В этой статье мы показываем метод приготовления острых срезов мозга при физиологической температуре, используя обычный физиологический раствор без специальных модификаций для разреза (таких как добавление сахарозы) и без внутрисердечной перфузии животного перед приготовлением среза.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Slice It Hot: Острая взрослом мозге нарезки в физиологической температуре
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Здесь мы приводим протокол для подготовки острых срезах мозга. Эта процедура является важным элементом для электрофизиологических экспериментов патч-зажим, который в значительной степени определяет качество результатов. Было показано, что опуская стадии охлаждения во время резки процедуру полезно в получении здоровых ломтики и клетки, особенно при работе с высокой миелиновых структур головного мозга из зрелых животных. Даже при том, что точный механизм которой повышенная температура поддерживает нервную здоровье можно только предполагать на, само собой разумеется, что, когда это возможно, температура в которой выполняется нарезка должна быть близка к физиологическим условиям по предотвращению температуры, связанные артефакты. Еще одним важным преимуществом этого метода является простота процедуры и поэтому некоторое время подготовка. В продемонстрированной методом взрослых мышей используются, но та же самая процедура может быть применена с молодых мышей, а также крыс. Также, следующий патч клЭксперимент усилитель выполнен на горизонтальных срезов мозжечка, но та же самая процедура также может быть использован и в других самолетов, а также другие задних областях мозга.
Введение
Целью предложенного метода является получение высококачественных острых кусочков мозга для в пробирке электрофизиологических экспериментов, особенно при использовании взрослого или даже старые животные.
Острая метод мозг нарезка, как описано Skrede и Westgaard 1 в двух элегантных приговоров, стал одним из основ современных исследований в области нейронаук и используется в бесчисленных вариациях по всему миру. Качество ломтиками отражается в количестве живых нейронов за среза, период времени, в течение которых клетки держать их электрофизиологических и морфологических свойств, а также в целостности ткани. Кроме того, максимальная продолжительность записи для стабильных зависит от качества срезов. Таким образом, вдоль десятилетий, оригинальный метод нарезки получила дальнейшее развитие отдельных исследовательских групп по повышению нефтеотдачи ломтик после резки 2-10, часто сложных модификаций состава резки оРешения г восстановления (например, добавление аскорбат, тиомочевины или даже H 2 O 2), а также внутри-сердечной предварительной перфузии животного с охлаждаемых физиологических растворов.
Как было недавно показано 11, физиологическая температура во время нарезки, кажется, более выгодным, чем охлаждение до нейронов здоровья; улучшение самое поразительное при работе со взрослыми (2-8 месяц) грызунов. Как избежать резких изменений температуры предотвращает артефактов из-за процессов в зависимости от температуры клеток, таких как пластичность 13 и ион-каналы кинетики 13,14. Такие изменения могут повлиять на мембранным напряжением и внутриклеточной сигнализации кальция, порог шип, и шип форму.
"Горячая" острый срез способ приготовления, представленные здесь, общая процедура для получения высококачественных острых кусочков мозга из любого региона мозга, в том числе в мозжечок, кору и гиппокамп, ядрах ствола мозга 16 </ SUP>, а также в обонятельной луковице, как у крыс и мышей.
Следует отметить, что процедура физиологический температура нарезки требуется, чтобы режущий диск вибрирует почти совершенно горизонтально и без каких-либо дефектов структуры. Такая точность не может быть достижимо с более старыми моделями среза; в таких случаях, мы рекомендуем вам провести подготовку ломтик в морозильных холодной условиях, низкая температура, кажется, делает ткани более устойчивы к механическим повреждениям, даже если ценой метаболических отклонений.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все экспериментальные процедуры, описанные в этом протоколе были утверждены уходу и использованию животных комитета Еврейского университета.
1. Подготовка решения и инструменты для нарезки
- Подготовьте 1 л физиологического раствора стандарт (SPS), содержащий ионы, описанные в таблице 1.
- Подготовка исходного раствора, содержащего соли при 10-кратной конечной концентрации в заранее в хранения стеклянной бутылки, наполненной 1000 мл деионизированной воды (проводимости 0,055 мкСм / см). Добавить соли (NaCl, KCl, KH 2 PO 4, и MgSO 4), и размешать до полного растворения. Хранить маточного раствора в 4 ° С.
- Сделать окончательное решение SPS на день эксперимента. Добавить 100 мл исходного раствора до 700 мл очищенной воды, растворить глюкозу (3,6 г) и NaHCO 3 (2,18 г) с использованием магнитной мешалки, а затем добавить очищенную воду до 1 л
- Уравновесить Solutiна по газовыделения его с 95% O 2/5% CO 2 в течение ~ 20 мин. После этого, добавьте 2 мл 1 М CaCl раствора 2.
