Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выражение флуоресцентных белков Branchiostoma lanceolatum По мРНК инъекций в неоплодотворенных ооцитов

10.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52042

⸱

12 января 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Département de Biologie du Développement et Cellules Souches, Institut Pasteur, 2Laboratoire de Biologie du Développement de Villefranche-sur-Mer (UMR7009 CNRS/UPMC Univ Paris 06), Sorbonne Universités, 3Equipe Epigenetic Control of Normal and Pathological Hematopoiesis, Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille, 4Unité de Dynamique des Interactions Membranaires Normales et Pathologiques, CNRS UMR5235/DAA/cc107/Université Montpellier II, 5Plateforme BioEmergences IBiSA FBI, CNRS-NED, Institut de Neurobiologie Alfred Fessard

В этой статье

Краткое содержание

Мы сообщаем здесь надежную и эффективную экспрессию флуоресцентных белков после инъекции мРНК в неоплодотворенные ооциты в Branchiostoma lanceolatum. Развитие техники микроинъекции в этом базальной хордовых проложит путь для далеко идущих технические новшества в этой новой модельной системе, в том числе в естественных изображений и геноспецифических манипуляций.

Аннотация

Мы сообщаем здесь о надежном и эффективном протоколе экспрессии флуоресцентных белков после введения мРНК в неоплодотворенные ооциты головохордового амфиокса, Branchiostoma lanceolatum. Мы используем конструкции для мембранных и ядерных мишеней mCherry и eGFP, которые были модифицированы для учета использования кодона амфиоксуса и консенсусных последовательностей Козака. Мы описываем тип используемых инъекционных игл, протокол иммобилизации неоплодотворенных ооцитов и общую схему инъекции. Этот метод генерирует флуоресцентно помеченные эмбрионы, в которых динамика поведения клеток на ранних этапах развития может быть проанализирована с использованием новейших стратегий визуализации in vivo. Разработка техники микроинъекции у этого вида амфиоксусов позволит проводить визуальный анализ поведения клеток в эмбрионе в режиме реального времени, а также проводить геноспецифические манипуляции, включая сверхэкспрессию генов и нокдаун. В целом, этот протокол еще больше укрепит базальные хордовые амфиоксусы в качестве животной модели для решения вопросов, связанных с механизмами эмбрионального развития и, что более важно, с их эволюцией.

Введение

Во время разработки, одна клетка порождает весь организм в очень сложного процесса, который включает в себя как деления клеток и движений. Чтобы лучше понять биологические принципы, лежащие в основе динамики поведения клеток, онтогенетики начали использовать флуоресценцию на основе методам естественных изображений. Конкретные отделения клеток, такие как клеточные мембраны, либо могут быть помечены с помощью лечения, с флуоресцентными красителями, подход препятствует отсутствие специфичности и проникновения в ткани 1, или конкретной введения в зародыше экзогенных мРНК, кодирующих флуоресцирующие белки 2. Различные методы могут быть использованы для эффективной доставки экзогенных соединений, таких как мРНК. Они включают, но не ограничиваются ими, микроинъекции, электропорации, бомбардировки микрочастицами, липофекция и трансдукции 3,4. Хотя все эти подходы могут быть использованы для введения экзогенных соединений вразвивающегося эмбриона, только микроинъекции позволяет использовать предопределенные и точных количествах в каждой ячейке 3. Методы Микроинъекция были описаны для всех основных моделей развития систем 4 (например, плодовые мушки, нематоды, данио, лягушек, мышей), а также для некоторых альтернативных моделей 4, в том числе те, которые используются для сравнительных исследований, направленных на понимание эволюции механизмов развития (например, морские анемоны, кольчатые черви, морские ежи, асцидии оболочники, Бесчерепные ланцетника).

