Механизмы, ведущие к развитию гиперплазии интимы (Ih) и вены отторжения трансплантата до сих пор мало изучены. Это исследование описывает экс естественных систему заливать человека вены в контролируемых расхода и давления. Кроме того, эффективность внешней арматуры сетки, чтобы ограничить развитие IH оценивали.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Порядок человека подкожных вен Экс Vivo Перфузии и внешнего подкрепления
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Основой современных методов лечения для широкого окклюзионной артерий является венозная шунтирование. Тем не менее, его долговечность угрожает гиперплазии интимы (IH), что в конечном итоге приводит к окклюзии сосудов и отторжения трансплантата. Механические силы, особенно с низким напряжение сдвига и высокой напряженности стены, как полагают, чтобы инициировать и поддерживать эти клеточные и молекулярные изменения, но их точное вклад еще предстоит разгадать. Чтобы выборочно оценить роль давления и напряжения сдвига на биологии IH, экс естественных перфузии система (ЦПС) была создана, чтобы заливать сегменты подкожных вен человека при артериальной режима (стресс при высокой скорости сдвига и высокого давления). Дальнейшие технические новшества позволили одновременное перфузии двух отрезков от том же ключе, один армированной внешней сетки. Вены собирали с помощью метода нет касание и сразу переданы в лабораторию для сборки в ЦПС. Один сегмент свежемолотым Isolованные вены не перфузировали (контроль, день 0). Два других сегментов перфузировали на срок до 7 дней, один из которых полностью защищенных с 4 мм (диаметр) внешнего сетки. Давление, скорость потока, и пульс были Постоянный мониторинг и корректировка, чтобы имитировать гемодинамики условия, существующие в бедренную артерию. По окончании перфузии, вены были демонтированы и использованы для гистологического и молекулярного анализа. Под бывших естественных условиях, перфузии высокого давления (артериальной, среднее = 100 мм рт.ст.) достаточно для генерации IH и реконструкцию человека вен. Эти изменения сводятся в присутствии внешнего полиэфирной сетки.
Введение
Сердечно-сосудистые заболевания являются ведущей причиной заболеваемости и смертности в западных странах 1. Несмотря на достигнутые сдвиги в эндоваскулярного лечения, шунтирование остается основой современных методов лечения, таким образом более полумиллиона венозных шунтов ежегодно производится в США. Тем не менее, несмотря на десятилетия исследований, 30-60% нижних конечностей венозных шунтов терпит неудачу в течение первых лет в связи с гиперплазией интимы (IH) 2. Механические силы, особенно с низким напряжение сдвига (SS) и высокая стена напряженность, являются ключевыми в инициации и развитии этого гиперплазированной ответ 3,4. Для решения этого вопроса, экс естественных условиях вены перфузии система (ЦПС) был создан для изучения, в строго контролируемых условиях гемодинамики (давление и напряжение сдвига), поведения человека подкожных вен. В этом исследовании, после введения в артериальной-обращении, как, высокое давление (среднее = 100 мм рт.ст.) было достаточно, чтобы стимулировать prolifие и миграции гладкомышечных клеток интимы в слое (Ih) 5.
Млекопитающих исследования показали, использование внешнего армирования в качестве эффективного метода для поддержки "arterialized вену" и противодействовать острый гемодинамические изменения вены лица после имплантации в артериальной среде. Сетка предотвратили более-живота, увеличение напряжения сдвига, и снижается напряжение стенок и, следовательно IH 6-10. Тем не менее, основные механизмы и его применимость к человеческим венам в улучшении обходной проходимость не были полностью характеризуется. Наши ЦПС был использован для сравнения, в состоянии, имитирующих изменения вены лица один раз, вставленные в артериальной режима (стресс при высокой скорости сдвига и давления), поведение подкожных вен человека в отсутствие и в присутствии внешнего макропористом полиэстер трубчатой сетки. По предотвращения патологического ремоделирования и IH, сетка представил доказательства своей потенциальной клинической эффективности 11 .
