Определение концентрации вируса через бляшки Анализы: используя традиционные и новейшие системы Наложение

Краткое содержание

Анализы бляшек являются золотым стандартом для количественного определения вирусов, используя захватывающие наложения на монослои клеток хозяина для определения титров вируса. В то время как традиционно использовались различные полутвердые накладки, здесь мы демонстрируем методы нанесения бляшек, сравнивая полутвердые накладки с новой жидкой микрокристаллической целлюлозой из нескольких семейств вирусов.

Аннотация

Зубной налет анализы остаются одним из наиболее точных методов прямого количественного определения инфекционных вирионов и противовирусных веществ через подсчета дискретных бляшек (инфекционных единиц и клеточных мертвых зон) в клеточной культуре. Здесь показано, как выполнить основную бляшек, и как отличающиеся накладки и методы могут повлиять образование зубного налета и производства. Обычно твердые или полутвердые наложения субстраты, такие как агароза или карбоксиметилцеллюлоза, были использованы, чтобы ограничить распространение вируса, предотвращая неразборчивое инфекцию через жидкую среду роста. Иммобилизованные накладки ограничить сотовой инфекции в непосредственно окружающей монослоя, что позволяет формирование дискретного счетного очагов и последующего образования бляшек. Чтобы преодолеть трудности, связанные с использованием традиционных накладки, роман жидкость наложения использования микрокристаллической целлюлозы и натрий карбоксиметилцеллюлозу все чаще используется в качестве замены в стандартебляшек. Жидкие наложения налета анализы могут быть легко выполнены либо в стандартных 6 или 12 форматов а пластины в соответствии с традиционными методами и не требуют специального оборудования. Из-за его жидком состоянии и последующей легкости применения и удаления, форматы микрокультуры пластины, альтернативно, может быть использован в качестве быстрого, точного и высокой пропускной альтернативы большего масштаба вирусных титрования. Использование не нагретой вязкой жидкости полимера дает возможность упростить работу, экономит реагенты, инкубатор пространство, и повышает безопасность работы при использовании в традиционных или высоких сдерживания лабораториях как без отопления реагента или стеклянную посуду, необходимые. Жидкие накладки могут оказаться более чувствительными, чем традиционные накладками для некоторых термолабильный вирусов.

Введение

Точная изоляция и количественное определение жизнеспособных вирусных образцов неизменно продолжающееся исследование цель в вирусологии. Он не был до появления бляшек в 1952, что является средством количественно и качественно рассчитать животных вирусные титры впервые была разработана ^1,2. Эта техника была впервые адаптирована и изменена с фага анализов, которые ранее были использованы для расчета титры фондовых бактериофагов в биологии растений ^1,2. В то время как альтернативные средства для количественного определения вирусной тех пор были разработаны и адаптированы, таких как иммунологические анализы, флуоресценции и просвечивающей электронной микроскопии, перестраиваемого зондирования резистивный импульса (TRPS), проточной цитометрии, рекомбинантные репортерных систем, и количественный ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР Qrt) эти методы не в состоянии идентифицировать и количественно репликации компетентных вирионов ^1,3. В то время как прогресс в технологиях и методах продолжать совершенствовать и изменять ландшафт; plaquе анализы по-прежнему представляют золотой стандарт в определении вирусных концентрации инфекционных литических вирионов ^1,4.

Во время анализа бляшек, сливающийся монослой клеток-хозяев, заражен литической вируса неизвестной концентрации, которая была серийно разведенной в счетной диапазоне, как правило, от 5-100 вирионов. Инфицированные монослои затем покрыта накладываемого иммобилизации среды, чтобы предотвратить вирусную инфекцию от распространения через разбора либо механического или конвекционного потока жидкой среды в процессе размножения вирусов. В то время как твердые или полутвердые накладки, такие как агароза, метилцеллюлозы или карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) традиционно использовались, жидкие накладки становятся все более привлекательной альтернативой с развитием новых жидких накладками, такие как Avicel ^{5- 7.} Зубной налет анализы, использующие жидкий по сравнению с традиционными накладками имеют ряд преимуществ, как наложение может быть заявлварьировали при комнатной температуре, и приложения и снятия значительно легче. Как жидкие накладки не требуют потепления, нежные и термолабильный вирусы могут также оказаться проще бляшки.