Cephalochordates, которые вместе с оболочников и позвоночных животных устанавливают хордовых Тип, особенно хорошо подходят модели для изучения эволюции хордовых и диверсификации позвоночных от беспозвоночных предка 5-8. Бесчерепные линия разошлись очень рано в процессе эволюции хордовых; и дошедшие до нас cephalochordates, которые подразделяются на три рода (отрубиchiostoma, Asymmetron и Epigonichthys), напоминают позвоночных как в плане общей анатомии и генома архитектуры 5-8. Из около 30 видов cephalochordates, которые были описаны до сих пор, пять доступны для эмбриологических и развития исследований 6,9: Asymmetron lucayanum (Багамы ланцетника), Branchiostoma floridae (ланцетника Флорида), Branchiostoma lanceolatum (Европейский ланцетника), Branchiostoma belcheri (китайский ланцетника) и Branchiostoma japonicum (Японский ланцетника). Спелые взрослые трех этих видов (B. lanceolatum, Б. belcheri и B. japonicum) может быть вызван на нерест по требованию в течение сезона размножения 10,11. Кроме того, по крайней мере для В. lanceolatum, эффективный нерест может также быть вызван в искусственной морской воде 12, тем самым делая это конкретные виды Бесчерепные доступны для лаборатох годов, которые не имеют доступа к естественной морской воде. Сочетание в В. lanceolatum, удобного и надежного доступа к эмбрионам эффективного способа доставки, таких как микроинъекции, до сих пор единственным методом доставки разработаны в ланцетника (как Б. floridae и Б. belcheri) 13-15, будет способствовать развитию Роман набор манипулятивных техник, в том числе клонов tracing- и поведенческих подходов, основанных на динамический клеток.

Протокол для эффективного микроинъекции мРНК, чтобы выразить флуоресцентные белки в B. lanceolatum эмбрион, следовательно, разработан. Кроме того, для обеспечения базового инструментария для живого изображения В. эмбрионы lanceolatum, векторные системы были разработаны, которые позволяют ассоциированный с мембранами и ядерная выражение флуоресцентных белков. Для мембраны таргетинга, усиленный зеленый флуоресцентный белок (EGFP) был слит с коробкой человека HRAS CAAX и ядерной локализации mCherry и EGFP былополучены путем слияния с данио гистонов 2B (H2B) экзона (рис 1, дополнительном файле 1). Кроме того, с целью оптимизации трансляции белка, последовательности Козака и кодоны конструкций были изменены и приспособлены к использованию в В. lanceolatum. Взятые вместе, методом литья и векторы экспрессии, представленные здесь, служат в качестве основы для создания новых экспериментальных подходов к cephalochordates, в частности, анализ с использованием последней флуоресценции основе в технике естественных изображений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка инструментов и реактивов