Это исследование 1) вводит модель экс естественных человека подкожных вен перфузии под регулируемым давлением и напряжением сдвига 2) показывает, что внешняя макро-пористых полиэфирной сетки уменьшает IH и предоставляет важную информацию для ее потенциального клинического применения.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Этический комитет Университета Лозанны утвердил эксперименты, которые в соответствии с принципами, изложенными в Хельсинкской декларации 1975 года, в редакции 1983 для использования тканей человека.
1 человека большой подкожной вены Harvest
- Получить излишки сегменты без варикозных человека подкожных вен у пациентов, перенесших нижний обводной конечностей хирургии для ишемии. В операционной, дезинфицировать всю ногу с раствором йода и драп пациента, чтобы выставить ногу от паха до стопы.
- Сделайте средний надрез от паха до колена (выезд прерванный часть кожи).
- Урожай большой подкожной вены с плодоножкой окружающих (технику не-сенсорный) ткани. Безопасные боковые ветви вен с 4-0 шелковых галстуков. Сразу хранения минимум 9 см в длину избыток сегмента большой подкожной вены, с внешним диаметром 2,5-4 мм при 4 ° С в среде RPMI-1640 Glutamax среднего, с добавлением 12,5% эмбриональной телячьей сыворотки и привести его в лабораторию.
2 ЦПС Дизайн
- Соберите общее оборудование, показанное на рисунке 1. Автоклав все оборудование и держать все компоненты в стерильных условиях. Кроме того, убедитесь, что система является водонепроницаемым и не протекает химических веществ в среде. Используйте Полиметакрилат метил (PMMA-GS) для обложки. Сталь (X5 Cr Ni 18 10) и полиоксиметилен пластик (ПОМ) в качестве носителя вены.
- Конструкция перфузии камеры до желаемой геометрии, чтобы позволить размещение в вену и ее связи. Убедитесь, что глубина (или радиус при использовании цилиндрическую конструкцию), по крайней мере 2,5 см, так что позволяет минимальное сгибание и дилатацию сосуда вместе с постоянной охвата культуральной среде (рисунок 1). Уплотнение является серьезной проблемой и является причиной прямоугольная конструкция PMMA-GS используется.
- Дизайн поддержку вены в нужное геометру. Чтобы избежать вены перегибов или более растяжение, позволяют регулировать длину на толкать или тянуть (винт не могут быть использованы для этой цели, так как вены бы быть скручены вместе с винтом).
ПРИМЕЧАНИЕ: полный стальной стержень соединены 2 раздвижных Г-образные части, которые поддерживают вены цилиндров 2 (диаметр 5 мм, чтобы соответствовать судно) и в вену (рисунок 1b и Рисунок 2) здесь используется. - Дизайн столбец давления, такой, что "отдыхает давление" применяется к системе является: P = 0-10 = HX ρ XG, где р = давление (Н / м 2, Па) ч = высота столба жидкости (м) ρ = плотность жидкости (кг / м 3) и г = гравитационной постоянной (9,81 м / с 2). Дизайн четыре протоки подключения, сверху вниз: для оказания давления, для оттока (из вены), приток (в вену) и позволить среднего изменения.
- Подготовьте среду. Основываясь на предыдущих исследованиях 5,11-14, выбрать RPMI-1640, дополненной Glutamax, 12.5% Фетальной телячьей сыворотки и 1% антибиотиков противогрибковое раствор (10000 ед / мл пенициллина G, плюс 10 мг / мл стрептомицина сульфата, а также 25 мг / мл амфотерицина В, плюс 0,5 мкг / мл): гентамицин. Напряжение сдвига (SS) задается SS = 4 μQ / π * R 3 Q является расход (мл / сек), г радиус (см) сегмента вены, и μ является вязкость перфузии среды.
- Модулируйте SS посредством регулирования вязкости добавлением через 70 кДа декстрана. Измерьте вязкость с помощью вискозиметра. Здесь, добавить 8% 70 кДа декстран установить SS в 9-15 дин / см 2.