После первичного инфицирования и применения иммобилизирующим наложения, отдельных бляшек или зон гибели клеток, начнет развиваться как вирусная инфекция и репликации ограничены в окружающую монослоя. Зараженные клетки будут продолжать цикл репликации лизис-инфекции, в дальнейшем распространяясь инфекцию, в результате чего все больше и больше различных и дискретных бляшек. В зависимости от вирусной кинетики роста и используемой клетки-хозяина, видимый налет, как правило, образуют в течение 2-14 дней. Сотовые монослои могут быть затем подсчитывали с помощью стандартной светлой поле микроскопа, или более, как правило, фиксированной и контрастному по нейтрального красного или кристалла насильственных для того, чтобы легко идентифицировать бляшки невооруженным глазом. Есть большое разнообразие доска встречных пятен доступны, каждый предлагая йОДП конкретные преимущества и недостатки. Кристалл фиолетового обычно добавляют в точке сбора и после фиксации / снятия накладки, обеспечивая быстрый и отчетливый счетчик пятно, который позволяет для идентификации очень маленьких бляшек при смешанной морфологией присутствует. Обычный красный имеет преимущество раннего применения и постоянном контакте с накладкой, что позволяет для мониторинга в реальном времени разработки образование бляшек, что особенно полезно при работе с неизвестным вирусом или репликации кинетики. Мы, однако, обнаружили, что окрашивание, как правило, не в отличие при использовании нейтрального красного. 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) тетразолия бромид -2,5-дифенил (МТТ) дает несколько преимуществ, как желтые пятна цветные красители живые клетки темно-синий и вирусные бляшки можно пересчитать без удаления верхнего слоя, как с нейтральным красным. Высокая контрастность между живыми и мертвыми клетками предоставляемых МТТ также позволяет обнаружить небольшие бляшки в более раннем времени точка после заражения, Хотя хранение будет по-прежнему требовать удаления верхнего слоя ^8. Как кристаллический фиолетовый можно просто выполнен в растворе воды и спирта, и обеспечивает высокую степень чувствительности к смешанной морфологией бляшек, мы выбрали его в качестве предпочтительного, и упрощенной счетчика пятно на протокол продемонстрировал, как мы используем несколько семейств хорошо охарактеризованные вирусы.

После фиксации и окрашивания зараженный клеточный монослой, бляшки подсчитываются, чтобы титровать образцы вирусов запаса по бляшкообразующих единиц (БОЕ) на миллилитр. Падение журнала Следует отметить, между серийных разведений и, в зависимости от размера пластины, между 5-100 бляшек, с отрицательным контролем, используемого в качестве ссылки. Статистически образцы будут меняться на 10% на каждые 100 бляшек при сравнении образца повторяет ^3. Преимущество использования зубной налет анализов для определения вирусные титры заключается в их способности для количественного определения фактического количества инфекционных вирусных частиц Within образца. Как несколько вирионы могут потенциально заразить одну ячейку, терминология единиц по сравнению с вирионов используется во время налета титрования ^1,2.

Налет морфология может варьироваться резко при различных условиях роста, а также между вирусных видов. Налет размер, четкость, определение границы, и распространение все должны быть отмечены как они могут предоставить ценную информацию о росте и факторов вирулентности вируса в вопросе.

Основные принципы анализа бляшек также могут быть адаптированы и модифицированы различными способами, например, в использовании фокус формирования анализов (FFAs). FFAs не полагаться на лизиса клеток и counterstaining обнаружить образование бляшек, а использовать иммуноокрашивания методы непосредственно обнаружить внутриклеточные белки вируса через меченых антител. Повышенная чувствительность, снижение времени инкубации после заражения, а главное способность количественного без литические вирусы все различныПреимущества при использовании FFAs. В то время как широко используется, критические факторы, ограничивающие в FFAs по сравнению с традиционным методом бляшек заключается в необходимости соответствующих антител и способностью только зонд для белковых субъединиц вируса по сравнению с фактическим инфекционных вирионов ^4.