  1. Трансфер пипетки Пастера
    1. Создать серию передачи пипетки Пастера с различными диаметрами наконечника, потянув 230 мм в длину пипетки Пастера над пламенем на разных скоростях. Убедитесь, что конус является как можно дольше для плавного и точного контроля аспирации.
    2. С алмазной писца, поцарапать пипетки вдоль линии, перпендикулярной к длине пипетки. С обеими руками, потяните пипетки параллельно его длине, чтобы создать тупой срез. Быстро пламени польский пипетки без уплотнения наконечника.
    3. Вары диаметр наконечника со стадией ооцитов / эмбрионов, которые будут пипеткой: 300-400 мкм для неоплодотворенных яйцеклеток (около 150 мкм в диаметре), 600 мкм для оплодотворенных яиц (около 500 мкм в диаметре), 200-400 мкм для заштрихованной neurulae. Используйте пипетки со ртом-контроль аспирации трубки для передачи ооцитов / эмбрионов из одной тарелкис другой.
  2. Иглы для инъекций
    1. Манипулировать капилляры перчатки, чтобы обеспечить РНКазы условия. Используйте боросиликатного стекла с накаливания капилляров с размерами OD 1,20 мм, ID 0,94 мм, длина 10 мм.
    2. Если капилляры вытащил от типа нагрева нити иглы съемника, описанной в список материалов, используйте следующие параметры: Heat 600, Pull 50, скорость 80, 60 Время, давление 200 или 300. В противном случае, убедитесь, что форма, которая является решающее значение для успешных инъекций, выглядит, как показано на рисунке 2 со следующими свойствами: 4-8 мкм Наружный диаметр наконечника, 2 см длиной заостренной.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Иглы могут быть выведены до нереста и используется на протяжении всего сезона.
  3. 5% Фенол красный раствор (4x)
    1. Подготовка свежий перед каждым нереста.
    2. В мкм-фильтрации трубки 0,22, взвесить 25 мг фенола красного порошка.
    3. Добавить 0,5 мл DNase- и РНКазы свободной воды длятрубка, содержащая порошок.
    4. Спин в течение 3-5 мин при 18000 х г при комнатной температуре, фильтруют, стерилизуют раствор и удалить кристаллы, которые могут засорить инъекционной иглой.
    5. Хранить при 4 ° С или хранить 250 мкл аликвотах при -20 ° С.
  4. 0,25 мг / мл поли-лизина раствор
    1. Подготовка свежий перед каждым нереста.
    2. Растворите 5 мг поли-L-лизина в 20 мл дистиллированной воды. Магазин 5 мл аликвоты при -20 ° С.
    3. Использование сразу размороженный аликвоты и только один раз, чтобы гарантировать воспроизводимое и надежное сцепление ооцитов к поли-лизин покрытием блюдо.
  5. синтез мРНК
    1. Подготовка свежий перед каждым нереста.
    2. Линеаризовать 5 мкг ДНК интереса с адекватной фермента (как правило, в течение 2 часов, при 37 ° С). Чтобы проверить полноту пищеварения, запустите 2% в объеме пищеварения смеси на 1% агарозном-TBE геля в КЭ буфера при 150 Вт в течение 20 мин.
    3. Извлеките Lineaавторизованного ДНК с 25: 24: 1 фенол (рН 8,0): хлороформ: изоамиловый спирт. Vortex в течение 20 секунд, центрифуги 10 мин при 18000 мкг и собрать водную (верхнюю) фазу.
    4. Экстракт водную фазу снова 24: 1 хлороформ: изоамиловый спирт. Вихревые в течение 20 сек, центрифуги 10 мин при 18000 х г и собирают водную фазу.
    5. Осадок линеаризованной ДНК с 100: 10: 300, линеаризованной ДНК: 3 М ацетата натрия (рН 5,2): 100% этанола в течение ночи при -20 ° С.
    6. Центрифуга 20 мин при 18000 х г при 4 ° С. Промыть в 70% этаноле.
    7. Центрифуга 10 мин при 18000 х г при 4 ° С. Пусть сухой и ресуспендируют в РНКазы свободной воды в конечной концентрации 0,5 мкг / мкл.
    8. Расшифруйте 1 мкг линеаризованной ДНК с использованием мРНК синтез комплект с соответствующей полимеразы, в соответствии с инструкциями изготовителя.
    9. Выписка мРНК с 5: 1 фенола (рН 4,7): хлороформ и этилацетат аммония универсальное решение, входящие в комплект.
