Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Вывод Т-клеток In Vitro От эмбриональных стволовых клеток мыши

10.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52119

⸱

14 октября 2014 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Hunter College and Graduate Center, City University of New York, 2Sunnybrook Research Institute, Department of Immunology, University of Toronto

В этой статье

Краткое содержание

Эмбриональные стволовые клетки мыши могут быть дифференцированы в Т-клетки in vitro с использованием системы совместного культивирования OP9-DL1. Успех этой процедуры требует тщательного внимания к обслуживанию реагентов/клеток и ключевым этапам, чувствительным к технике. В этой статье мы обсудим эти критические параметры и предоставим подробный протокол, который будет способствовать внедрению этой технологии.

Аннотация

Система совместного культивирования OP9/OP9-DL1 стала хорошо зарекомендовавшим себя методом получения дифференцированных типов клеток крови от эмбриональных и гемопоэтических предшественников как мышиного, так и человеческого происхождения. В настоящее время он используется для решения растущего разнообразия сложных генетических, клеточных и молекулярных вопросов, связанных с кроветворением, и находится на переднем крае усилий по переводу этих основных результатов в терапевтическое применение. Процедуры просты и обычно дают устойчивые результаты. Однако достижение успешной гемопоэтической дифференцировки in vitro требует особого внимания к деталям поддержания реагентов и клеточных культур. Кроме того, протокол включает в себя шаги, чувствительные к технике, которые, хотя и не сложны, требуют заботы и практики для освоения. Здесь мы сосредоточимся на процедурах дифференцировки Т-лимфоцитов из эмбриональных стволовых клеток мыши (mESC). Мы предоставляем подробный протокол с обсуждением критических этапов и параметров, которые обеспечивают воспроизводимую надежную клеточную дифференцировку in vitro. В интересах отрасли рассмотреть вопрос о более широком внедрении этой технологии, поскольку она может сократить использование животных, снизить стоимость и сократить сроки как базовых, так и трансляционных экспериментов.

Введение

Создана система клеточных культур, в которой эмбриональные стволовые клетки мыши (mESC) дифференцируются в Т-клетки in vitro.1 Эта система использует способность передачи сигналов Notch управлять дифференцировкой Т-клеток. 2 Клеточная линия OP9-DL1 была создана путем трансдукции полученных из костного мозга клеток OP93 с помощью Notch-лиганда, Delta-подобного 1 (DL1). 4 Активация сигнального каскада Notch in vitro способствует развитию Т-клеток, исключая другие клеточные линии. С включением соответствующих цитокинов эта система обеспечивает «микроокружение» клеточной культуры, которое поддерживает последовательное продвижение mESC к гемопоэтическим и, в конечном счете, Т-клеточным линиям. Эта система поддерживает проточную цитометрическую идентификацию Т-клеток на различных стадиях развития, наблюдаемых во время нормального онтогенеза Т-клеток в тимусе. Для исследования отдельных вопросов, связанных с развитием Т-клеток, эта процедура стала привлекательной альтернативой in vivo моделям целых мышей 5 и методам культивирования органов тимуса плода in vitro, используемым для получения развития Т-клеток из гемопоэтических предшественников эмбриональных стволовых клеток мыши. 6 Основное преимущество системы совместного культивирования OP9 заключается в том, что она включает в себя стандартные и простые методы культивирования клеток и не зависит от постоянного использования экспериментальных животных.

