Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Синтез Immunotargeted Магнето-плазмонное Нанокластеры

14.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52090

⸱

22 августа 2014 г.

 , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Texas at Austin, 2Department of Imaging Physics, University of Texas M.D. Anderson Cancer Center

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы опишем протокол для синтеза магнитооптических плазмонное наночастиц с сильным магнитным моментом и сильным ближней инфракрасной (NIR) оптической плотности. Протокол также включает антитела сопряжение с наночастицами через фрагмента Fc для различных биомедицинских применений, которые требуют молекулярную специфическое нацеливание.

Аннотация

Магнитные и плазмонных свойства в сочетании в одном наночастицы обеспечивают синергию, которая выгодно в ряде биомедицинских приложений, включая контрастным усилением в новых магнитодвижущих методов визуализации, одновременного захвата и обнаружения циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК), и мультимодальных молекулярной визуализации в сочетании с фототермической терапии раковых клеток. Эти приложения стимулировали значительный интерес к разработке протоколов для синтеза магнитооптических плазмонное наночастиц с оптическим поглощением в ближней инфракрасной (NIR) области и сильного магнитного момента. Здесь мы представляем новый протокол для синтеза таких гибридных наночастиц, основанный на методе микроэмульсии масло-в-воде. Уникальная особенность протокола, описанного здесь является синтез магнито-плазмонное наночастиц разного размера из первичных блоков, которые также имеют магнитно-плазмонных характеристики. Такой подход позволяет получить наночастицы с высокой денплотность магнитного и плазмонных функциональных возможностей, которые равномерно распределены по всему объему наночастиц. Гибридные наночастицы могут быть легко функционализованный путем присоединения антител через фрагмента Fc оставляя часть Fab, который отвечает за связывание антигена доступные для таргетинга.

Введение

Гибридный наночастицы, состоящие из различных материалов с различными физико-химическими свойствами может открыть новые возможности в биомедицинских приложениях, включая мультимодальный молекулярной визуализации, доставка терапии и мониторинга, новой скрининга и диагностических тестов 1-3. Сочетание плазмонных и магнитных свойств в одиночной наночастицы представляет особый интерес, поскольку она обеспечивает очень сильные рассеяния и поглощения света сечения, связанные с плазмонных резонансов и отзывчивость к магнитному полю. Например, магнито-плазмонных наночастиц были использованы для увеличения контрастности в темном поле визуализации меченых клеток путем применения временной модуляции сигнала с помощью внешнего электромагнита 3-5. Совсем недавно, аналогичный принцип был применен в разработке нового изображения модальности - магнито-ФА изображений, где магнито-плазмонное наночастицы позволят большие усовершенствования контрастности и сигнал-фон крысыIO 6,7. Было также показано, что гибридные наночастицы могут быть использованы для одновременного захвата и обнаружения циркулирующих опухолевых клеток в цельной крови и в естественных 8,9. Кроме того, магнито-плазмонных наночастицы являются перспективными theranostic агенты, которые могут быть использованы для молекулярной конкретной оптической и МР-томографии в сочетании с фототермической терапии раковых клеток 10.