    10. Vortex в течение 20 секунд, CEntrifuge 10 мин при 18000 х г и собирают водную фазу.
    11. Экстракт водную фазу снова 24: 1 хлороформ: изоамиловый спирт. Вихревые в течение 20 сек, центрифуги 10 мин при 18000 х г и собирают водную фазу.
    12. Осадок мРНК с 100% изопропанола в течение ночи при -20 ° С.
    13. Центрифуга 20 мин при 18000 х г при 4 ° С. Промыть в 80% этанола.
    14. Центрифуга 10 мин при 18000 х г при 4 ° С. Пусть гранул высохнуть при комнатной температуре не более чем на 5-10 мин, как тогда будет трудно ресуспендирования. Ресуспендируют в DNase- и РНКазы воды до конечной концентрации по меньшей мере 2 мкг / мкл, чтобы обеспечить достойное конечной концентрации мРНК в смеси инъекции.
    15. Для проверки качества и размер транскрипции продукта, работать 0,5 мкл мРНК на РНКазы 1% агарозном-TBE гель в TBE буфере при 150 Вт в течение 20 мин. Магазин 2 мкл аликвоты при -80 ° С.
  6. Поли-лизин-покрытием блюда
    Примечание: поли-лизин-СоА-Тед блюда используется для иммобилизации ооцитов во время инъекции.
    1. Для каждого 35 мм клеток культуральной чашке Петри (5) в целом, покрывают дно чашки Петри с 1 мл талой 0,25 мг / мл поли-лизин раствора. Инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин.
    2. Для каждого 35 мм культивирования клеток Петри (всего 5), передача 0,25 мг / мл поли-лизин раствор в другой 35 мм культивирования клеток Петри. Инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин.
    3. Откажитесь от 0,25 мг / мл поли-лизин решение.
    4. Пусть чашки Петри сухой, вверх-вниз при комнатной температуре в течение 2 часов.
    5. Хранить поли-лизин покрытием блюда, завернутый в полиэтиленовую пленку при 4 ° С, чтобы избежать загрязнения в течение одной недели максимум.
  7. Агарозные покрытием блюда
    ПРИМЕЧАНИЕ: Они используются для культивирования вводили эмбрионов. Агарозы обеспечивает подушку для инъекции эмбрионов и предотвращает их прилипание к нижней части блюда.
    1. Сделать искусственное морской воды (ASW) с помощью 37-38 г / л коммercial соли + 0,25 мм NaHCO 3 в обратного осмоса воды.
    2. Растворить агарозы с концентрацией 1% в 0,22 мкм фильтровали ASW нагреванием раствора в микроволновой печи.
    3. Быстро влить теплую раствора агарозы с одной 35 мм чашки Петри в другую, чтобы обеспечить очень тонкий агарозном покрытие тарелки.
    4. Хранить в агарозном покрытием блюда, завернутые в Saran Wrap при 4 ° С, чтобы избежать загрязнения в течение одной недели максимум.
  8. Смесь для инъекций и погрузка инъекционных игл
    1. Около 2 ч до начала инъекции, сделать 2 мкл смеси для инъекций в RNase- и ДНКазы бесплатно воду с конечной концентрации 1-1,8 мкг / мкл мРНК, 15% глицерина, 1,25% фенола красного.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фенол красный цвета раствора, который позволяет осуществлять мониторинг эффективности впрыска и идентификации успешно вводили эмбрионов. Глицерин способствует мРНК диффузии в яйцеклетки.
    2. Центрифуга 4 мин при 18000 мкг напеллетах кристаллы. Держите на льду до использования.
    3. С 10 мкл пипетки, собирают 0,5 мкл смеси для инъекций, избегая дно трубки, где кристаллы были гранулированной.
    4. Засыпка по меньшей мере, две иглы для инъекций (в случае, если один перерывы во время инъекции) с помощью пипетки капли 0,5 мкл инъекции смеси на большое отверстие от иглы.
    5. Установка иглы в запоминающем банку с жидкостью в нижней части при 4 ° С, чтобы предотвратить испарение смеси инъекции. Пусть смесь медленно инъекции поездки в кончике инъекционной иглой, по крайней мере, 1 часа, чтобы свести к минимуму образование пузырьков.
    6. Магазин дополнительное соединение впрыска при -80 ° С в течение не более трех дополнительных применений, после чего качество ухудшается мРНК (данные не показаны).