- Соберите следующие инструменты (рисунок 1).
- Подготовьте большие ножницы или другой инструмент для обезглавливания, небольшие хирургические ножницы для вскрытия черепной коробки, тонкий наконечник щипцы для подъема череп подвергать мозг, скальпель с лезвием для вскрытия нужную часть мозга, чтобы быть нарезанный и небольшой шпатель для работы расчлененные части мозга.
- Кроме того, подготовить небольшие кусочки фильтровальной бумаги для удаления избытка жидкости из головного мозга, две маленькие чашки Петри для мозга, чтобы разрезать на две стекла 500 мл стаканы для содержащего подогретой очищенной воды и СПС, и цианакрилатного клея для склеивания мозг нарезка этап.
- Подготовьте небольшую щетку для обработки ломтики в течение нарезки и с широким горлом стекло пипетки Пастера для перемещения ломтики от нарезки бане к восстановления чаmber. Лечить инструменты, чтобы предотвратить рост бактерий в теплых ломтик ванн. Кроме того, используйте чистые лабораторные перчатки.
- Приготовьте погруженной ломтик камера регенерации такой, как описано Edwards и Гибб 15. Постоянно газ СПС в нем с 95% O 2/5% CO 2 и держать при температуре 36 ° С. Убедитесь, что выделение газов не приводит к мелких пузырьков, захваченных в ванне, что может привести к повреждению ломтиками.
- Теплый ~ 300 мл СПС до 36 ° С на нагревательной пластины с магнитной мешалкой или в водяной бане. При использовании пластины нагревателя, заботиться, чтобы предотвратить решение от перегрева, что может привести к ионной осадков. Если это произойдет, теплые свежие SPS вместо охлаждения старый.
- Принесите ~ 500 мл очищенной воды до кипения, используя электрический чайник и, в стакане, объединить 300 мл него с холодной водой, чтобы получить немного теплой воды, чем температура нарезки. Используйте этот нагревали очищенную воду во время обезглавливания и использовать Remaiнин из кипятка позднее для поддержания физиологического температуру нарезки ванной.
- Анестезировать мыши путем инъекции 0,1 мл фенобарбитала (60 мг / мл) внутрибрюшинно. Через несколько минут проверить, что животное не реагирует на сильные ног или хвоста щепотки констатировать отсутствие ощущения.
2. Пройдя мозг
- Обезглавьте мышь быстро путем отрезания шейки с большими ножницами возле задней части черепа, и пусть голова упасть в стакан с подогретой очищенной воды, чтобы смыть лишнюю кровь.
- Expose затылочного отверстия в черепе под мышц шеи и кожи, возможно, удаление более шеи с маленькими ножницами.
- Потяните кожу на верхней части черепа, чтобы иметь возможность четко видеть черепа швов, чтобы направлять открытие черепа.
- Вырезать череп открытый, вставив нижний кончик маленькими ножницами через затылочного отверстия и сразу же превращая их в сторонубоковая сторона. Аккуратно разрезать вдоль бокового края теменной кости до места позади глаз и лобно-теменной шов; Затем, повернуть в направлении к центру черепа и пронизывают средней линии к другой стороне черепа (см зеленый пунктирную линию на фиг.2А).
- Использование тонких наконечников щипцов, поднимите череп с лобно-теменной углу и потяните его по диагонали вверх и в сторону, чтобы выставить на мозг (см желтый пунктирной стрелкой на рисунке 2а). Убедитесь, что череп не привязан к какой-либо кости или кожу головы, так что мозг будет оставаться на месте, когда череп поднимается. В случае, что мозг движется с черепом, использовать маленькие ножницы, чтобы удалить любой соединительной ткани между черепа и мозга.
- Когда мозг подвергается, не позволяют мозгу быть сухим. Таким образом, выполнить следующие шаги, сохраняя при этом череп и мозг в чашку Петри, наполненную нагревают, газом SPS.
- Снимите часть мозга, используемый для электроннойXperiment от остальной части головного мозга с использованием скальпель и шпателя. В случае использования в мозжечок, оторваться от переднего мозга с помощью одного надреза по мозга и моста (вдоль красных линий в рисунках 2B-D) и переместить его в небольшой чашке Петри, содержащей свежий, газом SPS.
- Снимите ствол мозга образовывать прямую и широкую базу для склеивания мозг резки этап, когда нарезка мозжечок в горизонтальной плоскости. Кратко разместить мозжечок на мокрой кусочек фильтровальной бумаги так, чтобы та сторона, которая была вырезана из переднего мозга направлена вниз.