Несколько подходов были изучены для синтеза магнитооптических плазмонное наночастиц. Например, Ю. и соавт. Использовали разложения и окисления Fe (CO) 5 на золотых наночастиц с образованием гантелевидные бифункциональные Au-Fe 3 O 4 наночастиц 11. Ван и др. Синтезировали с золотым покрытием железа наночастиц оксида с помощью метода термического разложения 12. Некоторые другие подходы опираются на полимерным покрытием или аминов функциональных молекул на магнитных основных наночастиц с последующим осаждением AGстарый оболочки на полимерной поверхности, чтобы создать гибрид частиц 7,13. Кроме того, наночастицы оксида железа были прикреплены к золотых наностержней с помощью электростатических взаимодействий или химической реакции 14,15. Хотя эти подходы дают магнито-плазмонных наноструктур, они ставят под угрозу в некоторой степени свойства магнито-плазмонное комбинации, такие как оптический поглощения в ближней инфракрасной окне (NIR) или сильного магнитного момента оба из которых являются весьма желательно в биомедицинских применений. Например, гантели Au-Fe 3 O 4 наночастицы имеют плазмонного резонанса пик при 520 нм, что ограничивает их применение в естественных условиях в связи с высокой мутности ткани в этой области спектра. Кроме того, магнитооптические плазмонный наночастицы, полученные текущих протоколов ограничиваются только одного или нескольких 11 (менее 10) 14,15 суперпарамагнитных фрагменты (например, наночастиц оксида железа), что значительно меньше, чем можно было бы ACHieved в плотно упакованной наноструктуры. Например, плотно упакованный диаметр 60 нм сферические наночастицы могут содержать порядка тысячи 6 нм суперпарамагнит- наночастиц. Поэтому, есть большая комната для улучшения магнитных свойств гибридных наночастиц. Кроме того, некоторые из описанных выше протоколов являются относительно сложными и требуют тщательной оптимизации, чтобы избежать агрегации частиц в процессе синтеза 14,15.

Здесь мы опишем протокол для синтеза магнитооптических плазмонное наночастиц с сильным магнитным моментом и сильным NIR поглощения, что рассматриваются важнейшие ограничения текущего искусства. Синтез имеет свои истоки в масло-в-воде методом микроэмульсионной 16. Он основан на сборке наночастиц нужного размера из гораздо меньшего первичных частиц. Этот подход был успешно использован для получения наноструктур из одного материала, такие как золото, оксид железа, и полупроводниковой PRIМэри частиц 16. Мы расширили его синтеза магнито-плазмонный наночастиц, прежде всего, что делает сердцевину из оксида частиц 6 нм Диаметр золотой оболочки / железа и, затем, монтаж первичные гибридных частиц в конечном сферической наноструктуры. Сборка первичные частицы в нанокластеров не только позволяет повысить свойства составных наночастиц, таких как обеспечение более тесных магнитный момент при сохранении суперпарамагнитные свойства, но также использует преимущества взаимодействия между отдельными наночастицами создавая тем самым новые характеристики, отсутствующие из учредительных наночастиц, такие как сильный оптического поглощения в окне NIR. Этот протокол дает гибридных наночастиц с высокой плотностью магнитного и плазмонных функциональных возможностей. После первичные частицы синтезируются, наш метод по сути является простая реакция однореакторный. В целом прочность плазмонного резонанса и магнитный момент определяется число первичных частиц и имеет такие дополнительныеEfore, легко можно оптимизировать в зависимости от приложения. Кроме того, мы также разработали процедуру для антител сопряжения для гибридных наночастиц для различных биомедицинских приложений, которые требуют молекулярную специальными программами. Антитела прикрепляются через фрагмента Fc оставляя часть Fab, который отвечает за связывание антигена доступные для таргетинга.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1.-измерительные приборы и стеклянная посуда Подготовка

  1. Использовать подходящую защитную одежду, то есть халат, одноразовые перчатки и защитные очки.
  2. Подключение круглодонную колбу с конденсатором и погружают ее в ванну силиконового масла с контролем температуры с помощью термометра. Поместите источник тепла (например, горячей пластины) под масляной бане (Рисунок 1). Используйте термометр, способный измерять температуру выше, чем 260 ° C.