Мы следуем подробному, ранее опубликованному протоколу в наших экспериментах с использованием этого подхода. 7 Мы использовали эту технологию для изучения продуктов гемопоэтической дифференцировки клонов mESC без манипуляций, высококачественных клонов mESC, отобранных вручную для получения химерныхэмбрионов8, и стабильно трансфицированных клонов ESC, полученных непосредственно в результате селекции лекарств. 9 Мы отметили, что временная кинетика начальной дифференцировки in vitro от mESC до мезодермоподобных колоний в этой модели может варьировать среди отдельных клонов. Кокультуры mESC-OP9 могут быть визуально оценены на предмет прогрессирования в мезодерму. В то время как обычно это завершается к пятому дню совместной культуры, у отдельных клонов завершение может быть отложено на один или два дня. Количественное (~80-90%) образование мезодермы должно быть достигнуто до переноса для получения оптимального формирования гемопоэтических клеток-предшественников (HPC) и стойкого лимфопоэза. Таким образом, при работе с несколькими клонами mESC этот проход «5-го дня» лучше всего отложить до тех пор, пока все клоны не завершат переход к мезодермоподобным колониям. Это обеспечивает синхронность последующего развития среди клонов после их перехода в условия гемопоэтической дифференцировки. Через три дня после пассирования 80-90% мезодермальных образований из монослоев OP9 собирают ГПК. HPC могут быть засажены в новые клетки OP9 для обеспечения дифференцировки моноцитарных, эритроидных и В-клеточных линий. В качестве альтернативы, HPC могут быть засеяны в клетках OP9-DL1 и направлены на развитие Т-клеток. Все культуры для дифференцировки in vitro получают Flt-3L, начиная с 5-го дня, с дальнейшим добавлением IL-7, начиная с 8-го дня. Анализ проточной цитометрии, выполненный в различные моменты времени в ходе эксперимента, позволяет отслеживать прогресс на этапах и линиях дифференцировки кроветворения и развития Т-клеток. Двойные положительные (DP) Т-клетки CD4/CD8 начинают появляться к 16-му дню совместного культивирования, а одинарные положительные (SP) клетки DP и CD8 в изобилии появляются к 20-му дню. Общий результат и устойчивость сокультуры в значительной степени зависят от способности визуально убедиться в завершении важных поворотных моментов в развитии, которые происходят. Этот протокол призван стать руководством по распознаванию этих этапов, а также других критических параметров, которые являются ключом к успешной дифференциации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1 приготовления питательных сред, цитокинов и клейстеризованный Плиты

  1. Подготовьте ES клеток носителя с помощью Модификация Дульбеко из Орла (DMEM) с высоким содержанием глюкозы и пирувата натрия. Добавить 20% ESC квалифицированных эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), 1% пенициллина / стрептомицина, 1% L-глутамина, 1% HEPES буфера, 1% заменимых аминокислот, 0,1% гентамицин (50 мг / мл) и 0,1% ( 55 мкМ) β-меркаптоэтанола. Стерилизовать ES клеток СМИ фильтрацией.
  2. Подготовьте OP9 СМИ, сделав 1 л Альфа минимальной основной среде (α-MEM) из порошка в соответствии с инструкциями изготовителя. Добавить 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина / стрептомицина. Обратить перемешать. Стерилизовать фильтрацией на две 500 мл аликвоты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: использование средств массовой информации, изготовленных из порошка рекомендуется и, вероятно, обеспечить улучшенное обслуживание OP9 клеток и в пробирке результатов дифференциации. Этот подход стал нашим стандартная процедура. Тем не менее, мы также отмечаем, тхат мы порой используется предварительно сделанные жидкие α-MEM с адекватной успеха.
  3. Подготовка замораживания носитель путем добавления 10% диметилсульфоксид (ДМСО) до 90% FBS. Вихревой нежно и стерилизовать фильтрацией. Хранить при 4 ° С.
  4. Подготовка 2,000x Flt-3 лиганд (10 мкг / мл), раствор человеческого рекомбинантного Flt-3 лиганд (Flt-3 л) в полном OP9 сред до 10 мкг / мл. Алиготе в 1,5 мл микроцентрифужных пробирках и хранить при -80 ° C. Следуйте рекомендациям поставщика относительно стабильности и хранения.
    Примечание: Стабильность FLT-3L короткий (1 месяц при 4 ° С или 3 месяца при температуре -80 ° С).
  5. Подготовка 1,000x IL-7 (1 мкг / мл) с помощью полного OP9 носитель. Алиготе в 1,5 мл микроцентрифужных пробирках и хранить при -80 ° C. Следуйте рекомендациям поставщика о стабильности и хранения (IL-7 является стабильным в течение 12 месяцев при -80 ° С).
  6. Подготовьте 1,000x фактор ингибирования лейкоза (LIF) (10 мкг / мл) на разведении 10 7 единиц LIF I 1:10н ES клеток СМИ. Магазин аликвоту при 4 ° С. Обязательно обратите внимание на дату окончания срока действия, предоставляемая производителем на аликвотные флаконах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Продукт устойчив в концентрированных или разбавленном виде, по крайней мере 18 месяцев с даты изготовления.
  7. Подготовка желатинизированный пластины 6-хорошо добавить 1,5 мл 0,1% раствора желатина в каждую лунку 6-луночного планшета. Оставьте посуду в стерильных капот при комнатной температуре с крышками на, что позволяет по меньшей мере 30 мин для покрытия. Блюда могут быть также оставили в увлажненном инкубаторе в течение ночи. Удалите остатки раствора желатина прямо перед посева клеток. Не позволяйте раствор желатина полностью высохнуть в скважине.