2. Сбор биологического материала, микроинъекции и культивирования эмбрионов

  1. Яйцеклетка и сперматозоид коллекция
    ПРИМЕЧАНИЕ: См Theodosiouи др. 12 для детального протокола для индукции нереста и для сбора гамет.
    1. Ударные мужчины и женщины в ASW при температуре 23 ° С в течение 24 ч.
    2. Один-два часа до захода солнца, передают взрослых в отдельные чашечки в ASW на 19 ° С, так как большинство взрослых будут появляться 1-2 часа после захода солнца.
    3. Промыть 35 мм чашки Петри с фильтром ПАВ и дайте им высохнуть в обратном порядке, чтобы предотвратить ооциты от прилипания к нижней части блюда.
    4. По нереста, немедленно собрать сперму и яйцеклетки с 1000 мкл пипетки.
      1. Хранить сперму и ооциты отдельно от взрослых Amphioxus поскольку контакт является вредным для здоровья гамет (данные не показаны).
      2. Кроме того, не вспугнуть взрослых, что приводит к движениям, которые рассеивают, и, следовательно, разбавить, как сперматозоиды и яйцеклетки. Чтобы сохранить сперму активным до тех пор, насколько это возможно, и для оптимизации скорости оплодотворения, сбора спермы, как концентрируют, насколько это возможно.
    5. Держатьспермы на льду в 1,5 мл пробирку.
    6. Трансфер ооциты с фильтром ПАВ в предварительно промыть 35 мм чашки Петри.
    7. Передача 100-500 ооцитов с передачи пипетки Пастера ранее вытащил 300-400 мкм, еще 35 мм чашки Петри для выполнения инъекций.
    8. Оплодотворите остаток муфты в качестве контроля для спермы и качества ооцитов или для других экспериментов.
  2. Инъекции ооцитов
    1. Установка инъекционной иглы на микроманипулятором на 50 ° по отношению к горизонтальной плоскости.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Углы менее 50 ° подтолкнет ооциты вокруг на блюдо, в то время как углы более 50 ° не позволит соответствующий контроль за положением иглы по отношению к яйцеклетке.
    2. Под флуоресцентным рассекает рамки с 25x окулярами, трансфер 30 ооцитов с передачей пипетки Пастера 300-400 мкм на поли-лизин покрытием чашки с фильтрованной ASW.
    3. Депозит ооциты вдоль линии для выполненияиз инъекции в упорядоченном пути и отличить впрыскивается из неинъекционные ооцитов. Вводят небольшое количество (30 ооцитов), чтобы минимизировать время экспозиции ооцитов с поли-лизина, который имеет тенденцию к деформации развивающихся эмбрионов (данные не показаны).
    4. Используйте темного поля, чтобы сделать ооциты как полупрозрачные, насколько это возможно.
    5. С грубой движения ручки на микроманипулятора, довести инъекционной иглы близко к яйцеклетке.
    6. С тонким пинцетом, разрезать иглу на уровне, где наконечник начинает быть изогнуты. По пульсирует с инжектором, убедитесь, что красный смесь инъекции на самом деле течет из иглы.
    7. В 200-кратное увеличение и тонкой движения ручки на микроманипулятора, осторожно двигаться инъекционной иглы внутри ядра ооцита.
      ПРИМЕЧАНИЕ: при слишком поверхностно, вводят решение не будет оставаться внутри яйцеклетки. Если вставлена ​​слишком далеко, яйцеклетка будет уничтожен.
    8. Вводите 1-3 импульсов 120 мс duratионов и 1-10 давление фунтов на квадратный дюйм. Если игла достаточно хорошо, придать с непрерывным потоком при постоянном давлении. Убедитесь, что объем инъекции соответствует 1/5 до 1/3 объема одного ооцита.
    9. После инъекции, вытащите иглу быстро, чтобы избежать утечки яйцеклетки.
    10. Убедитесь, что введен раствор остается в яйцеклетке и что после нескольких секунд, вводят раствор распространяется по всему яйцеклетки.
    11. Переходите к следующему яйцеклетки в очереди.
    12. Держите некоторые неинъецированных эмбрионов каждой серии в качестве отрицательного контроля для оценки фоновой флуоресценции при сканировании введенных эмбрионов.
  3. Оплодотворение, выбор инжектированных эмбрионов и культивирования эмбрионов
    1. Оплодотворить яйцеклетки, как только серия была введена. Поскольку качество яйцеклеток снижается со временем, внедрить и оплодотворить яйцеклетки в течение 1 ч после нереста 12.
    2. В зависимости от концентрации сперматозоидов, добавить 1-5 капли спермы и ооцитоввихревой блюдо.
      ПРИМЕЧАНИЕ: оплодотворение конверт должен стать очевидными на зародышах примерно через 1 мин.
    3. Разрешить эмбрионов для отсоединения от поли-лизин покрытием блюдо, при введении очередную серию ооцитов.
    4. Трансфер эмбрионов с мкм передачи пипетки Пастера 600 в агарозном покрытием чашке Петри. Удалить эмбрионов из поли-лизин покрытием блюдо как можно быстрее, если это вообще возможно до стадии 2-клеток.
      Примечание: В случае длительного воздействия поли-лизина, эмбрионы имеют тенденцию становиться плотно упакованы blastulae, плоские на стороне касаясь дно тарелки.
    5. В 2-клетки до 4-клетки шаге выберите флуоресцентным рассекает рамки с DSR фильтровать успешно впрыском эмбрионов, то есть те, с нормальной морфологией, которые проявляют фенол красный производный красный сигнал флуоресцентного.
    6. Держите эмбрионов в культуре с фильтром ПАВ в агарозном покрытием чашки Петри при 19 ° до нужной стадии дляв естественных изображений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Протокол подробно выше, обеспечивает основу для микроинъекции В. lanceolatum ооциты и, следовательно, для введения в разработке В. lanceolatum эмбрионы мРНК, кодирующей флуоресцентные белки для визуализации в естественных условиях. Хотя этот метод, безусловно, прочный и надежный, скорость успешных инъекций с использованием этого протокола остается переменной (таблица 1). Очень вероятным объяснением этого интригующего факта крайняя изменчивость ооцитов лап: разные партии яйца д...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этой статье мы представляем, впервые, подробный и воспроизводимый протокол для инъекций В. lanceolatum ооциты, которые, после B. floridae 13,14 и B. belcheri 15, таким образом, что третий вид Amphioxus, для которых такой способ был описан. Важно отметить, что протокол, описанный здесь, также включает в себя описание векторных систем подходит для производства флуоресцирующих белков в B. lanceolatum от вводили мРНК, полученных в пробирке (описано ниже). ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы хотели бы выразить признательность за поддержку со стороны "Animalerie центрального де Gif-сюр-Иветт" для животноводства. Эта работа была поддержана за счет средств ANR (ANR-09-BLAN-0262-02 и ANR-11-JSV2-002-01) с Майклом Шуберта, за счет гранта Европейского Союза 6РП "Embryomics" и грантом ANR "ANR- 10-BLAN-121801 Dev-Process "Жан-Франсуа Николя и Надин Peyriéras. João Emanuel Карвалью финансируется за счет исследовательских стипендий FCT (SFRH / BD / 86878/2012).