2 Синтез Первичная Hybrid Магнето-плазмонных Наночастицы

  1. Создание магнитопровода наночастиц
    1. Добавить 353,2 мг (1 ммоль) железа (III) ацетилацетоната, 1 мл (2 ммоль) олеиновой кислоты, 1 мл (2 ммоль) олеиламином, 1,292 г (5 ммоль) 1,2-hexadecanediol и 10 мл фенилового эфира в круглодонную -bottom колбу.
    2. Смесь перемешивают энергично с помощью магнитной мешалки-бар и тепло в 250-260 ° С в течение 1 ч с обратным холодильником. Затем подождите, пока решение для охлаждениядо комнатной температуры. Убедитесь, что температура в 260 ° С, чтобы предотвратить вскипание фенильного эфира и предотвратить взрыв реакционной смеси с круглодонную колбу в конденсатор.
      ВНИМАНИЕ: реакционную смесь до высоких температур и химических веществ может вызвать раздражение. Должен работать под вытяжкой и носить соответствующую индивидуальной защиты. Обеспечить достаточную вентиляцию для масляной ванне.
      Примечание: в масляной ванне поддерживают на уровне 250-260 ° С в течение температуре 1 ч, в процессе синтеза магнитных наночастиц. В принципе, стекло пирекс тарелки могут быть использованы для этой цели. Тем не менее, максимальная рабочая температура для Pyrex стекла ~ 260 ° C в соответствии с информацией производителя. Поэтому, металлический контейнер обеспечивает безопасный вариант для реакции, как это может выдерживать высокую температуру и длиться дольше во время нескольких трасс.
  2. Осаждения золотую оболочку на магнитных основных наночастиц
    1. Добавить 411,5 мг (1,1 ммоль) золотую тузTate, 0,25 мл (0,75 ммоль) олеиновой кислоты, 1,5 мл (3,0 ммоль) олеиламином, 775,3 мг (3 ммоль) 1,2-hexadecanediol, и 15 мл фенилового эфира в круглодонную колбу.
    2. Добавить 5 мл суспензии магнитных наночастиц с шага 2.1. Реакционную смесь нагревают до 180 ° С и хранить с обратным холодильником в течение 1 часа. Дождитесь раствор остынет до комнатной температуры.
    3. Добавить 50 мл этанола, чтобы осадить гибридные первичных наночастиц с последующим центрифугированием при 3250 × г в течение 15 мин.
    4. Ресуспендируют осадок в 25 мл гексана при использовании ультразвукового ванны. Добавить 25 мл этанола, чтобы осадить первичные гибридных наночастиц. Центрифуге при 3250 х г в течение 15 мин и ресуспендируют осадок в гексане. Повторите этот шаг три раза.
    5. Высушите осажденных первичной гибридные наночастицы в вакуумном эксикаторе O / N. Подтвердите, что частицы полностью высохли.

3 Hybrid магнито-плазмонных Нанокластеры Синтез и Размер Разделение

  1. Ресуспендируют 5 мг сухих первичных гибридных наночастиц в 1 мл гексана при использовании ультразвукового ванны. Обрабатывают ультразвуком суспензию наночастиц, пока не виден осадок не присутствует.
  2. Добавить раствор с шагом 3,1 до 10 мл водного раствора додецилсульфата натрия (2,8 мг / мл) в стекл нный сосудик на 20 мл с прикрепленными крышками. Добавьте суспензии первичного капли гибридные наночастицы по капле, чтобы избежать смешивания двух фаз перед следующим этапом.
  3. Разрушать ультразвуком двухфазный раствор в ванне для обработки ультразвуком в течение 2 часов с последующим нагреванием на водяной бане при температуре 80 ° С в течение 10 мин. Дождитесь раствор остынет до комнатной температуры.
    1. Заполните воду в операционной линии уровня обработки ультразвуком ванной. Сосредоточьте стеклянный пузырек в ультразвуковой обработки ванны. Эмульсии формы сразу между двумя фазами. Встряхнуть двухфазный решение вручную после начала обработки ультразвуком; это облегчает смешивание между фазы, содержащей первичные гибридные наночастицы и нижней водной фазы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не забывайте Thaт для обработки ультразвуком нагреется после 2 часов работы.
  4. Центрифуга гибридный нанокластеров суспензии при 100 х г в течение 30 мин. Собрать как осадок и супернатант. Ресуспендируют осадок в 0,1 мМ цитрата натрия при 10 мин ультразвуком. Ожидаемый размер нанокластеров является ~ 180 нм в диаметре.
  5. Передача супернатант от стадии 3,3 к новому коническую трубку.
  6. Центрифуга суспензии со стадии 3,4 при 400 мкг в течение 30 мин. Собрать как осадок и супернатант. Ресуспендируют осадок в 0,1 мМ цитрата натрия при 10 мин ультразвуком. Ожидаемый размер нанокластеров является ~ 130 нм в диаметре.
  7. Передача супернатант от стадии 3,5 к новому коническую трубку.
  8. Центрифуга суспензии со стадии 3,6 на 1500 мкг в течение 30 мин. Соберите осадок и ресуспендируют в 0,1 мМ цитрата натрия при 10 мин ультразвуком. Ожидаемый размер нанокластеров является ~ 90 нм в диаметре.
  9. Добавить 300 _6; л нанокластер подвеска к микропланшетного 96-а для измерения спектра поглощения УФ-VIS-NIR. Бросьте 10 мкл нанокластеров подвеску на газ медную сетку, покрытую для визуализации ПЭМ.