2 Подготовка и обслуживание фидерных клеток и эмбриональных стволовых клеток мыши (Mesc)

ПРИМЕЧАНИЕ: Выдержите все клетки в увлажненной 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2.

  1. Размораживание эмбриональных фибробластов мыши (MEF)
    1. Быстрый таять замороженный флакон (~ 5 х 10 6 клетки / флакон) из митомицином C обращению (или иным митотически арестован) MEFs и перенести их на 15 мл трубки.
    2. Добавить 8 мл ЭС клеток СМИ к талых клеток, в каплям моды постепенно разбавить ДМСО из морозильного среды.
    3. Центрифуга клетки при 400 х г при 4 ° С в течение 5 мин. Осторожно удалите супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 3 мл ЭС клеток СМИ.
    4. Приготовьте 50 мл центрифужную пробирку с 33 мл подогретого клеток СМИ ES. Добавьте 3 мл ресуспендированных MEFs довести до конечного объема 36 мл.
    5. Распределить 3 мл ресуспендированных MEFs в каждую лунку двух желатинизированный 6-луночных планшетах. Место пластин в инкубаторе в течение не менее шести часов, чтобы позволить клеткам прикрепляться и распространено до посева mESCs на них. Эти митотически арестованные фидерные слои можно будет использовать в течение нескольких дней после первоначального посева, если их СМИ меняется каждые 2-3 дня.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Только что арестованные MEFs также может быть использован.
    6. Посев mESCs
      1. Быстрый таять пузырек с замороженной Mesc клона в C водяной бане 37 ° и подготовить клетки, как описано в 2.1.1-2.1.3.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Мы заморозить 2 флаконов мЭСК от сливной лунку 6-луночного планшета.
      2. Удалить материал из одной скважины (за MESC клона) на 6-луночный планшет с задержанных MEF монослоев (полученного на стадии 2.1.5) и семян в 3 мл mESCs на верхней части MEF монослое. Добавить 3 мкл 1,000x LIF (10 нг / мл). Возвращение блюда в инкубатор.
    7. Обслуживание сотового ES и трипсин опосредованной проход
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изменение СМИ в день, или раскол на основе слияния мЭСК. Оптимально, урожай и сплит / повторно пластины клетки через день.
      1. Удалить среда клеток ES и мыть mESCs с 2 мл PBS. Удалить PBS. Добавить 1 мл 0,25% трипсина и инкубировали при 37 ° С в течение 3-5 мин.
      2. Соберите трипсинизируют клетки и перенести их в 15 мл центрифужную пробирку. Энергично пипетки клеточной суспензии, чтобы разбить комки мЭСК. Добавить 2 мл полной клеток СМИ ES к клеточной суспензии для нейтрализации трипсина.
      3. Побочные клетки при 400 х г в течение 5 мин при 4 ° С. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 3 мл ЭС клеток средах.
      4. Удалить носитель из 6-луночные планшеты, содержащие приготовленные монослои задержанных MEF. Добавить соответствующее количество клеточной суспензии (в расчете на желаемом соотношении Split) в 3 мл ЭС клеток средах в каждую лунку быть заполнена. Добавить 3 мкл 1,000x интегратором. Конфлюэнтную Mesc хорошо разделить 1: 6 будет готов для прохода в 2 дня.
    8. OP9 / обслуживание OP9-DL1 клетки
      1. Оттепель флакон OP9 клеток (следуйте инструкциям 2.1.1-2.1.3 помощью OP9 СМИ)
      2. Добавить 7 мл OP9 СМИ до 10 см блюдо культуры ткани. Добавьте 3 мл ресуспендировали клеток в каплям образом, распределение клеток по всей пластине. Поместите клеток в течение ночи в инкубаторе.
      3. Проверьте впадении OP9 клеток на следующий день. Если блюдо содержит много мертвых плавающих клеток, Ремове СМИ и добавляют 10 мл свежего OP9 СМИ. Вернуться блюдо в инкубатор, если почти полный слияние не наблюдается. Сплит (используя трипсин) 1: 4 рядом сливающийся OP9 монослоя.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Плиты должны достичь такой же уровень слияния снова приблизительно 2 дней. Старайтесь не позволить OP9 клетки становятся более-сливной.
      4. Замораживание ранние отрывки из OP9 клеток как акции расширения.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Мы заморозить 2 флаконов OP9 клеток от одного возле сливной 10 см блюдо. Каждый флакон расширения складе может быть дополнительно распространяется создавать рабочие запасы, которые позднее используются в Mesc сокультуры экспериментов. Храните все OP9 запасы замороженных в жидком азоте, а не в -80 ° C морозильник, так как колебания температуры могут негативно повлиять на качество замерзает.