Для целей данного исследования, мы ограничим наше обсуждение классических налета анализов и описывают применение традиционных твердых и полутвердых накладками (агарозы и СМС), наряду с новыми жидкость микрокристаллических накладками целлюлозы.

Протокол

1. Подготовка клеток и реактивов

1. День до теста, пластины соответствующих клеток-хозяев для вируса в вопросе (таблица 1 и 2) в 90 - 100% слияния.
2. Подготовка фиксирующий раствор 10% формальдегида в дН ₂ O. В примере, смешать 5,56 мл 36% акций формальдегида с 14,44 мл дистиллированной H ₂ O (DH ₂ O).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте практика обращения соответствующих безопасных и вентиляция при помощи формальдегида.
3. Подготовка кристаллическим фиолетовым пятном: 1% кристаллическим фиолетовым (CV) в 20% -ном этаноле и Д. ₂ O.
4. Подготовьте 2x бляшки носителя (тип клеток зависимую при концентрации 2 х; смотри Таблицу 2). Фильтр с использованием 0,2 мкм фильтр, если какие-либо реагенты не стерильны.
5. Подготовка иммобилизовать накладками (Таблица 3)
   1. Для жидких накладками, сделать стерильный 2,4% раствор Avicel в дН ₂ O. Для предотвращения образования комков, добавить порошок в колбу, содержащую воду йна быстро смешивания с мешалкой, заливают в Avicel медленно и быстро перемешивают при комнатной температуре (RT). Когда раствор окажется слишком вязким для мешальник до гомогенизации, переключиться на колбу шейкера для> 30 мин с тяжелой агитации для обеспечения равномерного гомогенизации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: растворы могут быть сделаны при более низких концентрациях, но решения могут отделить и нужно будет ремикс для обеспечения гомогенизации. Рабочие растворы Avicel могут быть использованы в пределах от 0,6-3%.
   2. После гомогенизации, автоклав решение и магазин запечатанный в РТ.
   3. Для агарозы и карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ) накладок, подготовить маточного раствора в дН ₂ O 2% КМЦ или 0,6% агарозы. Смешать с мешалкой и автоклав или микроволновой печи, чтобы привести в раствор.

2. Растворы и инфекции

1. На следующий день после посева, визуально проверить слияния и жизнеспособность клеток до начала анализа. Убедитесь, стандартный клеточной морфологии Aй ~ 90% сливной монослоя присутствует.
2. Выполните десятикратное серийное разведение инфекционных образцов. С помощью сотового питательной среды для размножения вирусов в качестве разбавителя (таблица 2). Вары число разведений необходимых на основе ожидаемой титра вируса в вопросе, и всегда использовать неинфицированных контрольного образца самостоятельно обеспечить сотовой жизнеспособность и помощь в идентификации бляшек.
3. Из серийных разведений, инфицировать клетки в течение 45 мин до 1 ч (таблица 1). Используйте достаточный объем посевного материала для покрытия ячейки, при сохранении объема как можно ниже, чтобы максимально увеличить контакт с вирусной монослоя (таблица 4). Аккуратно каменные плиты каждые 20 мин, чтобы обеспечить даже освещение и предотвратить сотовой монослоя от высыхания.
4. После инфекции, накладывать соответствующий объем иммобилизации среды непосредственно к посевного в скважине (таблица 2) с использованием 1: 1 смесь 2x зубного налета средств массовой информации и immobilizчисле наложение выбора (CMC, агарозы или Авицел). Осторожно перемешать.
   1. Для жидких накладками, смешать 1: 1 с утепленным 2x налета СМИ и 1.2 - 2.4% RT фондовом Avicel получить рабочий раствор 0,6-1,2% Avicel наложения среды.
   2. Для агарозном наложения, использовать 1: 1 смесь утепленных 2x налета СМИ и исходного раствора с подогревом 0,6% агарозы, место в 56 ° С водяной бане в течение 30 мин, чтобы уравновесить температуру получения конечной концентрации агарозы / наложения 0.3 %.
   3. Для КМЦ, подготовить 2% исходного раствора и лечения, как описано в агарозном наложения.
   4. При применении накладку на монослое, всегда в равновесие горячей агарозы или CMC в 56 ° C водой, чтобы предотвратить повреждение монослое. Убедитесь решение теплая, но не горячая на ощупь, чтобы предотвратить гибель клеток и снижение вирусные титры. Большинство агарозные накладки начнет затвердевать ниже 42 ° С, работать быстро и / или подготовить небольшие партии для предотвращения затвердевания при работе.
5. После добавления оверлея, инкубировать пластин для производства различных бляшки, которые явно счетно. Налет формирование может занять 2-14 дней в зависимости от вируса анализируются, таблицу 1.
   Примечание: После того, как жидкие накладными пластины помещают в инкубатор, не перемещать их. Движение жидкости накладок в течение инкубационного периода приведет к размытыми бляшек. Агарозные и CMC пометки полутвердые и могут быть перемещены или периодически проверять под световым микроскопом, чтобы контролировать развитие бляшек.