4 Сопряжение моноклональных антител к нанокластеров

  1. Подготовьте 100 мкл моноклонального антитела раствор (1 мг / мл) в PBS, рН 7,2, например, анти-рецептор эпидермального фактора роста 2 (HER2) антитела или анти-рецептор эпидермального фактора роста 1 (EGFR) антитела.
  2. Добавить раствор антител со стадии 4.1 до 3.9 мл 4 мМ HEPES, рН 7,2. Центрифуга раствора через 10 К MWCO центробежным фильтром на 3250 мкг в течение 20 мин при 8 ° С. Ресуспендируют антитела в 4 мМ HEPES, рН 7,2, до конечного объема 100 мкл.
    Примечание: Эта стадия осуществляется, чтобы заменить исходный носитель в раствор антител с HEPES.
  3. Добавить 10 мкл 100 мМ NAIO 4 до 100 мкл раствора антител. Накройте реакции флакон с альuminum фольги при комнатной температуре и перемешивают в течение 30 мин с помощью орбитального шейкера.
  4. Реакцию гасят путем добавления 500 мкл 1х PBS.
  5. Добавить 2 мкл 46,5 мМ линкерным решения (dithiolaromatic PEG6-CONHNH 2) в раствор антител с шага 4.4 и встряхивают в течение 1 часа при комнатной температуре.
  6. Фильтр решение с помощью центрифуги фильтр 10 к MWCO в 3250 мкг в течение 20 мин при 8 ° C. Ресуспендируют антитела в 1х PBS до конечного объема 100 мкл, что приводит к концентрации антитела ~ 1 мг / мл.
  7. Смешайте 100 мкл суспензии при нанокластеров OD ~ 1,0 с 1 мкл модифицированные антитела с шагом 4,6 (1 мг / мл) в течение 120 мин при комнатной температуре.
  8. Добавить 10 мкл 10 -3 М 5 кДа тиольным ПЭГ и встряхивают в течение 15 мин при комнатной температуре.
  9. Центрифуга раствора при 830 х г в течение 3 мин. Жидкость над осадком сливают и вновь суспендируют осадок в 100 мкл 2% вес / объем 5 кДа PEG в PBS, рН 7,2.
  10. Измерить поглощение спектр нанокластеров антител, конъюгированных и сравните с тон абсорбцию спектр голых нанокластеров. Ожидайте пару нанометров красного смещения после сопряжения.
  11. Если наночастицы агрегат, как показано на значительный сдвиг при увеличении оптической плотности в области красно-NIR, увеличение концентрации тиола ПЭГ до 5 × 10 -3 М Кроме того, увеличение времени инкубации с тиол ПЭГ до 30 мин и уменьшить центробежную скорость в 200 с шагом XG.
  12. Для испытания маркировки клеток рака, добавьте антитело, конъюгированное наночастиц с шага 4,9 до рака клеточной суспензии либо в среде, либо 1X PBS (1 мл ~ 10 6 клеток) и перемешивают в течение 60 мин.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Схема синтеза immunotargeted магнито-плазмонное нанокластеров показано на рисунке 2. Впервые, магнитные Fe 3 O 4 наночастицы оксида железа синтезируются с помощью метода термического разложения. Затем тонкий около 1 нм золотой оболочки осаждают на железный сердечник оксида частиц через термического разложения. Первичные ок 6 нм гибридные наночастицы служат семена, чтобы создать магнитно-плазмонное нанокластеров за счет использования микроэмульсии подход масло-в-во...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Критические шаги в успешной синтеза магнитооптических плазмонное нанокластеров включают создание высоко монодисперсных первичной золотые оболочки / с железным сердечником наночастиц оксида и направляя самосборку первичных частиц в нанокластеров. Молярное соотношение между первичными частицами и поверхностно-активных веществ играют важную роль в определении распределения по размерам нанокластеров. Неравномерное распределение размер первичных наночастиц может привести к образованию больших агрегатов во время сборки магнит...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Благодарности