    3 OP9-DL1 Порядок Co-культура

    1. Сотрудничество культуры препараты
      1. Примерно за неделю до начала со-культуры, оттепель MEFs, mESCs и OP9 клеток рабочую STOCKS. С OP9-DL1 клетки не нужны, пока сокультуры день 8, оттепель клетки OP9-dL1 в течение первых трех дней после сокультуры инициации. Поддерживать или заморозить все клетки по мере необходимости.
      2. Определите начальное количество 10 см пластинах с OP9 монослоев клеток, подготовленных для достижения 80% слияния на сокультуре день 0 исходя из шкалы эксперимента (например, количество миллисекунд клонов должны быть дифференцированы и количество со-культуры временных точках, чтобы быть проанализированы). Для подготовки к совместной культуры, разделить возле сливной блюдо OP9 клеток между 1: 4 и 1: 6 на два дня раньше, когда монослои будут необходимы.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Один понадобится как минимум одну пластинку за ESC клона. Как правило, один клон, ESC, высевали на одной пластине (как описано ниже) на день 0 должно дать достаточное количество клеток, чтобы отобрать шесть пластин в день 5 прохода. Каждый день 5 пластина позволит один последующий момент времени анализ.
      3. С OP9 монослоя будет постоянно необходимы для сокультуры прохождения, заботиться, чтобы всегда maintaв достаточном количестве дополнительных OP9 пластин культуры параллельно с совместной культуре.
    2. День 0: Инициирование совместного культивирования
      1. Соберите Mesc как в 2.3.1-2.3.4. Граф клеток.
      2. Для каждого Mesc клона подготовить 5 х 10 4 миллисекунд в 10 мл OP9 СМИ за тарелку.
        Примечание: Несмотря на то, что мы не использовали его, следует отметить, что альтернатива среду, состоящую из α-MEM, 10% FBS, и 5 х 10 -5 М β-меркаптоэтанола Сообщалось также, для использования в дифференциации совместных культурах 10.
      3. Удалить старые СМИ от OP9 блюд и добавьте 10 мл мЭСК подвески к блюдам, заботящихся распространять клетки равномерно по всей пластине. Поместите посуду в 37 ° С инкубатор.
    3. День 3: изменение Медиа
      1. Удалить блюда из инкубатора и наблюдать под микроскопом. Колонии должны начать терять блеск и выглядят плоские.
      2. Удалить носитель из блюд и осторожно добавляют 10 мл свежего OP9СМИ.
      3. Возврат к со-чашки для культивирования в инкубатор. Визуально контролировать образование колоний мезодермы, как ежедневно, чтобы сообщить об этом сроки OP9 подготовки подачи монослоя для следующего прохода (день 5), который не должен быть проведен до ~ 80-90% колоний визуального отображения мезодермы-подобную морфологию. Максимальная отсрочка стадии переноса клеток день 5 2 дня.
    4. День 5: Трипсин опосредованной проход с предварительной металлизации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте заранее достаточное количество 10 см чашки с оптимально сливающихся OP9 клеток. Продолжайте следующих шагах, только если со-культуры визуального отображения функций, описанных в шаге 3.3.3 (см также Представитель Результаты).
      1. Удалить носители из со-чашки для культивирования. Добавить 4 мл PBS мыть. Вихревой PBS и удалить. Добавить 4 мл 0,25% трипсина и поместите посуду в инкубаторе в течение ~ 5 мин.
      2. Лишить слой трипсинизируют клеток энергичным пипетки, заботясь не вводить чрезмерные пузырьки воздуха, покаоднородным, в основном суспензию отдельных клеток достигается.
