Этот протокол включает в себя подробные процедуры выделения клеток, полученных из мочи у пациентов с мышечной дистрофией; их эффективное и быстрое перепрограммирование с помощью трансдукции вируса Сендай
.Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Генерация индуцированные плюрипотентные стволовые клетки мышечной дистрофией пациентов: эффективная интеграция без перепрограммирования мочи клеток, полученных
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Дистрофические кардиомиопатия плохо понимал следствием мышечной дистрофии. Создание индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) у пациентов с мышечной дистрофией является ценным источником для сотовой в пробирке модели болезни систем и может быть использовано для скрининга лекарственных средств исследований. Пациент-клетки, полученные из мочи были использованы в успешном перепрограммирования в индуцированных плюрипотентных стволовых клеток для моделирования дистрофические кардиомиопатию 1. Обращаясь соображений безопасности интеграции векторных систем, мы приводим протокол, используя неинтегрирующих вируса Сендай вектор для трансдукции Яманака факторы в клетки мочи, собранных от пациентов с мышечной дистрофией. Этот протокол генерирует полностью перепрограммировать клонов в течение 2-3 недель. В плюрипотентные клетки являются вектор-Free прохождением-13. Эти дистрофические иПСК могут быть дифференцированы в кардиомиоциты и используется либо для изучения механизмов болезни или для скрининга лекарственных средств.
Введение
Кардиомиопатия является второй ведущей причиной смерти у пациентов с Дюшенна и Беккера мышечной дистрофии (MD). Хотя мутации в гене дистрофина с Х-хромосомой происходят в 1: 3500 новорожденных мальчиков, очень мало известно о молекулярных и клеточных событий, ведущих к прогрессирующей сердечной повреждения мышц. Человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных из мышечной больных дистрофией появились в качестве нового инструмента для изучения механизмов основного заболевания и использовать для наркотиков скрининга 1,2.
Ожидаемый дискомфорт биопсии кожи или образцов крови может отговорить молодых пациентов и / или их опекунов, чтобы дать согласие на участие в исследовании. Образцы мочи неинвазивный источником соматических клеток, которые исправимо методам перепрограммирования. Мы недавно показали, что клетки мочи, собранные от пациенты с мышечной дистрофией, можно культивировать и эффективно перепрограммировать в ИПСК с помощью ретровирусов трансдукции факторов Яманака (Oct3 / 4, Sox2, Klf4 и C-Myc; OSKM) 1. Недостатком ретровирусов доставки генов является случайным интеграция перепрограммирования генов в хромосомы хозяина. Чтобы преодолеть это ограничение, мы использовали неинтегрирующих вирус Сендай мочи перепрограммирования клеток.
Этот протокол Подробнее вируса перепрограммирование Сендай изолированных клеток мочи от мышечных больных дистрофией, которые затем могут быть дифференцированы в кардиомиоциты или другие типы клеток для дальнейшего исследования. Этот протокол также может быть адаптирована для других пациентов конкретных заболеваний.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: пациентов и / или их опекуны должны дать информированное согласие на участие в наблюдательным советом Institutional одобрил исследование.
1. Буферы и СМИ Подготовка
- Промывочный буфер: Для приготовления 100 мл промывочного буфера, добавляют 1 мл 100x пера / стрептококкового раствором (100 ед / мл пенициллина + 100 мкг / мл стрептомицина) до 99 мл фосфатного буферного солевого раствора (PBS).
- Мочевой клеток-предшественников (UPC) Medium: Для подготовки UPC среду, смешать равные объемы кератиноцитов бессывороточной (КСБ) Средняя + клеток-предшественников Medium.
- КСБ среда: Для приготовления среды кератиноцитов, добавить 5 нг / мл эпидермального фактора роста (EGF), 50 нг / мл экстракта бычьего гипофиза (BPE), 30 нг / мл холерного токсина, и ручка / стрептококк раствор (100 МЕ / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина) до 500 мл КСФ среды.