Эта работа была частично поддержана грантами NIH R01 EB008101 и R01 CA103830.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
PYREX 50 мл круглодонная кипящая колба с коротким горлышком и соединением 24/40 [ST]Corning4320A-50Реакция термического разложения
PYREX 41 x 300 мм 5-колбовый конденсатор Allihn с наружными/внутренними соединениями 24/40 [ST]Corning2480-300Реакция термического разложения
Силиконовое маслоFisherS159-500Масляная баня
Мешалка с горячей пластинойCorningPC-351Нагревать реакцию с функцией перемешивания
ТермометрThermoWorks221-092Измерять температуру
Ацетилацетонат железа(III)FisherAC11913-0250Материал для синтеза первичных гибридных наночастиц
Олеиновая кислота 99%FisherA195-500Материал для синтеза первичных гибридных наночастиц
Ацетат золота(III)FisherAA3974206Материал для синтеза первичных гибридных наночастиц
HexaneFisherH292-1Материал для синтеза первичных гибридных наночастиц
Фениловый эфир 99%FisherAC13060-0025Материал для синтеза первичных гибридных наночастиц
1,2-гексадекандиол 90%Sigma213748-50GМатериал для синтеза
первичных гибридных наночастицОлейламин 70%SigmaO7805-100GМатериал для синтеза первичных гибридных наночастиц
Додецилсульфат натрияFisherBP166-100Кластерный синтез
Дигидрат цитрата натрияSigmaW302600Кластерный синтез
Моноклональное антитело к рецептору EGFSigmaE2156Тест специфичности маркировки клеток
Моноклональный анти-HER2 антителоSigmaAMAB90627Тест специфичности маркировки клеток
периодатанатрия Sigma311448Oxidate Fc область антител
Dithiolaromatic PEG6-CONHNH2SensoPath TechnologiesSPT-0014BГетерофункциональный линкер для конъюгации антител с нанокластерами
Methoxy-PEG-thiol, 5 kCreative PEGworksPLS-604Пассивировать оставшуюся поверхность золота после конъюгации антител
Амикон Ультра-4 центробежная фильтрующая установка с мембраной Ultracel-10МиллипорUFC801008Очистка белка
HEPESSigmaH3375Буфер
PBS, 1х растворFisherBP2438-20Буфер
УФ-Вид спектроскопияBioTek Synergy HTПолучение спектра
ЦентрифугаEppendorf5810RРазделение
Просвечивающий Электронный микроскопFEITECNAI G2 F20 X-TWINПолучение морфологии наноструктур
Вертикальный микроскопLeicaDM6000Получение изображений в темном поле
Ультразвуковой аппаратBranson1510
Ультразвуковая обработка Углеродная пленка 300 меш сеткаEMSCF300-CuTEM imaging
96-луночная пластинаCorning09-761-145УФ-Вид считывающая пластина