3. Крепление и окрашивания клеток

1. Для фиксации клеток, слить или аспирации наложение Avicel, и исправить клетки с помощью 10% -ного раствора формальдегида в течение 30 мин, чтобы в течение ночи (<1 мл на лунку для луночного планшета в 6).
   1. Для агарозы или CMC, непосредственно добавить раствор формальдегида в накладкой в ​​течение 1 часа в ночь.
      Примечание: Образцы могут храниться в течение длительного периода времени в фиксаторе условии, что он делаетне испаряются и высыхают, как это может исказить монослой.
2. До окрашивания и после фиксации, отбросить формальдегид и удалить полутвердые заглушки для агарозы и КМЦ с проточной водой или вручную, или с помощью шпателя. Промыть Avicel бляшки с водой, чтобы удалить остатки наложения / фиксатор перед окрашиванием.
3. Для окрашивания, покрывают клетки с минимальным количеством кристаллического фиолетового раствора в течение ~ 15 мин. Рок плиты при необходимости обеспечить равномерное покрытие.
4. Аккуратно смойте кристаллическим фиолетовым пятном водой. После того, как фиксированной, окрашенных, и сушат, магазин бляшки на неопределенный срок для последующего анализа.

4. Определение титров вируса

1. Граф бляшки в каждую лунку, взяв среднее за любые технические повторов одного и того же разведения. Для больших форматов пластин, скидка скважин с менее чем 5 или больше 100 бляшек. Принять к сведению размер бляшек и морфологии. Отрицательный контроль должен иметь равномерный монослой иможет быть использован в качестве контроля опорной.
2. Определить титр вируса на фондовом образца, принимая среднее число бляшек для разбавления и обратного общего коэффициента разбавления.

Примечание: В качестве примера, 30 и 32 бляшек для повторах в 1 х 10 ^-7 разведений [31 (в среднем) 10 / ^-7 (разведение) х 0,4 мл (инокулята)] даст титр 7,75 х 10 ⁸ БОЕ / мл.

Результаты

Способность налета анализов, чтобы точно оценить вирусные титры опирается на многочисленных факторов: соответствующим выбором клетки-хозяина, соответствующих средствах массовой информации и условий роста для сотовых и вирусной жизнеспособности, иммобилизованной вирусного распространения, и точное определение вирусной инкубационного периода, чтобы обеспечить достаточное время для различны и формирование счетная доска.

Для этого исследования, вирусы из трех представительных семей были выбраны, чтобы продемонстрировать различия в: наложения отбора, инкубационных периодов, и бляшки морфологии по всей различными типами образцов. Венесуэльский лошадиный энцефалит (VEEV) был выбран в качестве (+) ssRNA вирусной модели, которые могут нанести значительный болезни в лошадиных видов и человека и представляет семью Togaviridae. Грипп B Тайвань штамм, сегментирован (-) вирус ssRNA первую очередь инфицировать людей, представляет семью Orthomyxoviridae. Вирус Рифт-Валли (RVFV), (-) ssRNA членистоногих родился вирус в первую очередь заразить членистоногих,жвачные и люди, была выбрана в качестве представителя семейства буньявирусов.