- Клеток-предшественников Medium: Добавьте три четверти DMEM с одной четвертью Ham-F12 СМИ и дополнения 10% FBS, 0,4 мкг / мл гидрокортизона, 0,1нМ холерный токсин, 5 нг / мл инсулина, 1,8 х 10 -4 М аденин, 5 мкг / мл трансферрина, 2 х 10 -9 М трииодо тиронин, 10 нг / мл EGF, и ручка / стрептококк раствор.
- ЭСК Medium: Добавить 20% замену КО-сыворотки (K-SR), 1x MEM без незаменимых аминокислот, 2 мМ L-глутамина, 100 мкм β-меркаптоэтанола, 20 нг / мл bFGF и ручку / острый 400 мл DMEM / F12 средой.
2. образце мочи Коллекция
- Поручить пациентам пить жидкости за 30 мин до сбора мочи для того, чтобы достаточное количество (~ 30-40 мл) мочи может быть собрана.
- Дайте пациентов и / или их опекунов комплект для сбора мочи, содержащее следующие пункты: (1) письменные инструкции о том, как получить стерильный или чистый образец улов мочи (2) влажные антибактериальные туалетной и (3) 100 мл стерильной ЗАБОР чашки. Поручить пациентов, чтобы собрать пробы.
- Сразу же место образцы мочи на льду и передать LABORAТори в холодильнике. Сразу Обработайте мочи для выделения клеток. Если задержка неизбежна, хранить образец на льду до 4 ч с минимальной потерей жизнеспособности клеток.
3. Выделение и расширения мочи клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие действия в стерильных условиях в BSL2 бокс биологической безопасности.
- Использование стерильных пипеток, передает пробы мочи в стерильную 50-мл центрифужные пробирки. Центрифуга при 400 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Аспирируйте надосадочную жидкость, оставив 1 мл в пробирки; будьте осторожны, чтобы не нарушить клеточный осадок.
- Ресуспендируют и комбинировать гранулы из нескольких трубок в 7 мл промывочного буфера и повторить центрифугирования при 400 × г в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Тщательно аспирата супернатант, оставляя осадок клеток и ~ 0,2-0,5 мл супернатанта. Ресуспендируют в 2-3 мл Мочевой клеток-предшественников (СКП) среде и передать суспензии в 4-6 ямах ООНс покрытием 24-луночного планшета.
- После 72 ч, дополнить культуру с 0,5 мл свежей среды UPC на лунку и изменить среду каждые 2-3 дня после. Эритроциты и клетки плоского эпителия, которые не крепятся к плите будут удалены с изменениями среды.
- Монитор культуру через 4-6 дней.
Примечание: малое 2-4 колонии клеток начнут появляться. Клетки будут округлые или удлиненные которые представляют типа I или типа II почечной эпителиальных (RE) клеток соответственно 3. - Изменение среды каждые 2-3 дня, так как только возникают клетки, они будут проходить фазу быстрого расширения.
- После того, как клетки достигают 80-90% слияния, около 9-15 дней после посева, отделить и прохождение клетки (15,000-18,000 клеток / см 2) на 2-4 скважин 24-луночного планшета для дальнейшего расширения. Отметить этот, как мобильный прохождения 1 (P1).
- Охарактеризовать клетки мочи для характеристики клона на основе анализа проточной цитометрии, immunohistochemческих окрашивание или через обратной транскриптазы-полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР).
- Перепрограммирование изолированных клеток мочи (раздел 4) или заморозить их в Замораживание Средняя (DMEM с добавлением 10% сыворотки и 10% ДМСО) для долгосрочного cryostorage.
4. Моча перепрограммирования клеток с помощью вируса Сендай
ПРИМЕЧАНИЕ: Правильное обращение и использование средств индивидуальной защиты (средства индивидуальной защиты) рекомендуют при манипулировании трансфицирующих агентов. Выполните следующие действия в стерильных условиях в BSL2 бокс биологической безопасности. Правильная утилизация трансфекции агент и / или трансфицированные клетки рекомендуется, чтобы избежать риска опасности окружающей среды и здоровья. Для перепрограммирования мочи клеток, используйте Сендай перепрограммирования Kit с изменениями фидерными зависит от протокола производителя, как описано ниже.