- Вырезать ствол мозга с помощью скальпеля, чтобы сформировать базу (как указано с синей линии в рисунке 2B), и вернуться в мозжечок к СПС. Когда другие самолеты резки необходимы, отделка мозжечка блок соответственно (синие линии на рисунках 2С & D).
3. нарезки мозг
- Подготовьте почву резания на выяснение, что это DRy, перед нанесением небольшую каплю суперклея в середине стадии.
- Поднимите блок головного мозга от СПС, используя шпатель с правильной стороной вверх, и удалите лишнюю жидкость из мозга с помощью маленьких кусочков фильтровальной бумаги. Тогда, одним движением, сдвиньте мозг от шпателя на каплю клея на сцене.
- Чтобы предотвратить мозг от сушки и клей от работы на боковых сторонах ткани, применить несколько капель SPS с помощью пипетки Пастера и помещают в стадию резки в камере нарезки. Совместите блок мозга таким образом, что регионы интерес (например, коры мозжечка) сталкиваются лезвие и, таким образом, будут подвергаться наименьшим количеством механического давления, прежде чем нарезанный.
- Разрежьте каждый ломтик в соответствии с инструкциями изготовителя, постоянно газом СПС в камеру дробления, а также поддерживая температуру 34-37 ° С. Поддержания температуры рабочей камеры в этом диапазоне, заполнив EXTERNаль палата резки с подогретой очищенной воды и замены воды, когда температура падает слишком низко.
ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры нарезки должны быть экспериментально обнаружено для каждого типа ткани и нейронов, которые находятся на рассмотрении. В случае Кэмпден SMZ 700 ломтерезки с керамическими лопатками и мозжечковых клетках Гольджи, используют 0,75 мм амплитуду колебаний на 65 Гц и наступающей скорость 0,05 мм / с; для мозжечковые нейроны ядерные более высокой амплитудой и частотой (1 мм и 90 Гц соответственно) и более низкой скорости заранее (0,01-0,02 мм / сек) рекомендуется. Для обоих Гольджи и мозжечка ядерных нейронов, толщина среза должна быть 300 мкм. - Во время нарезки, не позволяют ломтики сложить на себя. Избежать этого можно, мягко поддерживая их с помощью мягкой щетки, предпочтительно касаясь кусочек только в регионах, которые не представляют интереса для эксперимента. Позаботьтесь, чтобы предотвратить кисть от прикосновения к vibratome лезвие; особенно в случае керамических лопастей, даже легкий контактможет повредить лопасти.
- Перемещение каждый кусочек от нарезки камеры для восстановления / проведение камеру, используя широкий рот, огневой полировкой стекла пипетки Пастера.
- Пусть ломтики отдохнуть в камере в течение не менее 1 часа перед началом эксперимента. Это позволяет деградации поврежденных или умирающих тканей и клеток, и, таким образом, приводит к более чистой поверхности среза. В течение первого часа, поддерживая температуру СПС в камере в диапазоне 34-36 ° С; гарантировать, что ломтики не тронут пузырьков воздуха, которые могут повредить ломтики или делают их плавать.
4. Эксперимент
- После 1 часа, пусть температура камера регенерации остыть до комнатной температуры (17-25 ° С).
Примечание: Это может продлить период времени, в течение которого ломтики могут быть использованы, замедляя рост бактерий, а также клеточный метаболизм. Этот период зависит от области мозга и типа клеток. Например, некоторые виды Гольджи клеток можно найти, чтобы быть здоровым в срезах8 ч после резки в то время как другие виды длиться только 6 ч. - После 1 ч прошло с нарезки, использовать ломтики для различных электрофизиологических экспериментов.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Кусочки, приготовленные описанным способом могут быть использованы для различных электрофизиологических и optogenetic экспериментов. На рисунке 3А и 3В, мы показываем типичный пример горизонтальной мозжечка срез и корональной коры головного мозга срез, соответственно, если смотреть под дифференциал помех (DIC) оптики. В мозжечка срез, несколько типов нейронов мозжечка можно легко узнать по их форме местоположение и клеточной тела, позволяя направлены электрофизиологические записи. В
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Показано, способ получения острых срезах мозга мышей в физиологическом вместо ледяной температуры.
