовки среды, состоящей из MEM с добавлением стабилизированного виде L-глутамина.
  3. Продолжить рассечение под стереомикроскопом с мозг погружения в ледяную подготовки среды. Удалить оставшиеся мозговые оболочки из корковых полушарий. Определение гиппокамп на медиальной поверхности хвостового полусферы и отделить его вместе с соседним энторинальной коры от остальной части головного мозга.
    1. Передача ткани к ткани вертолет и сократить 400 мкм толстыми ломтиками в асептических условиях, поперечном к септо- временная оси гиппокампа.
  4. Поместите ломтики на сеLL культуры вставки (примерно 6 ломтиков в вставки) и инкубируют их в 6-луночных планшетах с 1 мл на лунку в среде инкубации (47 мл MEM, 25 мл Дульбекко, 25 мл лошадиной сыворотки, 1 мл Glutamax I, 1 мл стерильные 10% раствора глюкозы, рН 7,3) в увлажненной атмосфере с 5% CO 2 при 37 ° С. Изменение среды на следующий день и затем через день до 1 недели.

2 Экстракорпоральное гипоксии и кислорода-глюкозы Лишение с реперфузией

  1. В таблице 1 для точного графика процедуры. Культура EHOSCs в течение 5 дней (DIV5) перед воздействием гипоксии или OGD. В этот момент времени переключения носителя из инкубационной среде, содержащей 25% лошадиной сыворотки, чтобы бессывороточной среде следующего состава: Neurobasal среду с 2% B27 добавки, 1% глютамаксом и дополнительной 0,1% глюкозы.
  2. Подготовьте среду OGD, как описано в работе 7 .the окончательные концентрации компонентов будет следующим: 0,3мМ CaCl 2, 70 мМ NaCl, 5,25 мМ NaHCO 3, 70 мМ KCl, 1,25 мМ NaH 2 PO 4, 2 мМ MgSO 4, и 10 мМ сахарозы при рН 6,8. Добавить 1 мл OGD среды в каждую лунку двух культуральных планшетах 6-луночных тканевых.
    1. Заливать среду OGD с N 2 в течение 1 часа в гипоксии камере, а затем запечатать и хранить O / N в инкубаторе при температуре 37 ° C.
    2. Используйте анаэробные полоски как гипоксии показателей. Рассмотрим среду, чтобы быть бескислородной когда цвет полосок изменяется от розового до белого.
    3. Для индукции гипоксии, использовать бессывороточной среде с глюкозой вместо OGD среды. Перед использованием, заливать жидкость с N 2 в гипоксии камеры, как описано выше для OGD среды.
  3. До того, как ломтики подвергаются OGD, заливать среды OGD снова N 2 в течение 30 мин. Добавить 2 мкл 1 мг / мл пропидийиодида (ПИ) раствора на лунку (на конечной концентрации 2 мкг / мл) на ломтики в течение 30 мин и выборатолько здоровые слайсы для экспериментов, как указано низким числом PI-положительных клеток.
  4. Использование график OGD воздействия и реперфузии показано на рисунке 1. Deprive ломтики либо кислородом только (гипоксии) или кислородом и глюкозой (OGD) в течение 15 мин.
    1. Для индукции гипоксии или OGD, передать ломтики в OGD среды и держать в течение 15 мин в гипоксии камеры. Убедитесь, что все текучие среды, которые остаются на сторонах вкладыша отсасывают вдали когда культуры перешли от обычной среде с OGD среды и обратно.
    2. После гипоксии или OGD, заменить носитель OGD с кислородом среде, свободной от сыворотки и культуры оставляли для восстановления на 3, 24 или 48 часа в бессывороточной среде в регулярном инкубаторе при 37 ° C с 5% CO 2. Добавить PI снова до фиксации для определения гибели клеток.

3. Фармакологические Лечение Entorhino-гиппокампа культур Органотипической Slice

  1. Culturе EHOSCs в течение 5 дней (DIV5) в среду инкубации до воздействия фармакологического лечения. Начните фармакологические методы лечения либо во время OGD или сразу после OGD когда ломтики передаются бессывороточной среде.
  2. Процедуры для защиты от OGD.
    1. Добавить 100 мкм 6-циано-7-нитрохиноксалин-2,3-дион (CNQX) или 1 мкМ тетродотоксин (TTX) в культуральной среде в течение индукции OGD (за 15 мин) или сразу после индукции OGD в течение 30 мин. Затем, инкубировать в нормоксических бессывороточной среде в течение 48 ч до фиксации.
  3. Лечение индукции эксайтотоксичного смерти.
    1. После 5 дней в инкубационной среде коммутатора культур в бессывороточной среде, содержащей 100 мкМ (RS) -α-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовой кислоты (АМРА) в течение 30 мин.
    2. Снимите культуральной среды, содержащей АМФК стремлением (заботиться, чтобы удалить остатки среды на вставками), а затем перенести ломтики в свежих пластинок с нормальной свободной среды и сывороткидержать их в течение 48 часов до фиксации.