Для RVFV (рисунок 1), титры определяли из исходного раствора рекомбинантного живого ослабленного MP12 штамма RVFV в формате 12 и пластины с использованием CMC, агарозные или AVICEL накладки, которые инкубировали бок о бок в течение после заражения 72 ч (HPI). Представитель пластина показывая разведения, начиная от 10 ^-4 до 10 ^-7 можно увидеть в панели А. бляшек с использованием CMC и агарозные накладки показали небольшие, четкие и определенные бляшки с четко определенной круговой границы. Мемориальные доски с жидкой наложения были немного более обильные и больше по сравнению с агарозном и СМС бляшки, и при условии, менее отчетливое границу. Вирусные титры были сравнены в Группе B со всеми накладками выполнении сравнительно.

Для того, чтобы получить более четкое визуальное сравнение между накладками для MP12 вместе с большим размером выборки для определения reproducвость, 6 и пластина была также опробована в трех экземплярах (рисунок 2). В формате пластины 6 также, использование накладки CMC показали меньшие, чем любой бляшки агарозных или жидких накладками, которые были сравнимы по размеру друг от друга. В то время как вирусные титры были аналогичны между всеми тремя накладками (Панель D), бляшки, образованные в агарозных и жидких накладками оказалось легче рассчитывать из-за их увеличенного размера.

В отличие от RVFV, VEEV титров и бляшки морфологии среди различных накладок варьировалась заметно (рис 3а). Бляшки, образованные в CMC накладками продемонстрировали ясную и четкую морфологию при использовании формата 12-луночного планшета, за счет бляшки размера и чувствительности (панель В). В отличие от CMC, использование агарозных и жидких накладками приводило к значительно более крупные бляшки, указывающий более низкий вирусный ингибирование и повышенную чувствительность к VEEV репликации. Это было ранее подтверждено, когда только сравнивая агарозы в сравнении CMC в аркабан опубликованы Хуарес и др. ^4. В то время как агарозные и жидкие накладки производили крупные бляшки, чем CMC, бляшки были плохо определены границы и были трудно рассчитывать на так формате 12, с жидкими накладок, обеспечивающих наибольшую границы распространения. Когда бляшки опробована в 6-луночные планшеты (рисунок 4), тем больше формат хорошо 6 отрицается вопрос открыто крупных бляшек, которые трудно дифференцировать в формате 12 а, с агарозы и жидких накладками, подтверждающих превосходит накладками СМС с точки зрения доска определение и чутко (рис 4D).

По сравнению с RVFV или VEEV, грипп предоставляет ряд уникальных трудностей при plaquing, такие, как требование внешнего протеазы. Чувствительность вируса гриппа в различных наложения выборов также были хорошо документированы в прошлом, как значительные изменения были отмечены при модификации как незначительные, как отличающиеся марки агарозы есть бытьан используется ^9.

Интересно для штамма гриппа B Тайваня, использование CMC в виде наложения привело заметно меньшие бляшки, которые было трудно рассчитывать и оказалось трудно надежно забить (5А). Использование агарозном наложения при условии, лучшие бляшки (Панель С), и в результате более темном фоне пятна (вероятно, из-за повышенной жизнеспособности монослоя), и показали более четких и резких бляшки в непосредственном сравнении с использованием жидкой накладкой (панель B ).

Отличительное преимущество жидких полимеров более твердых и полутвердых накладками, таких как агароза и КМЦ, состоит в легкости удаления и применения. Сыры накладки требуют нагрева и кристаллизации может оказаться проблематичным при обращении и удаления. Для того, чтобы заработать на этих преимуществ и для определения целесообразности использования Avicel в высокой пропускной образом для RVFV, 96 Формат хорошо Планшет опробована на различных наложения КонцентрацДополнения (Рисунок 6). Для RVFV MP-12, разведения проводили в четырех повторностях на обоих 0,6 и 1,2% конечной концентрации Avicel. Наложение применение и удаление оказалось простой, без каких-либо очевидных различий между повторами или между концентрациями отмечено, демонстрируя высокую степень воспроизводимости. Когда забил, бляшки были различны и счетная невооруженным глазом, демонстрируя возможности использования жидких накладки в высокой пропускной образом для RVFV.