      3. Добавить 4 мл полных OP9 СМИ и перемешать с помощью пипетки. Передача клеток в новый пустой 10 см блюдо и поставьте в инкубаторе в течение 30 мин, чтобы позволить OP9 клетки придерживаться блюдо. Это "предварительно покрытие" шаг уменьшает количество клеток OP9 переданных к следующему шагу со-культуры.
      4. Подготовьте пробирками 50 мл с фильтров 40 мкм клеток.
      5. Сбор неприкрепленных клеток из предварительно покрытием блюдо и передавать их через ячейки сетчатого фильтра в трубке. Вымойте блюдо аккуратно с 6 мл PBS и передать его через тот же сито, оставив прилагаемые OP9 клетки сзади.
      6. Центрифуга клеток при 400 х г 5 мин при 4 ° С. Удалить супернатант и ресуспендируют клетки осаждали в 3 мл полной OP9 массовой информации. Граф клеток.
      7. Выньте материал из 10 см пластинах с оптимально сливающихся OP9 клеток.
      8. Для каждого анализа временной точке, семян 5 х 10 5 клеток на OP9 моноСлой в 10 мл конечного объема.
      9. Добавить 5 нг / мл человеческого рекомбинантного FLT-3L и поместите посуду в инкубаторе.
    5. День 8: гемопоэтических клеток-предшественников (HPC) коллекция
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте заранее достаточное количество 6-луночные планшеты с OP9 или OP9-DL1 монослоев клеток так, что они будут ~ 80% сливной времени для этого шага.
      1. Подготовьте пробирками 50 мл с 40 мкм фильтров.
      2. Снимите посуду из инкубатора и наблюдать под микроскопом. Блестящие кластеры HPCS следует косвенное отношение к OP9 монослоя. Собрать как многие из этих клеток, как это возможно путем промывки (но не чрезмерно нарушая) монослой OP9 с пипеткой и существующий СМИ на блюдо. Для предотвращения вспенивания, всегда оставляйте по крайней мере, 1 мл СМИ в кончике пипетки в течение этого сбора HPC / стадии промывки.
      3. Pass клеток через 40 мкм сито в трубку. Добавить 8 мл PBS в одной тарелке и проверить под микроскопом, если все HPCS мыповторно собраны. Повторите шаг стиральная / сбора с PBS и (при необходимости) с более принудительный мытья. Процедить клетки в трубу уже содержащей клетки из одной тарелки.
      4. Центрифуга клетки при 400 х г в течение 5 мин при 4 ° С.
      5. Подготовка основной смеси из 3 мл (на пластину высевали на 5-й день) в OP9 средах с 5 нг / мл Flt-3L и 1 нг / мл IL-7.
      6. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в OP9 сред с Flt-3L + IL-7 мастер-микс (3 мл для каждого 10 см блюдо обработанного). Передача собранных клеток от каждой пластины в одну лунку 6-луночного планшета с клетками OP9.
        1. В целях продвижения клеток к моноцитарно, В-клетки или эритроидных линий, семена собранные клеток на OP9 клеток. Для вывода Т-клеток, семян клетки на клеточных монослоев OP9-DL1.
      7. Поместите 6-луночных с в инкубаторе.
    6. День 10: изменение Медиа
      1. Приготовьте 15 мл центрифужную пробирку для каждого отдельного Mesc клон-фидерного типа клеток COMBINAния в совместной культуре.
      2. Подготовка мастер смесь OP9 средах с 5 нг / мл FLT-3 л и 1 нг / мл IL-7. Подготовьте 3 мл на каждую лунку.
      3. Аккуратно собрать средства массовой информации из каждой лунки 6-луночного планшета объединения средств массовой информации из нескольких скважин, содержащих одинаковое ESC клон-питатель типа клеток комбинацию.