- Установка зубчатой передачи насос, чтобы вызвать пульсацию кардиоидной сигнал 60 импульсов / мин и постоянной амплитуды генерации однонаправленный поток 150 ± 15 мл / мин, независимое от давления, приложенного в контролируемой системе, и с помощью компьютера. Убедитесь, что движущей программное обеспечение включает постоянное приобретение и мониторинг давления и скорости потока, частота пульса и сигнала. При желании, использовать второй насос (не синхронизацияhronized), чтобы получить нон-ламинарный, турбулентный поток.
3 ЦПС Ассамблея (Рисунок 1)
- Перед началом, убедитесь, что все оборудование является стерильным. Выполнять все описанные ниже шаги в рамках асептики в ламинаре.
- Поместите вену в чашку Петри со средой. Используйте хирургического лезвия и разделить вену на 3 равные части.
- Немедленно промойте один сегмент в PBS. Разделите сегмент в 3 частях, исправить один в формалине для морфометрии. Замораживание два других для количественного стенограмма (RT-PCR) и белка (вестерн-блот) анализа. Рассмотрим эти сегменты как контроль, нераспространение-перфузии вены.
- Используйте 2 оставшихся сегментов для перфузии.
- Очень осторожно вводят среду в вену и определения нормальной направление потока; в наличии клапанов вен восстанавливается.
- Уплотнение вены имеет первостепенное значение для экспериментальной успеха. Убедитесь в отсутствии утечек через залогов. Зафиксируйте все течи 6-0 шелковыми швами.
- Подключите вен сегмент между двумя металлическими цилиндрами, один конец за один раз (2,3, рис 1). Закрепите цилиндры с Ethibon 3-0 вокруг углубления (Рисунок 1А и В).
- Поместите всю венозную сегмент в перфузии камеры ранее заполненной среде. Повторите ту же процедуру для второго сегмента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Неправильное запечатать вену в цилиндр будет источником утечки, требуют повторных операций, и значительно увеличить риск инфекции и экспериментальной неудачи.
- Поместите всю венозную сегмент в перфузии камеры ранее заполненной среде. Повторите ту же процедуру для второго сегмента.
- Для усиления (сетка) второй сегмент, выпустить два цилиндра (с вены прилагается) от Г-образных фигур (2,3 и рис 1).
- Будьте нежны и не прикасайтесь к вену с любыми инструментами. Авто сетку сначала на цилиндр затем на вены. Тяни / Толкай толкотня получите сетку на вены.
- После того, как сетка покрывает всю поверхность вены обеспечить Jacketed вены в цилиндры с Ethibon 3-0.
- Соберите вены / цилиндра соединение с L-образный поддержку и передать его на камеры перфузии, ранее заполненной среде.
- Подключите каждый металлический цилиндр (в-и оттока) в Y-разветвитель с помощью перекиси обращению силиконовые трубки с внутренним диаметром 3,2 мм.
- Подключение разветвитель оттока на второй Y-разветвитель, используя тот же тип трубы. С этой Y-разветвитель, использовать одну трубку для измерения давления перфузии через обоих судов. Подключите другой его обратно в колонну, чтобы образуют замкнутую систему цикла (Рисунок 2).
- Внутри инкубатора, использовать длинный (один метр длины) трубки для подключения колонки давления к головке насоса.
- Завершения настройки при подключении насоса голову к притока Y-разветвитель на другой большой длины трубы (рисунок 1).
4 Вены перфузии
- После сборки ЦПС был совместноmpleted, заполнить колонку со средой (оставаться ниже оттока вены канала, чтобы позволить заправки). Добавить больше среду в колонну, пока система не будет заполнен. Перемещение всю систему в инкубаторе при температуре 37 ± 0,1 ° С с рН поддерживали на постоянном уровне 7,40 ± 0,01 (с использованием алгоритма СО 2 / рН, основанный на уравнении Хендерсон-Хассельбаха).
- Принесите голову передач насоса вне инкубатора и подключить его к приводу передач насоса. Винтовые стержни чтобы закрепить.
- Перейти от мощности накачки, убедитесь, что он активируется на программное обеспечение вождения и позволяют 5 мин, чтобы среда равномерно распределяется в каждом отсеке.
- Чтобы контролировать давление, использовать мониторинг артериального строки. Подключите выход давления ЦПС (это соответствует артериального катетера) к датчику давления, связанного с компьютером.