Ссылки

  1. Bigall, N. C., Parak, W. J., Dorfs, D. Fluorescent, magnetic and plasmonic—Hybrid multifunctional colloidal nano objects. Nano Today. 7, 282-296 (2012).
  2. Gautier, J., Allard-Vannier, E., Herve-Aubert, K., Souce, M., Chourpa, I. Design strategies of hybrid metallic nanoparticles for theragnostic applications. Nanotechnology. 24, 432002(2013).
  3. Wei, Q., Wei, A. Optical imaging with dynamic contrast agents. Chemistry. 17, 1080-1091 (2011).
  4. Aaron, J. S., et al. Increased optical contrast in imaging of epidermal growth factor receptor using magnetically actuated hybrid gold/iron oxide nanoparticles. Optics express. 14, 12930-12943 (2006).
  5. Song, H. -M., Wei, Q., Ong, Q. K., Wei, A. Plasmon-resonant nanoparticles and nanostars with magnetic cores: synthesis and magnetomotive imaging. ACS nano. 4, 5163-5173 (2010).
  6. Qu, M., et al. Magneto-photo-acoustic imaging. Biomedical optics express. 2, 385-396 (2011).
  7. Jin, Y., Jia, C., Huang, S. -W., Donnell O&39, M., Gao, X. Multifunctional nanoparticles as coupled contrast agents. Nature communications. 1, 41(2010).
  8. Wu, C. -H., et al. Versatile Immunomagnetic Nanocarrier Platform for Capturing Cancer Cells. ACS. 7, 8816-8823 (2013).
  9. Galanzha, E. I., et al. In vivo magnetic enrichment and multiplex photoacoustic detection of circulating tumour cells. Nature nanotechnology. 4, 855-860 (2009).
  10. Larson, T. A., Bankson, J., Aaron, J., Sokolov, K. Hybrid plasmonic magnetic nanoparticles as molecular specific agents for MRI/optical imaging and photothermal therapy of cancer cells. Nanotechnology. 18, 325101(2007).
  11. Yu, H., et al. Dumbbell-like bifunctional Au-Fe3O4 nanoparticles. Nano letters. 5, 379-382 (2005).
  12. Wang, L., et al. Monodispersed core-shell Fe3O4@Au nanoparticles. The journal of physical chemistry. B. 109, 21593-21601 (2005).
  13. Wang, H., Brandl, D. W., Le, F., Nordlander, P., Halas, N. J. Nanorice: a hybrid plasmonic nanostructure. Nano letters. 6, 827-832 (2006).
  14. Hu, X., et al. Trapping and Photoacoustic Detection of CTCs at the Single Cell per Milliliter Level with Magneto‐Optical Coupled Nanoparticles. Small. 9, 2046-2052 (2013).
  15. Truby, R. L., Emelianov, S. Y., Homan, K. A. Ligand-mediated self-assembly of hybrid plasmonic and superparamagnetic nanostructures. Langmuir. 29, 2465-2470 (2013).
  16. Bai, F., et al. A Versatile Bottom‐up Assembly Approach to Colloidal Spheres from Nanocrystals. Angewandte Chemie International Edition. 46, 6650-6653 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Магнитоплазмонные наночастицыядро из оксида железаосаждение золотой оболочкимасляно-водная микроэмульсияконъюгация с антителамивизуализация в темном полепоглощение в ближнем инфракрасном диапазонециркулирующие опухолевые клеткимультимодальная молекулярная визуализацияфототермическая терапия
Синтез Immunotargeted Магнето-плазмонное Нанокластеры
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.