Заявки на векторы, описанные здесь могут быть адресованы непосредственно авторами.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Consumables
35 мм чашки ПетриFalcon353001Culture-trained
Filtration Unit (Stericup 1 L)FisherW217190.22 μ m
Spin-X tubesCostar81600.22 μ m
Игольчатая банка для капилляров диаметром 1,2 ммWPIE212
Пипеткидлиной 230 мм
Аспирационная трубкаDutscher75056
Капилляры для инъекционных иглSutterBF 120-94-10Боросиликатное стекло с нитью, наружный диаметр 1,20 мм, внутренний диаметр 0,94 мм, длина 10 мм
Reagents
Легкоплавкая агарозаSigmaA9414
Фенол красныйСигма114537
глицеринSigmaG2025
Поли-L-лизина гидробромидSigmaP9155
H2O, ДНКаза/РНКаза безGibco10977-035
mMessage mMachine SP6 Набордля транскрипцииAmbionAM1340набор для синтеза мРНК
фенол pH 8SigmaP4557
24:1 хлороформ:изоамиловый спиртSigmaC0549
5:1 фенол pH 4,7:хлороформSigmaP1944
рифовые кристаллические соли (200 кг)Europrix Коммерческие соли
NaHCO3SigmaS6014
Equipment
Флуоресцентный препарирующий прицел с 200-кратным увеличениемокуляры LeicaMZ16F25X, фильтры DSR и GFP2
микроманипуляторMarzhauzerM-33
инжекторPicospritzerмодель II или III
ИглосъемщикSutterP97Нагревательный иглосъемщик
Тонкие щипцыFine Science Tools GmbH11252-30Dumont #5
Пастера , ,,