- Убедитесь, что трубка полностью заполнена средой и не содержит никаких пузырей. Де-пузырь систему культуры через "артериальной Liпе "трубка (Рисунок 2). Обратите внимание на дисплее и отыскать пульсирующим кардиоидной сигнала 60 импульсов / мин с постоянной амплитудой. В этот момент, среднее давление находится в диапазоне от 0-10 мм рт. Если давление <0 и столбец постепенно впадает искать утечки (вен залога или ненадлежащее уплотнения между веной и трубки).
- Установите минимальное давление на 6 мм рт.ст. для венозной теста или на 90 мм рт.ст. для артериальной теста. В этих условиях, воздушного инжектора применяется требуемое давление в колонне и системы.
- Изменение среды каждые 2 дня, используя трубку, подключенный к колонке давления. Для предотвращения ущерба от изменения давления, откройте пробку столбца первой.
5 Завершение перфузии
- После 3 или 7 дней перфузии: принять ЦПС из инкубатора и демонтировать вены. Откажитесь от 5 мм ближней и дальней вены концы прикреплены к оборудованию. Вырезать центральную, толщина 5 мм РинGS от оставшегося сегмента и исправить в формалина (морфометрии). Заморозьте оставшиеся фрагменты и уменьшить в порошок для дальнейших молекулярных анализов.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
ЦПС предоставляет ценный инструмент самостоятельно оценить гемодинамические силы на подкожная вена человек прививает ремоделирования и IH.
На рисунке 1 показана перфузии камеры и поддержку вену. На рисунках 1А и В, поддержка вены до (1А) и после (Рисунок 1В) в сборе, соответственно, на фото. Он состоит (от вершины до основания) 1 простой трубке из нержавеющей стали размером 9 см, который служит в качестве оп...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Это исследование раскрывает экс естественных условиях вены перфузии системы (ЦПС) на выполнение работ по гемодинамики исследования в человека вен. Эта система позволяет подкожных вен перфузии при определенных параметров гемодинамики при отсутствии отягчающих воспалительных и факторов роста, опубликованным циркулирующих клеток в естественных условиях. Таким образом, он обеспечивает лучшее понимание основных путей, участвующих в контроле IH в человека вен трансплантатов 5,11,12,15.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантами от ОЯТ [31003A-138528], в Octav и Марселла Ботнарь фонда, Фонда Новартис и Эмма Мушамп фонда. Мы благодарим Martine Lambelet и Жан-Кристоф STEHLE за отличную техническую помощь.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 - Glutamax | Life Technologies | 61870-010 | |
| Пенициллин/Стрептомицин/Фунгизон | Bioconcept | 4-02F00-H Дексон | |
| от Leuconostoc spp. 500 г | Sigma-Aldrich | 31390 | |
| Тампон PBS CHUV pH 7,1-7,3 1 л | Laboratorium und Grosse Apotheke Dr. G. Bichsel AG | 100 0 324 00 | |
| Криосекционная среда для встраивания - Tissue-Tek OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Силиконовая трубка (перекись) L/S 16 (96400-16 ) - 7,5 м | Idex Health & Наука GMBH | MF0037ST | |
| Y-образный разветвитель | Idex Health & Science GMBH | Y-образный соединитель | |
| 35 мм Чашка для культур | Sigma-Aldrich | CLS430165-100EA | |
| 15 мл Falcon Tube | BD Bioscence | 352096 | |
| 50 мл Falcon Tube | BD Bioscence | 352098 | |
| Шестеренчатый насос - Reglo-Z | Idex Health & Наука GMBH | SM 895 | App-Nr 03736-00194 |
| Головка насоса | Idex Health & Наука GMBH | MI0008 | |
| Набор для мониторинга TRANSPAC IV | icumedical | 011-0J736-01 | |
| 20 мл Шприцы | B. Braun Medical SA | 4612041-02 | |
| Etibon 3-0 FS-2 | Ethicon- Johnson& Johnson | EH7346H | |
| Mesh ProVena 6-8mm | B. Braun Medical SA | 1105012-14 | |
| NaCl: Перфузия раствора хлорида натрия 0,9% (100 мл) | B. Braun Medical SA | 534534 | |
| Masterflex L/S Стандартный привод | Cole-Parmer Instrument Co | 7521-10 | |
| Карта сбора данных | National Instruments | PCI-6024 E | |
| Расходомер модуль | Transonic Systems Inc. | TS410 и T402 | |
| Запорный кран с 3-ходовым | BD Connexta Luerlock | 394600 | |
| Millex Filter | Milian SE2M229I04 |
Ссылки
- Sal Go, A., et al. Executive summary: heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the american heart association. Circulation. 129, 399-410 (2014).
