Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Внутривенных инъекций в новорожденных мышей

61.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52037

⸱

11 ноября 2014 г.

 ,  , 
1Department of Neuroscience, Ohio State University, 2Center for Gene Therapy, Nationwide Children's Hospital Research Institute, Ohio State University

В этой статье

Краткое содержание

Животные модели детской болезни могут испытать раннее возникновение и прогрессирование агрессивное заболевание. Клинически значимые доставка терапия для молодых мышах может быть технически сложно. Этот протокол описывает неинвазивный внутривенного метод впрыска для новорожденных мышей в течение первых двух послеродовых дней жизни.

Аннотация

Внутривенная инъекция является клинически применимо манера доставить терапевтические. Для взрослых грызунов и более крупных животных, внутривенные инъекции, технически осуществимо и рутина. Тем не менее, некоторые модели мышей могут иметь раннее начало заболевания с быстрым прогрессированием, что делает администрация потенциальных методов лечения трудно. Временной (или лица) вена просто передней к ушным вкладышем на мышах и отчетливо видна в течение первых двух дней после родов по обе стороны от головки с использованием рассекает микроскопом. В течение этого окна, временная вены может быть введен с объемами до 50 мкл. Инъекция является безопасным и хорошо переносится как детенышей и плотин. Типичная процедура инъекции завершается в течение 1-2 мин, после чего щенок возвращается к домашней клетке. К третьему день после рождения жила трудно представить себе и процедура инъекции становится технически ненадежны. Эта техника была использована для доставки вируса аденоассоциированный (AAV) VectПРС, что в свою очередь может обеспечить почти тела шириной, стабильную экспрессию трансгена для жизни животного в зависимости от вирусной серотипа выбранной.

Введение

Доставка терапевтических до центральной нервной системы (ЦНС) в мышиных моделях инфекции у детей остается проблемой. Мыши, которые модели новорожденных болезненных состояний являются низкорослыми, а с развитием незрелыми, и, следовательно, может быть трудно вводить непосредственно в соответствующих структур в ЦНС. Внутрисосудистого введения терапевтических агентов является неинвазивным, хорошо переносится метод доставить клетки, наркотики, или вирусные векторы для всего тела, включая ЦНС 1-5 и сетчатки 3,5-9. Предыдущие публикации описывают временную инъекции лицо вен с помощью просвечивания 10,11, без микроскопом рассечение 11,12, или требующих двух лиц, чтобы ввести 10. Техника инъекции описано в данном протоколе выгодно, потому что один человек может придать щенков, и источник света, чтобы просмотреть временная вена не касаясь щенка, устраняя необходимость в хирургической кассете или прикрепление щенка к неподвижной поверхноститакие как просвечивания 11. Доставка аденоассоциированного вирусный вектор серотипа 9 (AAV9) у мышей производит сильную экспрессию в нейронах и астроцитов всему головного и спинного мозга (рис 1). Внутрисосудистого доставка вирусных векторов в поверхностной височной лица вены была надежно использоваться в различных исследованиях в неонатальном мышей лечить педиатрической нервно-мышечной расстройства Спинальная мышечная атрофия (СМА) 2,4,13,14 и в конечном счете увеличивается продолжительность жизни мышей.

Внутрисосудистого введения новорожденных мышей также эффективно нацелен на периферическую нервную систему и периферические органы (рис 2). После инъекции AAV, трансдукция ганглиях задних корешков, печени, сердца, скелетной мышце, легких, мышечной оболочки кишечника и сплетения кишечника наблюдалось 1,3,6,7,15. Широкое трансдукция ЦНС и на периферии делает этот метод впрыска идеала для заболеваний, требующих глобального выражениетрансген, таких как болезни 16 и другие хранилища лизосомальных болезней Гоше 17,18, болезни Баттена и связанных с ними нейронов цероид lipofuscinoses, 19 и синдромом Барде-Biedl, генетическое заболевание мультисистемной с момента появления симптомов, возникающих в раннем детстве 20. Внутрисосудистого введения в неонатальном мышей также следует рассматривать в качестве нового метода общесистемных моделирования педиатрических заболеваний. Эта техника была переведена на более крупных животных моделях 5,21 и внутрисосудистой инъекции уже существует в виде клинически приемлемый метод доставки терапевтических.

Текущий протокол описывает простой, эффективный метод не доставки агентов на новорожденных мышах через поверхностной височной лица вены не позднее послеродовой день 2. Инъекции могут быть укомплектованы одной, практикуется индивидуальный и хорошо переносится как детенышей и плотин. Щенки испытывать минимальное бедствие и быстро восстанавливаться. ImportanTLY, успешно впрыска приведет к глобальной доставки средства, вводимого. Этот протокол является подходящим для доставки вирусных векторов, фармацевтических агентов или клеток, к новорожденных мышей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры, перечисленные в протоколе были утверждены институт животноводства пользования и комитета Уход (IACUC) из Университета штата Огайо.

