Модели протеинопатии дрожжей являются ценными инструментами для оценки токсичности и агрегации белков, участвующих в заболевании. Здесь мы представляем методы скрининга библиотек вариантов Hsp104 на наличие подавителей токсичности. Этот протокол может быть адаптирован для скрининга любой библиотеки белков на подавители токсичности любого белка, который токсичен в дрожжах.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Изоляция потенцированной Hsp104 вариантов Используя дрожжи Proteinopathy Модели
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Многие нарушения сворачивания белка могут быть смоделированы у почковающихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Белки, такие как TDP-43 и FUS, участвующие в боковом амиотрофическом склерозе, и α-синуклеин, участвующий в болезни Паркинсона, токсичны и образуют цитоплазматические агрегаты в дрожжах. Эти особенности перекликаются с белковыми патологиями, наблюдаемыми у пациентов с этими нарушениями. Таким образом, дрожжи являются идеальной платформой для выделения подавителей токсичности из библиотек белковых вариантов. Мы заинтересованы в применении дезагрегаторов белков для устранения неправильно свернутых токсичных белковых конформеров. В частности, мы разрабатываем Hsp104, гексамерный белок AAA+ из дрожжей, который обладает уникальной способностью солюбилизировать как неупорядоченные агрегаты, так и амилоид и возвращать белки к их нативным конформациям. В то время как Hsp104 высоко консервативен у эукариот и эубактерий, у него нет известного гомолога многоклеточных. Hsp104 обладает лишь ограниченной способностью устранять неупорядоченные агрегаты и амилоидные волокна, участвующие в заболеваниях человека. Таким образом, мы стремимся разработать варианты Hsp104, чтобы обратить вспять неправильное сворачивание белка, участвующее в нейродегенеративных расстройствах. Мы разработали методы скрининга больших библиотек вариантов Hsp104 на предмет подавления протеотоксичности у дрожжей. Поскольку дрожжи склонны к спонтанному неспецифическому подавлению токсичности, был разработан двухэтапный процесс скрининга для исключения ложноположительных результатов. Используя эти методы, мы идентифицировали ряд потенцированных вариантов Hsp104, которые мощно подавляют токсичность и агрегацию TDP-43, FUS и α-синуклеина. В данной статье мы описываем этот оптимизированный протокол, который может быть адаптирован к экранным библиотекам, построенным с использованием любой белковой основы для подавления токсичности любого белка, токсичного в дрожжах.
Введение
Дрожжи модели proteinopathy были разработаны для белок-неправильного сворачивания расстройств, включая боковой амиотрофический склероз (ALS) и болезнь Паркинсона (PD) 1-3. Экспрессия белков TDP-43 и FUS, которые misfold у пациентов с БАС, являются токсичными и mislocalize с образованием агрегатов цитоплазматические в дрожжах 1,2. Аналогично, выражение α-синуклеина (α-син), который участвует в PD, является токсичным и mislocalizes с образованием агрегатов цитоплазматические в дрожжах 3. Эти особенности резюмировать фенотипы у больных с этими расстройствами 4,5. Таким образом, модели дрожжей обеспечить полезную платформу для ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Библиотека поколения
- Для построения библиотеки Hsp104 помощью предметно-ориентированный подвержены ошибкам ПЦР, сначала усиливается область интереса с ошибкой склонны ДНК-полимеразы 20.
- Очищают путем ПЦР-продукт экстракции геля.
- Выполните шаг расширения megaprimer с использованием стандартного протокола сайт-направленного мутагенеза: объединить 50 нг шаблона плазмиды, 250 нг megaprimer, 200 мкМ дНТФ, и с высокой точностью воспроизведения ДНК-полимеразы в ПЦР буфере, и доводят до 50 мкл общего объема с ПЦР воду, содержащую 20 , Запустите стандартную программу ПЦР.
Примечание: специфические праймеры, исполь....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Мы построили библиотеку вариантов Hsp104 рандомизированных в средней области и отбор ее для подавления TDP-43 токсичности. Библиотека была преобразована и высевали на глюкозу и галактозу пластин (рисунок 2) для оценки жесткости экрана. Единичные колонии отбирали и штаммы были выбраны с помощью счетчика к 5-FOA для удаления плазмиды Hsp104. Эти штаммы были тогда оценены подтвердить, что токсичность было связано с TDP-43 только, без вариантов Hsp104. Зрительные анализы из подмножества вариантов, выбранных.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы представляем наш подход к изоляции потенцированные варианты Hsp104, которые подавляют токсичность, ассоциированных с заболеваниями подложек с использованием моделей дрожжи proteinopathy. Используя этот подход, большие библиотеки вариантов может быть показан в высокой пропускной способности, с единственным ограничением является количество вариантов, которые проходят вторичную экран 5-ФА. Выполнив эти действия в 96 формате также, мы обычно экран до 200 ударов в то время, на этапе 5-FOA на протяжении 1-2 недель. Ч.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы благодарим Сью Линдквист, Аарона Гитлера и Мартина Дуэннвальда за любезно предоставленные реагенты. Наши исследования были поддержаны: Постдокторской стипендией Американской кардиологической ассоциации (M.E.J); Награда директора NIH «Новый новатор» DP2OD002177 года, NIH присуждает R21NS067354, R21HD074510 и R01GM099836 года, исследовательскую премию Ассоциации мышечной дистрофии (MDA277268), Центр исследований БАС Паккарда при Университете Джона Хопкинса, Target ALS и премию Медицинского фонда Эллисона «Новый стипендиат в области старения» (J.S.).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Набор для мутагенеза GeneMorphII EZClone Domain | Agilent | 200552 | |
| 150 мм Чашки | Петри Falcon | 351058 | |
| 5-фториатовой кислотой | Research Products | International f10501-5.0 | |
| 96-DeepWell 2 мл Планшеты | Eppendorf | 0030 502.302 | |
| 96 bold replicator tool | V& P Scientific | vp-404 | |
| ExoSAP-IT | Affymetrix | 78200 |
Ссылки
- Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (17), 6439-6444 (2008).
- Sun, Z., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