- Для обеспечения высокой перепрограммирование эффективности, используя вирус Сендай, использование каналы 1-5 клеток в моче, которые быстроделения LY. Если клетки не размножаются хорошо или стать стареющей, отказаться от них, поскольку они не будут перепрограммировать эффективно.
- Семена 60000 клеток на лунку в двух лунках 6-луночного планшета с. Отметить этот как День -2. Регулировка плотности посева клеток (5 × 10 4 - 9 х 10 4 клеток на лунку) в случае необходимости, чтобы достичь 80-90% слияния с днем 0.
- На день 0 (48 ч после посева клеток), подготовить для перепрограммирования векторы Сэндай (SEV), содержащие каждый из четырех факторов OSKM. Добавить каждый из векторов в 1 мл подогретого UPC среды. Используйте МВД 1-1,5 (5-7,5 х 10 5 CIU), что является достаточным для клеток перепрограммирования мочи. Аспирируйте среды и медленно добавить 1 мл UPC + Сев в одну лунку клеток мочи. Используйте вторую скважину в качестве отрицательного контроля трансдукции.
- В День 1, замените носитель UPC + Сев со свежими UPC среды. Некоторые гибель клеток наблюдали после 24 ч из-за вирусной цитотоксичности.
- В зависимости от эффективности перепрограммировать Clonе формирования и компактный морфология, держать ежедневно не изменяя среду до дня 6 или 7.
- За день до диссоциации трансдуцированных клеток (день 5 или 6), готовят MEF фидерных пластины при посеве Mitomycin-C (10 мкг / мл в течение 3 ч), обработанные-MEFs при плотности 5 х 10 4 клеток / см 2, на 0,1 % желатина покрытием 100 мм 2 чашки для культивирования.
- На следующий день (день 6 или 7), отделить клетки с 0,25% трипсина, клетки вновь суспендируют в UPC среды и пластины 5 х 10 4 - 2 х 10 5 клеток / 100 мм 2 MEF подачи пластины.
- На следующий день, переключитесь на HES среды и изменения среды каждый день. Соблюдайте клетки под микроскопом, чтобы контролировать, трансформированные клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: клетки образуют клоновых агрегаты с характерным булыжной морфологии и имеющие более высокий ядро для цитоплазматической отношения (12-18 дней после трансдукции). - В течение двух-трех недель после трансдукции, выберите колонии и передать новым пластин для Clonаль расширение.
- Выполнение окрашивание живых клеток для отбора клонов Ipsc путем инкубации клеток с TRA-1-81 антитела в течение 1 ч при 37 ° С в СО 2 инкубатор с последующим окрашиванием счетчика с конкретным флуоресцентный краситель конъюгированного вторичного антитела в течение 1 ч при 37 ° С в СО 2 инкубатор.
- Используйте 26 G 1½ дюйма иглу в кросс-Hatch большие TRA-1-81 положительных клонов IPSC в небольшие равные части размера (4-6 штук в Clone).
- Используйте стерильной пипеткой-наконечник, чтобы выбрать и передача 10-20 заштрихованной части из нескольких клонов в каждую лунку Matrigel (10 мкг / см 2) -покрытие 24-луночного планшета с ГЭК среды.
Примечание: Предметы из одного клона покрытием по отдельности в одной скважине не расширить или поддерживать плюрипотентность. - Переход из HES в IPSC среды 24-48 ч после перепрограммировать клоны крепятся к поверхности Matrigel.
- Во время технического обслуживания на Matrigel пластинок, покрытых вручную ГКРВPE-от любых дифференцированные клетки или загрязняющих MEF фидерных клеток с использованием пипетки наконечник для обогащения полностью перепрограммировать и плюрипотентных дистрофических IPSC (MD-IPSC) клонов.
- После индивидуальные клоны достигли ~ 100 размер мкм, расширить клонов диссоциации с 0,48 мМ ЭДТА (этилендиаминтетрауксусной кислоты) раствора в течение 3 мин и покрытие небольших клеточных агрегатов на MD-ИПСК, взвешенные в IPSC среде (с добавлением 5 мкМ Y27632, Rho-киназы ) на свежие Матригель (10 мкг / см 2) с покрытием 12-луночный планшет. Изменить IPSC среды ежедневно.