Рисунок 1:. RVFV налета сравнения наложения, использующие 12-луночных Veros высевали на 2,5 × 10 ⁵ клеток в 12-луночных планшетах и заражены 200 мкл, используя тот же серийно разводили начиная образец MP12. После заражения 1,5 мл накладки 0,3% агарозы, 0,6% Avicel, или 1% КМЦ (Final Concentrations), были применены для того, чтобы непосредственно сравнить накладки, как показано в панели А. бляшек подсчитывали и титровали в Группе B.

Рисунок 2:. RVFV налета сравнения наложения, использующие 6 пластин также Veros высевали на 5 х 10 ⁵ клеток в 6-луночные планшеты и заражены 400 мкл, используя тот же серийно разводили начиная образец MP12. Три мл накладки 0,3% агарозы, 0,6% Avicel, или 1% КМЦ, были применены для того, чтобы непосредственно сравнить накладки, как показано в панели A, B, и C. Отдельные эксперименты проводили, как описано одинаково для панелей переменного тока, с бляшек и титруют в панели D (N = 3).

Рисунок 3: <сильные> VEEV налета сравнения наложения, использующие 12-луночных. Veros высевали на 2,5 × 10 ⁵ клеток в 12-луночных планшетах и заражены 200 мкл, используя тот же серийно разводили начиная образец вакцинного штамма в VEEV TC-83. После заражения 1,5 мл накладки 0,3% агарозы, 0,6% Avicel, или 1% КМЦ, были применены для того, чтобы непосредственно сравнить накладки, как показано в панели А. бляшек подсчитывали и титровали в панели B.

Рисунок 4:. V EEV сравнения доска наложения, использующие 6 пластин также Veros высевали на 5 х 10 ⁵ клеток в 6-луночные планшеты и заражены 400 мкл, используя тот же серийно разводили начиная образец VEEV TC-83. После заражения, 3 мл накладки 0,3% агарозы, 0,6% Avicel, или 1% КМЦ, были применены для того, чтобы непосредственно сравнить накладки, как показанов Панели А, В и С. Отдельные эксперименты проводились одинаково, как описано для панели A - C, с бляшек и титровали в Панель D (N = 3).

Рисунок 5: гриппа зубного налета сравнения наложения MDCK клетки высевали на 5 х 10 ⁵ клеток в 6-луночные планшеты и инфицировали 400 мкл инокулята, использующих один и тот же начальный серийно разводили образец гриппа В Тайване.. Нет фетальной бычьей сыворотки (FBS) не был использован в ростовой среде или накладок, как ФБС может ингибировать распространение гриппа путем ингибирования определенных протеаз, которые требуются для вирусного слияния. ТРСК-трипсином был добавлен ко всем накладок до применения, чтобы облегчить синтез вирусной и запись с клетками-хозяевами. После заражения, 3 мл накладки 0,3% агарозы, 0,6% Avicel, или 1% КМЦ были применены для того, чтобы непосредственно сравнитьпометки, как показано в панели А, В и С. отдельных экспериментов проводились одинаково, как описано в Панели А - С, с бляшек и титровали в Панель D (N = 3). В то время как в среднем было принято для CMC бляшек они оказались трудно надежно рассчитывать, поскольку они продемонстрировали диффузные границы и очень маленькие размеры бляшек.

На рисунке 6:. Высокая пропускная способность налета накладки 96-луночный планшет из Veros высевали при 3 х 10 ⁴ клеток на лунку, были инфицированы 50 мкл инокулята, использующих один и тот же начальный серийно разводили образец RVFV MP12 в течение 1 ч, в четырех повторностях. Для накладок, 0,6 и 1,2% конечные концентрации Avicel были опробована в целях определения целесообразности и воспроизводимость использования жидких накладки в высокой пропускной образом, панели А и В,

	RVFV	VEEV	Грипп B
Тип клетки	Веро	Веро	MDCK
Период инфекции	1 час	1 час	45 мин
Время инкубации	3 дня	2 дня	3 дня