      4. Добавить 2 мл OP9 СМИ мастер-микс (см 3.6.2) в каждую лунку.
      5. Центрифуга собранные средства массовой информации при 400 х г в течение 5 мин при 4 ° С. Удалить супернатант и ресуспендируют каждый шарик (очень маленький, если видна) в 1 мл OP9 мастер СМИ смеси (см 3.6.2) на лунку первоначально собранной на этапе 3.6.3.
      6. Распределить 1 мл клеток обратно в каждую лунку, из которых носитель первоначально была собрана в результате чего объем в каждой лунке до 3 мл. Вернуться посуду в инкубатор.
    7. День 12: Нет трипсина проход
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте заранее достаточное количество 6-а блюда с OP9 или OP9-DL1 клетки так, что они будут оптимально конфлюэнтны времени для этого SТЭП. День 12 идеально подходит для проточной цитометрии анализа развивающихся эритроидных, моноцитов, и на ранних стадиях развития Т-клеток.
      1. Подготовка основной смеси (3 мл на каждую лунку, которая будет продолжать во взаимодействии культуры) OP9 средах с 5 нг / мл FLT-3 л и 1 нг / мл IL-7.
      2. Подготовьте пробирками 50 мл с 40 мкм фильтров (один для каждого ESC клон-фидерного типа клеток комбинации в совместной культуре).
      3. Энергично пипетки существующие средства массовой информации в каждую лунку разбить все клетки (в том числе монослоя) в скважине. Продолжить с силового пипетки до состояния, напоминающие суспензии отдельных клеток не достигается.
      4. Pass Собранные клетки через сито в трубу. Добавить 3 мл PBS в каждую лунку мыть и собрать все оставшиеся клетки. Pass клетки через то же сито. Объединить ячейки из нескольких скважин, содержащих одинаковое ESC клон-питатель типа клеток комбинацию.
      5. Утилизируйте использованный клеточный фильтр и удалить кратный, эквивалентную одной скважины (~ 6 мл) для любой желаемойпроточной цитометрии (или другой) анализирует будет осуществляться в тот день. Храните эти аликвоты на льду перед использованием.
      6. Центрифуга клетки при 400 х г в течение 5 мин при 4 ° С. Удалить супернатант. Ресуспендируют гранул из центрифуги труб 50 мл в 3 мл мастер-микс на лунку для повторного посева. Добавить 3 мл на лунку каждой клеточной суспензии на соответствующем типе клеток-фидеров и поместить посуду в инкубаторе.
    8. День 14: изменение Медиа
      1. Выполните действия, указанные в разделе 3.6.
    9. День 16: Нет трипсина проход
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте заранее 6-а блюда оптимально сливающихся OP9 или OP9-DL1 клетки для этого шага.
      ПРИМЕЧАНИЕ: День 16 идеально подходит для проточной цитометрии анализ В-лимфоцитов и средней стадии Т-клеток.
      1. Выполните действия, указанные в разделе 3.7.
    10. День 18: изменение Медиа
      1. Выполните действия, указанные в разделе 3.6.
    11. День 20: Нет трипсина проход
      ПРИМЕЧАНИЕ: День 20 яс идеально подходит для проточной цитометрии анализ середины до поздней стадии развивающегося Т-клеток.
      1. Выполните действия, указанные в разделе 3.7. При желании нести дифференциации клеткам прошедшие сутки 20 изменения переменного СМИ и не трипсина не каналы каждые два дня, с ежедневного мониторинга скорости расширения лимфоцитов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