- Полное перепрограммирование каждого клона могут быть определены как анализа экспрессии генов генов OSKM и иммуногистохимического окрашивания маркеров плюрипотентности (Oct3 / 4 и TRA-1-81). Строгая оценка плюрипотентности потенциала должны быть использованы для подтверждения полностью перепрограммировать линии IPSC могут дифференцироваться в трех зародышевых листков. Это может быть достигнуто либо путем эмбриоидного тела (EB) образование и дифференциацию анализа или терAtoma формирование анализ.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Большинство клеток-предшественников, выделенных из мочи человека являются позитивными для uroepithelial предшественников и перицитами маркеров, таких как CD44, CD73 и CD146 (97.37%, 97.09% и 97,3% соответственно; 1А и 1В). Эти клетки также выразил другие маркеры мезенхимальных, такие как альфа-гладкой мускулатуры актина и виментина (рис 1б). Анализ RT-PCR свидетельствует о смешанной популяции клеток в культурах в том, что имеет место слабая экспрессия Цитокератин-7 (CK-...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Моделирование сердечно-сосудистых заболеваний с помощью ИПСК становится общий подход, чтобы понять генетический вклад 4-6. Некоторые непредвиденные трудности получения образцов клеток у пациентов, особенно детей младшего возраста, можно избежать, предлагая возможность неинвазивного подхода, такие как сбор мочи. В этой молодой популяции пациентов, часто бывает трудно собрать объем мочи, достаточного для получения достаточного количества клеток в моче для перепрограммирования. Коучинг молодых пациентов пить бол...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Разработка этого протокола была поддержана организацией Advancing a Healthier Wisconsin и Национальным центром развития трансляционных наук, Национальными институтами здравоохранения, через грант No 8UL1TR000055. Его содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения NIH.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Materials | |||
| 4 унции Чашка для образцов с крышкой | STL Medical Supply | M9AMSAS340 | для сбора образцов мочи |
| 15 мл пробирки BD-Falcon | Fisher Scientific | 352097 | |
| 50 мл пробирки BD-Falcon Fisher | Scientific | 352098 | |
| круглые стеклянные покровные стекла | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| CytoTune-iPS Sendai Набор для перепрограммирования | Life Technologies | A1378-001 | |
| PBS, pH 7,4 | Life Technologies | 10010-023 | |
| Pen-Strep без глутамина | Life Technologies | 15140-122 | Тепло в 37 градусов; C водяная баня перед использованием |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Прогреть в 37 градусов; C водяная баня перед применением |
| B-27 Добавка с инсулином (50x) | Life Technologies | 17504-044 | Согреть в 37 градусов; C водяная баня перед применением |
| B-27 Добавка без инсулина (50x) | Life Technologies | 0050129SA | Согреть в 37 градусов; C водяная баня перед использованием |
| DMEM/F12 (1:1) | Life Technologies | 11330-032 | Тепло в 37 градусов; C водяная баня перед использованием |
| Versene, 1:5,000 | Life Technologies | 15040066 | Warm in 37 ° C водяной бани перед применением |
| bFGF (10 & микро; g) | Life Technologies | 13256-029 | Тепло в 37 градусов; C водяной бани перед использованием |
| Cell Counter Cartridges | Life Technologies | C10228 | |
| Knockout Serum (500 мл бутылка) | Life Technologies | 10828-028 | Теплый в 37 градусов; C водяная баня перед использованием |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
| Кератиноцит-SFM (1x), Liquid | Life Technologies | 17005-042 | Теплый в 37 градусов; C водяная баня перед применением |
| DMEM, High Glucose, Glutamax | Life Technologies | 10566-016 | Прогреть в 37 градусов; C водяной баней перед применением |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Life Technologies | 11765-054 | Тепло в 37 градусов; C водяной бани перед применением |
| EGF Recombinant Human Protein, Liquid Form | Life Technologies | PHG0311L | Warm in 37° С водяной баней перед применением |