Таблица 1: бляшек инокуляции Условия и Сотовые Типы

	RVFV	VEEV	Грипп B
Тип клетки	Веро	Веро	MDCK
Тип роста	DMEM 1	DMEM 1	DMEM 2
Налет Медиа	2xEMEM	2xEMEM	2xEMEM B

1. Игла в модификации Дульбекко, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки, 1% L-глутамина, 1% Penicllin / стрептомицина.
2. Игла в модификации Дульбекко среде с добавлением 1% L-глутамина, 1% Penicllin / стрептомицина, 0,2% бычьего сывороточного альбумина, 0,025% HEPES, DEAE-декстран 50 мкг / мл.
А. 2x минимальной необходимой Медиа (500 мл) с добавлением 5% FBS (25 мл), 1% Минимальные незаменимых аминокислот (5 мл), 1% пирувата натрия (5 мл), 1% L-глутамина (5 мл), 2% Pen / Strep (10 мл).
Б. 2x минимальной необходимой Медиа (500 мл) с добавлением 0,2% бычьего сывороточного альбумина, 1% Минимальный незаменимых аминокислот (5 мл), 50 мкг / мл, 0,025% HEPES, DEAE-декстран, трипсин-ТРСК *
* Только до подготовки, добавить 1 мкл на 25мл 2 мкг / мл фондовой из ТРСК-трипсина к аликвотой вы будете использовать для смешивания с агарозы для бляшек.

Таблица 2: Налет и Вирусный / Сотовая Рост Medias

	RVFV	VEEV	Грипп B
Тип клетки	Веро	Веро	MDCK
Период инфекции	1 час	1 час	45 мин
Время инкубации	3 дня	2 дня	3 дня

Наложение решения не истекут, когда сделал так долго, как бесплодие поддерживается.

Таблица 3: наложений со

	6 хорошо	12 хорошо	96 хорошо
# Клеток / лунку	5 х 10 5	2,5 х 10 5	3 х 10 4
Объем инокулята (мкл)	400	200	50
Объем наложения (мл)	3	1,5	0.100

Таблица 4: Пластинчатые форматы

Обсуждение

Наиболее важным фактором для успешного бляшек заключается в оптимизации протокола для конкретного вируса в культуре в вопросе, как условия могут существенно различаться. Ключевые моменты, которые следует учитывать, являются: провести сотовой совместимость с вирусом в вопросе, соответствующих вирусных условий роста, достаточных диапазонах разбавления для того, чтобы четко различать бляшки, и правильный подбор наложения и окрашивание клеток и вируса в вопросе.

В то время как VEEV и RVFV и расти в очень похожих условиях с использованием многих из тех же типов клеток хозяина, различия в налета морфологии и кинетики роста существенно различаться. При использовании клетки Веро на налета анализов, которые традиционно используются в качестве распространения и индикатора клеточной линии для геморрагических вирусов лихорадки и альфавирусов, VEEV обычно вырастает до высоких титров чем RVFV и демонстрирует увеличилось кинетики репликации, разработке больших единых бляшек на 48 HPI ^{4, 1}0 ^{- 12.} В отличие от VEEV, RVFV требуется 72 HPI и демонстрирует бляшки, которые, как правило, гораздо меньше, и переменный размер.

В противоположность RVFV и VEEV, вирус гриппа является весьма специфические клетки-хозяина, и может быть трудно распространяться через культуре ткани. Для вируса гриппа, вирусного входа и слияния, как правило, по инициативе связывание рецептора на поверхности клетки с вирусной гликопротеина hamagglutinin (HA), которая является посредником вступление в клетки-мишени путем связывания с α-сиаловой поверхности кислоты рецептора клетки-хозяина. НА представляет собой тример гликопротеин, присутствующий в мембранной оболочке всех вирусов гриппа и требует расщепление в субъединиц HA1 и HA2 по конкретной клетки-хозяина протеазы. Чтобы еще более усложнить вопрос, эти сайты расщепления может часто отличаются вирусных штаммов ^13. Как экспрессии протеазы, способные к расщеплению HA ограничивается конкретными тканей, протеазы ARе часто добавляют к среде для культивирования клеток для того, чтобы облегчить синтез вирусной и вступление в выбранной клетке-хозяине, ^13. ТРСК-трипсином является одним из примеров широко используемом протеазы, который используется в клеточной культуре с обеих MDCK и клетки Vero: содействие репликацию мульти-цикла (в отсутствие какого-либо инактивации трипсина сыворотки) через активацию протеолитической вирусной HA ^14,15.