- Sal Conte, M., et al. Results of PREVENT III: a multicenter, randomized trial of edifoligide for the prevention of vein graft failure in lower extremity bypass surgery. Journal of Vascular Surgery. 43, 742-751 (2006).
- Yu, P., Nguyen, B. T., Tao, M., Bai, Y., Ozaki, C. K. Mouse vein graft hemodynamic manipulations to enhance experimental utility. The American Journal of Pathology. 178, 2910-2919 (2011).
- Davies, M. G., Hagen, P. O. Reprinted article "Pathophysiology of vein graft failure: a review". European journal of vascular and endovascular surgery : the official journal of the European Society for Vascular Surgery. 42, Suppl 1. S19-S29 (2011).
- Berard, X., et al. Role of hemodynamic forces in the ex vivo arterialization of human saphenous veins. Journal of Vascular Surgery. 57, 1371-1382 (2013).
- Vijayan, V., et al. Long-term reduction of medial and intimal thickening in porcine saphenous vein grafts with a polyglactin biodegradable external sheath. Journal of Vascular Surgery. 40, 1011-1019 (2004).
- Jeremy, J. Y., et al. On the biology of saphenous vein grafts fitted with external synthetic sheaths and stents. Biomaterials. 28, 895-908 (2007).
- Zilla, P., et al. Constrictive external nitinol meshes inhibit vein graft intimal hyperplasia in nonhuman primates. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 136, 717-725 (2008).
- Zilla, P., et al. Utilization of shape memory in external vein-graft meshes allows extreme diameter constriction for suppressing intimal hyperplasia: a non-human primate study. Journal of Vascular Surgery. 49, 1532-1542 (2009).
- Yeoman, M. S., et al. A constitutive model for the warp-weft coupled non-linear behavior of knitted biomedical textiles. Biomaterials. 31, 8484-8493 (2010).
- Longchamp, A., et al. The use of external mesh reinforcement to reduce intimal hyperplasia and preserve the structure of human saphenous veins. Biomaterials. 35, 2588-2599 (2014).
- Saucy, F., et al. Ex vivo pulsatile perfusion of human saphenous veins induces intimal hyperplasia and increased levels of the plasminogen activator inhibitor 1. European Surgical Research. Europaische Chirurgische Forschung. Recherches Chirurgicales Europeennes. 45, 50-59 (2010).
- Dubuis, C., et al. Atorvastatin-loaded hydrogel affects the smooth muscle cells of human veins. The Journal of pharmacology and experimental. 347, 574-581 (2013).
- Deglise, S., et al. Increased connexin43 expression in human saphenous veins in culture is associated with intimal hyperplasia. Journal of Vascular Surgery. 41, 1043-1052 (2005).
- Muto, A., Model, L., Ziegler, K., Eghbalieh, S. D., Dardik, A. Mechanisms of vein graft adaptation to the arterial circulation: insights into the neointimal algorithm and management strategies. Circulation Journal : Official Journal of the Japanese Circulation Society. 74, 1501-1512 (2010).
- Tao, M., et al. A simplified murine intimal hyperplasia model founded on a focal carotid stenosis. The American Journal of Pathology. 182, 277-287 (2013).
- Berard, X., et al. Salvage treatment for venous aneurysm complicating vascular access arteriovenous fistula: use of an exoprosthesis to reinforce the vein after aneurysmorrhaphy. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery : the Official Journal of the European Society for Vascular Surgery. 40, 100-106 (2010).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