4. Фиксация и Иммуноокрашивание Entorhino-гиппокампа культуры Органотипической Slice

  1. Пропидийиодидом (PI) окрашивание.
    1. Добавить PI в течение 30 мин к культуральной среде живых срезах при концентрации 2 мкг / мл. Посмотреть живые культуры с помощью инвертированного микроскопа, оснащенного флуоресценции оптики и выберите ломтики для дальнейшего лечения. Для окрашивания PI в сочетании с иммуногистохимии, добавить PI Solution 30 мин до фиксации культур.
  2. Фиксация ломтиками.
    1. Удалить культуральной среды от пластины 6-луночный и добавить 3 мл свежеприготовленного 4% параформальдегида (PFA) в каждую лунку. Затем поместите 6-луночный планшет в холодильнике и исправить O / N при 4 ° С.
    2. Удаления раствора PFA на следующий день и мыть ломтики 3-4 раза забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS).
  3. Удаление ломтиков из клеточной культуры Insert и блокирование процедура для иммуногистохимии из свободно плавающих секций.
    1. Аккуратно освободите и снимите ломтики из культуральных вставок с помощью арт-кисть размера 0 или меньшим. Передача каждого отдельного среза в лунку 96-луночного планшета, заполненной блокирующем буфере (PBS с 3% нормальной козьей сыворотки (NGS) и 2% Тритон-X100). Хранить ломтики в блокирующем буфере в течение 2 ч при комнатной температуре при постоянном перемешивании с помощью орбитальном шейкере.
  4. Иммуноокрашивание из срез культуры
    1. Для маркировки кровеносные сосуды использовать поликлональные анти-ламинин в разведении 1: 200 в ЗФР, содержащим 1% NGS и 0,5% Тритон-X100.
    2. Для маркировки нейроны используют анти-ассоциированный с микротрубочками белок 2 (МАР2) в разведении 1: 500 в ЗФР, содержащим 1% NGS и 0,5% Тритон-X100.
    3. Инкубируйте срезов с первичными антителами в течение 48 ч при 4 ° С при постоянном перемешивании. После инкубационного периода, промойте их в PBS с 0,5% Triton-X100 в 3-4 раза.
    4. Развести вторичных антител 1: 500 в ЗФР, содержащим 1% NGS и 0,5% Тритон-X100. Выдержите ломтики в течение 2 часов при комнатной температуре в темноте с Alexa флуорофорных сопряженных вторичными антителами. С помощью соответствующего козий анти-кроличий или анти-козел мыши вторичного антитела, конъюгированного с Alexa 350 или 488.
    5. Удалить раствора вторичного антитела и промыть ломтики три раза трис-буферном солевом растворе (TBS); смонтировать их на предметные стекла и покровное слайды с Mowiol.
  5. Микроскопия окрашенных срезов
  6. Посмотреть окрашенных срезов либо на стандартном микроскопе с эпифлуоресцентной оборудования или с конфокальной микроскопии. Съемку с соответствующей камерой. Для некоторых изображений, инвертировать флуоресценции контраст в порядке, получая темно окрашенные сосуды на ярком фоне (рисунки 5 и 6).

5 Определение регионального Плотность судов в культур

  1. Количественная Вессел Плотность основаны на переходах сосудов, как описано в ссылочном 8.
  2. Используйте ломтики окрашенные для ламинином для этих измерений. Наложение записанные образы 10-кратным увеличением с 6 х 6 сетке, где каждый сетки равна 100 х 100 мкм на площади, общей области 0,25 мм 2.
  3. Наложение три таких сетей в регионе CA1, CA3, DG, и ЕС (Рисунок 2). Количество судов, пересекающих линии сетки.
  4. Для получения результатов с хорошей статистической значимости, производить измерения по крайней мере в 3 независимых экспериментов, каждый из которых включает данные из 3 щенков мыши с 3 ломтиков в мыши щенка.
  5. Определить среднюю стоимость пересечения судна из сеток для каждого региона и выполнить статистический анализ по ANOVA с Бонферрони коррекции как постфактум теста (р <0,05 определяется как значительное) с использованием соответствующего программного обеспечения статистики.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Кислород лишение глюкозы и гипоксия вызывают гибель нейронов и снижение кровеносных сосудов в частности, в гиппокампа СА1.
OGD или кислород-лишение покое в течение 15 мин индуцированной сильной индукции гибели клеток, как видно по окрашиванию пропидийиодида в частности в области СА1 гиппокампа (рисунок 3) подобное как описано выше 7. С маркеры для визуализации сети кровеносных сосудов, было установлено, что плотность кровеносных сосудов и организация появилась похожа на контроле...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