| Инсулин, Человеческий рекомбинантный, Цинк Soln | Life Technologies | 12585-014 | Теплый в 37 градусов; C водяной баней перед применением |
| TeSR-E8 | Stem Cell Technologies | 5940 | Warm in 37 ° C водяная баня перед использованием |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | Selleck | S1049 | Согреть в 37 градусов; C водяная баня перед применением |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | hESC Qualified Matrix, LVED Free |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| iScript набор для синтеза кДНК | Bio-Rad | 170-8890 | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) | Thermo-Scientific | K1081 | |
| FBS-квалифицированный | Sigma Aldrich | F6178 | теплый в 37 градусов; C водяной баней перед применением |
| Аденин Биореагент | Sigma Aldrich | A2786-5G | Подогреть в 37 градусов; C водяная баня перед применением |
| Холерный токсин от Vibrio cholerae | Sigma Aldrich | C8052-.5MG | Согреть в 37 градусов; C водяной бани перед применением |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich | H0888-1G | Прогреть в 37 градусов; C водяной баней перед применением |
| Голо-трансферрин из человека | Sigma Aldrich | T0665-50MG | Теплый в 37 градусов; C водяная баня перед применением |
| 3,3',5-Трийодо-L-тиронин натриевая соль | Sigma Aldrich | T6397-100MG | Подогреть в 37 °°; C водяной баней перед использованием |
| DAPI | Santa Cruz Biotechnology | SC-3598 | |
| Флюоромун Водоус монтажная среда | Sigma Aldrich | F4680 | |
| 16% параформальдегид | Альфа-Аэсар | 43368 | |
| Antibodies | |||
| Mouse anti CD44 - меченый FITC | BD Biosciences | 560977 | |
| Мышиный анти-CD146 - меченый PE | BD Biosciences | 561013 | |
| Мышиный анти-CD73 - меченный PE | BD Biosciences | 561014 | |
| Мышиный анти-&альфа;-гладкомышечный актин | Sigma Aldrich | A2547 | |
| Мышиный анти-Vimentin | Abcam | ab8978-100 | |
| Мышиный анти - TRA-1-81 | Life Technologies | 411100 | |
| Rabbit anti Oct 3/4 | Santa Cruz Biotechnology | SC-9081 | |
| Мышиный антидистрофин | Leica Biosystems | NCL-DYSB |
Ссылки
- Guan, X., et al. Dystrophin-deficient cardiomyocytes derived from human urine: New biologic reagents for drug discovery. Stem Cell Research. 12 (2), 467-480 (2014).
- Dick, E., et al. Exon Skipping and Gene Transfer Restore Dystrophin Expression in Human Induced Pluripotent Stem Cells-Cardiomyocytes Harboring DMD Mutations. Stem Cells Dev. 22 (20), 2714-2724 (2013).
- Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).
- Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
- Sun, N., et al. Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells as a Model for Familial Dilated Cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), 130ra147(2012).
- Zhang, Y., et al. Urine derived cells are a potential source for urological tissue reconstruction. J Urol. 180 (5), 2226-2233 (2008).
- Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells. Curr Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).
- Malik, N., Rao, M. S. A review of the methods for human iPSC derivation. Methods Mol Biol. 997, 23-33 (2013).
- Nakanishi, M., Otsu, M. Development of Sendai virus vectors and their potential applications in gene therapy and regenerative medicine. Curr. Gene Ther. 12 (5), 410-416 (2012).
- González-Ramírez, R., Morales-Lázaro, S. L., Tapia-Ramírez, V., Mornet, D., Cisneros, B. Nuclear and nuclear envelope localization of dystrophin Dp71 and dystrophin-associated proteins (DAPs) in the C2C12 muscle cells: DAPs nuclear localization is modulated during myogenesis. J Cell Biochem. 105 (3), 735-745 (2008).
- Villarreal-Silva, M., Centeno-Cruz, F., Suárez-Sánchez, R., Garrido, E., Cisneros, B. Knockdown of dystrophin Dp71 impairs PC12 cells cycle: localization in the spindle and cytokinesis structures implies a role for Dp71 in cell division. PloS One. 6 (8), e23504(2011).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