1. Подготовка рабочего пространства

  1. Соберите мокрый лед, чтобы обезболить щенков мыши, пустую клетку, чтобы отделить плотину из помета, вскрытии микроскопом, источника света, который может быть расположен под углом к ​​инъекции (использование источника света на 90 °   Угол в месте инъекции затеняет вены), чистую поверхность, чтобы поместить животное для инъекций, ватные тампоны, 3/10 куб.см инсулиновый шприц с 3/8 "30 G иглы (по одному на животных) и 1% синий краситель Эванса ( сделаны с фосфатным буферным солевым раствором (PBS)) раствор для обучения.
  2. Снимите дамбу в отдельную клетку, манипулируя при щенков.

Процедура 2. Инъекции

  1. Поместите один щенок прямо на льду в течение 30-60 сек обезболить животное. Не оставляйте тон животное на льду слишком долго из-за риска переохлаждения осложнений, включая фибрилляции желудочков, тканевой гипоксии и метаболического ацидоза.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наш опыт показывает, что 30-60 сек достаточно, чтобы замедлить движение щенок, чтобы для инъекций. Если глубже анестезия не требуется, ингаляции, такие как 1-2% изофлуран может быть целесообразно.
  2. В то время как животное на льду, загрузить шприц с 30 мкл Эванса синего красителя.
  3. Когда животное полностью под наркозом, подтверждается отсутствием движения на льду в то время как все еще дышит, переместите его под микроскопом. Для правосторонней инъекции, сталкиваются морду животного вправо. Поставьте левую указательный палец на морде и левого среднего пальца каудально ушным вкладышем так что ухо бутон между указательным и средним пальцами (рис 1).
  4. Изучить только впереди ушной зародыше для поверхностного капилляра, что движется, когда кожа манипулируют. Это капиллярной не является целью, однакоидентификация является важным для временной идентификации вен. Затем найдите темный, смутный вену, ниже капилляра, что остается фиксированной, независимо от положения кожи. Временная вены появляется призрачная, работает от спины к брюху, и каналы в яремную вену (рис 1).
  5. Введите временной вену с иглы конической вверх. Если правильно установлен, его можно просмотреть игла коническая наполняются кровью через кожу. Затем нажмите на поршень медленно и примечание побледнение вену вниз в сторону лица.
  6. Разрешить игла остается в вене для дополнительного 10-15 сек для предотвращения обратного потока инъекционной.

3. После инъекции

  1. После правильного введения, щенок должен почти сразу синеют. Удалите иглу и нежный силу не применять ватный тампон, чтобы в месте инъекции, пока тромбов.
  2. Монитор щенка на наличие признаков бедствия. Разрешить щенок 2-3 мин, чтобы восстановить и отогреть, гecognize когда щенок находится в сознании, в вертикальном положении и перемещения, прежде чем вернуться в клетку. Кубок щенки в перчатках следователя предоставить соответствующую тепло, чтобы помочь в восстановлении, если это необходимо. Кроме того, место грелку под дом клетке для облегчения прогрева введенного щенка. Вообще после инъекции голубого красителя Эванса, усыпить щенков. Не включать краситель при введении исследуемого материала.
  3. Поставьте щенка обратно в дом клетке и обеспечить щенок покрыт постельными принадлежностями и / или nestlet обеспечить обратный прием по плотине.
  4. Используйте новый шприц и ватный тампон для каждого щенка для поддержания стерильности.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Во время правильного инъекции, вены должны на короткое время становится ясным, или бланшировать. Если инъекционных красить весь щенок должен синеть в течение нескольких секунд. Если неправильная инъекция произошла, часто есть концентрированное подкожной болюсной в голову или шею и инъекционной может вытекать из места инъекции. Неправильное инъекции может также привести к возникновению кровоподтеки вокруг горла. Щенки, которые получают подкожные инъекции (т.е. инъекции не был полностью доставлен в вену), как пра...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Внутрисосудистого поставка агентов в ЦНС или по всему телу трудно в неонатальных мышиных моделях болезни. Описанный протокол является быстрым, относительно неинвазивным способом внутривенно вводить растворы в неонатальном мышей с минимальными требованиями к оборудованию. Хотя временная лицо вены можно рассматривать невооруженным глазом, инъекции могут иметь более высокую точность с использованием микроскопа и волоконно-оптического источника света, в особенности для unpracticed инжектора. Внутрисосудистые инъекции в неон...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Авторы признают NINDS, FightSMA и семьям SMA для финансовой поддержки. SEGL поддерживается NINDS учебного гранта # 5T32NS077984-02.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Инсулиновый шприц ThinproTerumoSS30M30093/10 куб. см, игла 3/8", 30 г, 1 на мышь
Синий красительEvans Sigma-AldrichE2129Разбавить до 1% с помощью 1x Фосфат Буферизированный физиологический раствор
Ватные аппликаторы с наконечникомFisher Scientific23-400-101
Волоконно-оптический источник светаFisherScientific 12-562-36
Препарирование микроскоп