С методов, представленных здесь, гиппокампа органотипической культуры ломтик может быть использован в качестве универсального средства для изучения изменений в пластиковые нервной ткани после травмы. В то время как органотипической культуры ломтик были использованы в прошлом для изучения нейронов после ишемии реакции 6, 7 новом аспекте одновременного изучения изменений сосудов значительно увеличивает потенциальные применения этого метода. Индукция OGD или только гипоксии может быть применено достаточно просты...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Эксперименты на животных были проведены в соответствии с Директивой Совета Европейских Сообществ от 24 ноября 1986 года (86/609 / EEC) и были рассмотрены и разрешены швейцарскими властями. Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана в Базельском университете, факультет биомедицине и Швейцарского национального научного фонда (31003A_141007). Маркус Saxer оказала техническую поддержку.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Минимальная незаменимая среда MEMGibco11012-044
ГлутамаксGibco35050-061стабилизированная форма L-глютамина
Милликлеточная клеточная культура вставкиMilliporePICM03050
базальная среда Eagle Gibco41010-026
Сыворотка для лошадейGibco26050-088
Нейробазальная средаGibco21103-049
Добавка B27Gibco17504-044
Анаэробные полоскиSigma-Aldrich59886
Раствор йодида пропидиумаSigma-AldrichP4864
AMPAR& D systems0169-10
CNQXR& D системы0190/10
ТТХR& D systems1078/1
поликлональный антиламининSigma-AldrichL9393 
anti-MAP2Abcamab11267
Alexa anti-mouse 350молекулярных зондовA11045
Alexa anti-mouse 488молекулярных зондовA11001
Alexa anti-rabbit 350молекулярных зондовA11046
Alexa anti-rabbit 488молекулярных зондовA11008
Статистическое программное обеспечениеПрограммное обеспечение GraphPadGraphPad Prism
Измельчитель тканей McIlwainTed Pella10180
Камера гипоксииBillups-RothenbergMIC-101

Ссылки

  1. Turner, R. C., Dodson, S. C., Rosen, C. L., Huber, J. D. The science of cerebral ischemia and the quest for neuroprotection: navigating past failure to future success. J Neurosurg. 118, 1072-1085 (2013).
  2. Bacigaluppi, M., Comi, G., Hermann, D. M. Animal models of ischemic stroke. Part two: modeling cerebral ischemia. Open Neurol J. 4, 34-38 (2010).
  3. Woodhams, P. L., Atkinson, D. J. Regeneration of entorhino-dentate projections in organotypic slice cultures: mode of axonal regrowth and effects of growth factors. Exp Neurol. 140, 68-78 (1996).
  4. Prang, P., Del Turco, D., Kapfhammer, J. P. Regeneration of entorhinal fibers in mouse slice cultures is age dependent and can be stimulated by NT-4, GDNF, and modulators of G-proteins and protein kinase. C. Exp Neurol. 169, 135-147 (2001).
  5. Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. Spontaneous regeneration of intrinsic spinal cord axons in a novel spinal cord slice culture model. Eur J Neurosci. 27, 2483-2492 (2008).
  6. Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence. Brain Res Brain Res Protoc. 4, 173-184 (1999).
  7. Rytter, A., Cronberg, T., Asztély, F., Nemali, S., Wieloch, T. Mouse hippocampal organotypic tissue cultures exposed to in vitro ‘ischemia’ show selective and delayed CA1 damage that is aggravated by glucose. J Cereb Blood Flow Metab. 23, 23-33 (2003).
  8. Bendfeldt, K., Radojevic, V., Kapfhammer, J., Nitsch, C. Basic fibroblast growth factor modulates density of blood vessels and preserves tight junctions in organotypic cortical cultures of mice: a new in vitro model of the blood-brain barrier. J Neurosci. 27, 3260-3267 (2007).
  9. Camenzind, R. S., et al. Preservation of transendothelial glucose transporter 1 and P-glycoprotein transporters in a cortical slice culture model of the blood-brain barrier. Neuroscience. 170, 361-371 (2010).
  10. De Jong, G. I., et al. Cerebral hypoperfusion yields capillary damage in the hippocampal CA1 area that correlates with spatial memory impairment. Neuroscience. 91, 203-210 (1999).
  11. Cavaglia, M., et al. Regional variation in brain capillary density and vascular response to ischemia. Brain Res. 910, 81-93 (2001).
  12. Chip, S., Nitsch, C., Wellmann, S., Kapfhammer, J. P. Subfield-specific neurovascular remodeling in the entorhino-hippocampal-organotypic slice culture as a response to oxygen-glucose deprivation and excitotoxic cell death. J Cereb Blood Flow Metab. 33, 508-518 (2013).
  13. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Культуры срезов энторино-гиппокампальной областикислородно-глюкозная депривацияанализ выживаемости нейронованализ сосудистых измененийконфокальная микроскопияокрашивание пропидийиодидомиммуногистохимия на ламинингипоксическая камераорганотипическое культивирование срезов
Анализ нейрососудистой ремоделирования в Entorhino-гиппокампа культуры Органотипической Slice
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.