Было показано 11, что качество срезов, полученных в теплых условиях превосходит по сравнению с теми, подготовлен с холодных условиях, при условии, что резки лезвие имеет минимальную вертикальную вибрацию. Нарезка в физиологической температуре может предотвратить физиологические артефакты, вызванные низкой температурой, например, те, которые связаны с изменениями в обменных процессах ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Мы хотели бы выразить признательность доктору Шивэю Хуангу (Австралийский национальный университет) за значительный вклад в валидацию метода. Кроме того, мы хотели бы поблагодарить г-жу Касю Пиетрахтис за полезные комментарии относительно клеток Гольджи и г-на Виталия Лернера за экспериментальные данные по коре головного мозга. Эта работа была поддержана PITN-GA-2009-238686 (CEREBNET), FP7-ICT (REALNET), ELSC и ISF.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Пентобарбитал | CTS | 170066 | Концентрация: 60 мг/мл в физиологическом растворе. |
| Большие ножницы | FST | 14001-16 | Для обезглавливания можно использовать любые большие ножницы или гильотину с достаточно острыми краями |
| Ножницы для ирисов | Prestige medical | 48,148 | Можно использовать любые ножницы с тонким кончиком, при условии, что лезвия ножниц не длиннее 1,5– 2 см |
| Щипцы с тонким кончиком | FST | 11254-20 | |
| Скальпель | FST | 91003-12 | |
| Лезвие скальпеля #11 | FST | 10011-00 | |
| Маленький шпатель | Рыбак | 2350 | |
| Фильтровальная бумага | Можно использовать любую лабораторную марку. | ||
| Чашки Петри | Duroplan | Z231509-1 | |
| Стеклянные стаканы | Пипетка SCHOT | 10022846 | |
| Пастера | Кленовый лист | марки 14672-029 | |
| Супер клей | LOCTITE | 4091361/1 | |
| Слайсер | Campden | 7000-smz | |
| Керамическое лезвие для нарезки | Campden | 7550-1-C | |
| Магнитный нагреватель/мешалка | Для нагрева SPS для процедуры | ||
| Электрический чайник | Для нагрева воды для контроля температуры | ||
| Камера восстановления ломтиков + нагревательный блок | Warner Инструменты | BSC-HT + BSC-BUW | Также могут использоваться самодельные модели. |
| Термометр | Для контроля температуры SPS при рассечении и срезе |
Ссылки
- Skrede, K., Westgaard, R. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Research. 35, 589-593 (1971).
- Aghajanian, G., Rasmussen, K. Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices. Synapse. 3, 331-338 (1989).
- Gueritaud, J. Electrical activity of rat ocular motoneurons recorded in vitro. Neuroscience. 24, 837-852 (1988).
- Lipton, P., et al. Making the best of brain slices: comparing preparative methods. Journal of Neuroscience Methods. 59, 151-156 (1995).
- Richerson, G., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Experimental Neurology. 131, 133-143 (1995).
- Brahma, B., Forman, R., Stewart, E., Nicholson, C., Rice, M. Ascorbate inhibits edema in brain slices. Journal of Neurochemistry. 74, 1263-1270 (2000).
- Moyer, J. R., Brown, T. H. Patch-clamp techniques applied to brain slices. In: Patch-clamp analysis: advanced techniques. Springer. , 135-193 (2002).
- Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons. J. Neuroscience Methods. 156, 251-259 (2006).
- Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
- Zhao, S., et al. Cell type–specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8, 745-752 (2011).
- Huang, S., Uusisaari, M. Y. Physiological temperature during brain slicing enhances the quality of acute slice preparations. Front. Cell. Neurosci. 7, (2013).
- Ohe, G. C., Darian-Smith, C., Garner, C. C., Heller, H. C. The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10590-10598 (2006).
- Voets, T., et al. The principle of temperature-dependent gating in cold- and heat-sensitive TRP channels. Nature. 430, 748-754 (2004).
- Coulter, D. A., Huguenard, J. R., Prince, D. A. Calcium currents in rat thalamocortical relay neurones: kinetic properties of the transient, low-threshold current. The Journal of Physiology. 414, 587-604 (1998).
- Gibb, A. J., Edward, F. A. Patch clamp recording from cells in slice tissues. Microelectrode Techniques: the Plymouth workshop handbook. , 2nd edition, Company of Biologists. Cambridge, UK. (1994).
- Lefler, Y., Yarom, Y., Uusisaari, M. Y. Cerebellar Inhibitory Input to the Inferior Olive Decreases Electrical Coupling and Blocks Subthreshold Oscillations. Neuron. 81 (6), 1389-1400 (2014).
- Bourne, J. N., Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Warmer preparation of hippocampal slices prevents synapse proliferation that might obscure LTP-related structural plasticity. Neuropharmacology. 52, 55-59 (2007).
- Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats. J. Neurosci. 19, 2876-2886 (1999).
- Kirov, S. A., Petrak, L. J., Fiala, J. C., Harris, K. M. Dendritic spines disappear with chilling but proliferate excessively upon rewarming of mature hippocampus. Neuroscience. 127, 69-80 (2004).
- Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. J. Neurosci. Methods. 171, 181-125 (2008).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