Ссылки

  1. Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nature. 27, 59-65 (2009).
  2. Dominguez, E., et al. Intravenous scAAV9 delivery of a codon-optimized SMN1 sequence rescues SMA mice. Human molecular genetics. 20, 681-693 (2011).
  3. Rahim, A. A., et al. Intravenous administration of AAV2/9 to the fetal and neonatal mouse leads to differential targeting of CNS cell types and extensive transduction of the nervous system. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 25, 3505-3518 (2011).
  4. Foust, K. D., et al. Rescue of the spinal muscular atrophy phenotype in a mouse model by early postnatal delivery of SMN. Nat Biotechnol. 28, 271-274 (2010).
  5. Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol Ther. 17, 1187-1196 (2009).
  6. Bostick, B., Ghosh, A., Yue, Y., Long, C., Duan, D. Systemic AAV-9 transduction in mice is influenced by animal age but not by the route of administration. Gene Ther. 14, 1605-1609 (2007).
  7. Miyake, N., Miyake, K., Yamamoto, M., Hirai, Y., Shimada, T. Global gene transfer into the CNS across the BBB after neonatal systemic delivery of single-stranded AAV vectors. Brain research. 1389, 19-26 (2011).
  8. Porensky, P. N., et al. A single administration of morpholino antisense oligomer rescues spinal muscular atrophy in mouse. Human molecular genetics. 21, 1625-1638 (2012).
  9. Hua, Y., et al. Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model. Nature. 478, 123-126 (2011).
  10. Kienstra, K. A., Freysdottir, D., Gonzales, N. M., Hirschi, K. K. Murine neonatal intravascular injections: modeling newborn disease. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 46, 50-54 (2007).
  11. Glascock, J. J., et al. Delivery of therapeutic agents through intracerebroventricular (ICV) and intravenous (IV) injection in mice. J. vis. Exp. (56), (2011).
  12. Sands, M. S., Barker, J. E. Percutaneous intravenous injection in neonatal mice. Laboratory animal science. 49, 328-330 (1999).
  13. Bevan, A. K., et al. Early heart failure in the SMNDelta7 model of spinal muscular atrophy and correction by postnatal scAAV9-SMN delivery. Human molecular genetics. 19, 3895-3905 (2010).
  14. Valori, C. F., et al. Systemic delivery of scAAV9 expressing SMN prolongs survival in a model of spinal muscular atrophy. Science translational medicine. 2, (2010).
  15. Foust, K. D., Poirier, A., Pacak, C. A., Mandel, R. J., Flotte, T. R. Neonatal intraperitoneal or intravenous injections of recombinant adeno-associated virus type 8 transduce dorsal root ganglia and lower motor neurons. Hum Gene Ther. 19, 61-70 (2008).
  16. Guggenbuhl, P., Grosbois, B., Chales, G. Gaucher disease. Joint, bone, spine : revue du rhumatisme. 75, 116-124 (2008).
  17. Daly, T. M., Vogler, C., Levy, B., Haskins, M. E., Sands, M. S. Neonatal gene transfer leads to widespread correction of pathology in a murine model of lysosomal storage disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 2296-2300 (1999).
  18. Daly, T. M., Ohlemiller, K. K., Roberts, M. S., Vogler, C. A., Sands, M. S. Prevention of systemic clinical disease in MPS VII mice following AAV-mediated neonatal gene transfer. Gene Ther. 8, 1291-1298 (2001).
  19. Wang, S. Juvenile neuronal ceroid lipofuscinoses. Advances in experimental medicine and biology. 724, 138-142 (2012).
  20. Forsythe, E., Beales, P. L. Bardet-Biedl syndrome. European journal of human genetics. 21, 8-13 (2013).
  21. Bevan, A. K., et al. Systemic gene delivery in large species for targeting spinal cord, brain, and peripheral tissues for pediatric disorders. Mol Ther. 19, 1971-1980 (2011).
  22. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab animal. 40, 155-160 (2011).
  23. Saunders, N. R., Joakim Ek, C., Dziegielewska, K. M. The neonatal blood-brain barrier is functionally effective, and immaturity does not explain differential targeting of AAV9. Nature biotechnology. 27, 804-805 (2009).
  24. Foust, K. D., et al. Therapeutic AAV9-mediated suppression of mutant SOD1 slows disease progression and extends survival in models of inherited ALS. Mol Ther. 21, 2148-2159 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

AAVGFP
Внутривенных инъекций в новорожденных мышей
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.