Как показано в этом исследовании и других, различия в вирусных жизненных циклов могут влиять наложения выборы, форматы плит и раз коллекцию, со значительными отклонениями среди различных классов и видов вирусов. В нашем исследовании, агарозы накладки продемонстрировал более четкие бляшки на более высоких титров, чем любой CMC или жидких накладок для обоих RVFV и вируса гриппа В, усиливая его полезность среди широкого спектра вирусов и типах клеток. Используя низкую конечную концентрацию агарозы большую помощь в удалении твердых пробки и упрощенную окрашивание. CMC в целом продемонстрировал рoorest эффективность в виде наложения на всех трех вирусов проверенных и производимых очень маленькими и нечеткими бляшек на вирус гриппа B. Хотя в целом CMC продемонстрировали наименее желательными характеристиками, его применение в стремительно растет и чрезвычайно вирулентные вирусы могут оказаться выгодным, как это было, кажется, уменьшить размер бляшек только с минимальным снижением титра. Жидкость накладка оказалась наиболее универсальным в том, что он был чрезвычайно прост в приготовлении, увеличилось простоту использования, и был сопоставим с агарозы через все вирусы выбранных. В формате более высокую пропускную способность 96-луночного планшета, применения и удаления не ингибируется в результате затвердевания как с традиционными накладками, и при условии, точные и стабильные результаты. Фактором при использовании жидких накладки заключается в непрозрачной окраски и неспособности контролировать образование бляшек в тарелки не могут быть перемещены до точки сбора, ограничения этого адаптацию к вирусам с ранее характеризующихся кинетики репликации.

Незначительные изменения в условиях бляшек может существенно изменить результаты, а оценка и эффективность любой новой системы или техники всегда оправдано. В то время как оптимизировать и стандартизированный протокол бляшек не существует для каждой ситуации, наш доклад продемонстрировать универсальность и простоту использования в традиционных, так и новых жидких накладками для налета анализов, обеспечивая при этом достаточную основу для дальнейших модификаций пользователей.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
6-луночная пластина CellStar для культуры тканей	Greiner Bio-One	658 160
12-луночная пластина CellStar для культуры тканей	Greiner Bio-One	665 180
96-луночная пластина CellStar для культуры тканей	Greiner Bio-One	655 180
96-2мл глубокий луночный планшет	США Scientific	C15046314	Для серийных разведений
DMEM	Quality Биологические препараты	112 013 101	Клеточная среда/разбавитель
2x EMEM для бляшек	Качественные биопрепараты	115 073 101	Теплый до 37 ° C
MEM 100x	Cellgro	25 025 cl
пируват натрия	Cellgro	25 000 cl
пенициллин стрептомицин	Gibco	15140 122
L-глутамин	Gibco	25030 081
HyClone FBS	Thermo Scientific	SH30910.03	Нагрейте перед использованием при температуре 62 ° C в течение 30 мин
Бычья сыворотка Альбумин	Sigma Aldritch	A7030-50G
Трипсин TPCK	Sigma Aldritch	T1426-50mg	Сделайте аликвоты/Избегайте замораживания размораживания
HEPES	Gibco	15630-080
DEAE-Декстран	Сигма Олдрич	D9885-10G
Кристалл Фиолетовый	Сигма Олдрич	C3886-25G
Раствор формальдегида	Сигма Олдрич	F8775-500мл
Реагент денатурированный этанол Класс	Сигма Олдрич	362808-1L
Avicel RC-591 NF	FMC BioPolymer США	RC-591 NF	Энергично встряхните при повторном консистенции  в течение >30 мин для гомогенизации
ультрачистой агарозы	Invitrogen	16500-100
Карбоксиметилцеллюлоза, соль натрия средней вязкости	Сигма Олдрич	C4888