Ссылки

  1. Weber, T., Köster, R. Genetic tools for multicolor imaging in zebrafish larvae. Methods. 62, 279-291 (2013).
  2. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends. Cell. Biol. 20, 380-390 (2010).
  3. Zhang, Y., Yu, L. C. Microinjection as a tool of mechanical delivery. Curr. Opin. Biotechnol. 19, 506-510 (2008).
  4. Stepicheva, N. A., Song, J. L. High throughput microinjections of sea urchin zygotes. J. Vis. Exp. , e50841(2014).
  5. Schubert, M., Escriva, H., Xavier-Neto, J., Laudet, V. Amphioxus and tunicates as evolutionary model systems. Trends Ecol. Evol. 21, 269-277 (2006).
  6. Bertrand, S., Escriva, H. Evolutionary crossroads in developmental biology: amphioxus. Development. 138, 4819-4830 (2011).
  7. Holland, L. Z. Evolution of new characters after whole genome duplications: insights from amphioxus. Semin. Cell Dev. Biol. 24, 101-109 (2013).
  8. Lemaire, P. Evolutionary crossroads in developmental biology: the tunicates. Development. 138, 2143-2152 (2011).
  9. Yu, J. K., Holland, L. Z. Cephalochordates (amphioxus or lancelets): a model for understanding the evolution of chordate characters. Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
  10. Fuentes, M., et al. Insights into spawning behavior and development of the European amphioxus (Branchiostoma lanceolatum). J. Exp. Zool. B. 308, 484-493 (2007).
  11. Li, G., Shu, Z., Wang, Y. Year-round reproduction and induced spawning of Chinese amphioxus, Branchiostoma belcheri, in laboratory. PLoS One. 8, e75461(2013).
  12. Theodosiou, M., et al. Amphioxus spawning behavior in an artificial seawater facility. J. Exp. Zool. B. 316, 263-275 (2011).
  13. Holland, L. Z., Yu, J. K. Cephalochordate (amphioxus) embryos: procurement, culture, and basic methods. Methods Cell Biol. 74, 195-215 (2004).
  14. Holland, L. Z., Onai, T. Analyses of gene function in amphioxus embryos by microinjection of mRNAs and morpholino oligonucleotides. Methods Mol. Biol. 770, 423-438 (2011).
  15. Liu, X., Li, G., Feng, J., Yang, X., Wang, Y. Q. An efficient microinjection method for unfertilized eggs of Asian amphioxus Branchiostoma belcheri. Dev. Genes Evol. 223, 269-278 (2013).
  16. Harvey, K. J., Lukovic, D., Ucker, D. S. Membrane-targeted green fluorescent protein reliably and uniquely marks cells through apoptotic death. Cytometry. 43, 273-278 (2001).
  17. Maruyama, J., Nakajima, H., Kitamoto, K. Visualization of nuclei in Aspergillus oryzae with EGFP and analysis of the number of nuclei in each conidium by FACS. Biosci. Biotechnol. Biochem. 65, 1504-1510 (2001).
  18. Rupp, R. A., Snider, L., Weintraub, H. Xenopus embryos regulate the nuclear localization of XMyoD. Genes Dev. 8, 1311-1323 (1994).
  19. Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes Dev. 8, 1434-1447 (1994).
  20. Nakagawa, S., Niimura, Y., Gojobori, T., Tanaka, H., Miura, K. Diversity of preferred nucleotide sequences around the translation initiation codon in eukaryote genomes. Nucleic Acids Res. 36, 861-871 (2008).
  21. Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. Codon usage tabulated from international DNA sequence databases: status for the year 2000. Nucleic Acids Res. 28, 292(2000).
  22. Deheyn, D. D., et al. Endogenous green fluorescent protein (GFP) in amphioxus. Biol. Bull. 213, 95-100 (2007).
  23. Schubert, M., et al. Retinoic acid signaling acts via Hox1 to establish the posterior limit of the pharynx in the chordate amphioxus. Development. 132, 61-73 (2005).
  24. Schubert, M., Holland, N. D., Laudet, V., Holland, L. Z. A retinoic acid-Hox hierarchy controls both anterior/posterior patterning and neuronal specification in the developing central nervous system of the cephalochordate amphioxus. Dev. Biol. 296, 190-202 (2006).
  25. Yu, J. K., Holland, N. D., Holland, L. Z. Tissue-specific expression of FoxD reporter constructs in amphioxus embryos. Dev. Biol. 274, 452-461 (2004).
  26. Beaster-Jones, L., Schubert, M., Holland, L. Z. Cis-regulation of the amphioxus engrailed gene: insights into evolution of a muscle-specific enhancer. Mech. Dev. 124, 532-542 (2007).
  27. Holland, L. Z., et al. The amphioxus genome illuminates vertebrate origins and cephalochordate biology. Genome Res. 18, 1100-1111 (2008).
  28. Urasaki, A., Mito, T., Noji, S., Ueda, R., Kawakami, K. Transposition of the vertebrate Tol2 transposable element in Drosophila melanogaster. Gene. 425, 64-68 (2008).
  29. Li, G., et al. Mutagenesis at specific genomic loci of amphioxus Branchiostoma belcheri using TALEN method. J. Genet. Genomics. 41, 215-219 (2014).
  30. Zhang, Q. J., et al. Continuous culture of two lancelets and production of the second filial generations in the laboratory. J. Exp. Zool. B. 308, 464-472 (2007).
  31. Yasui, K., Igawa, T., Kaji, T., Henmi, Y. Stable aquaculture of the Japanese lancelet Branchiostoma japonicum for 7 years. J. Exp. Zool. B. 320, 538-547 (2013).
  32. Benito-Gutiérrez, E., Weber, H., Bryant, D. V., Arendt, D. Methods for generating year-round access to amphioxus in the laboratory. PLoS One. 8, e71599(1371).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

in vivo
Выражение флуоресцентных белков Branchiostoma lanceolatum По мРНК инъекций в неоплодотворенных ооцитов
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.