При выращивании на MEFs в присутствии LIF, mESCs может поддерживаться в недифференцированном состоянии. В идеальных условиях, они появляются в виде компактных колоний клеток, окруженных блестящей гало в фазу контрастной микроскопии (рисунок 1). Эти культуры должны контролироваться ежедневно. В зависимости от места слияния клеток, средства массовой информации могут быть изменены или клетки могут быть разделены. Соседние колонии Mesc не должны прийти к точке соприкосновения друг с другом. Нормальный, здор...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Система OP9-DL1 совместно культуры была использована для изучения роли различных генных продуктов при разработке типов клеток крови из стволовых клеток. 8,12,13 Он также доказали свою эффективность модель для изучения функции генов регуляторной ДНК во время клеточной дифференцировки. 9,14 Используя этот подход в качестве альтернативы целых мышиных моделях может дать значительную экономию во времени и стоимости экспериментов, направленных многие основные вопросы кроветворения. Однако адаптация этого...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Джун Кима за экспертную помощь в проточной цитометрии. Исследования в лабораториях авторов поддерживаются программой SCORE Национальных институтов здравоохранения (грант SC1-GM095402 B.D.O) и Канадскими институтами исследований в области здравоохранения (J.C.Z.P.). J.C.Z.P. поддерживается Канадской исследовательской кафедрой иммунологии развития. Инфраструктура биомедицинских исследований Хантер-колледжа частично поддерживается программой NIH Research Centers in Minority Institutions (RCMI) через грантовые MD007599. Мы также выражаем признательность Научной программе штата Нью-Йорк по стволовым клеткам (NYSTEM) за поддержку начала исследований стволовых клеток в Хантер-колледже с помощью грантовых C023048.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
DMEMCorning15-013-CV
Стволовые клетки квалифицированы FBSGemini100-125Термоинактивированный
пенициллин/стрептомицинCorning30-002-CI
L-аланил L-глутаминCorning25-015-CI
Буфер HEPES MilliporeTMS-003-C
Заменимые аминокислотыThermoScientificSH30853.01
Раствор гентамицина Regent (50 мг/мл)Life Technologies 15750-060
&бета;-меркаптоэтанол (55 мМ) в DPBSLife Technologies 21985-023
Фильтрующий блокMilliporeSCGPU05RE0.22 m PES мембрана
Cell Culture Grade WaterCorning25-055-CM
α-MEM Технологии жизни 12000-022Порошок, восстановленный в соответствии с производственной рекомендацией
Гидрокарбонат натрия SigmaS5761-500G
FBSThermoScientificSH 30396.03Требуется тестирование отдельных партий 
Диметилсульфоксид SigmaD2650
Рекомбинантный человеческий лиганд Flt-3 R& D Systems308-FK
Рекомбинантная мышиная ИЛ-7PeproTech217-17
LIF MilliporeESG1107
Utrapure вода с 0,1% желатинаMilliporeES-006-B
MEFs митомицин C обработанMilliporePMEF-CFЛюбые митотически задержанные MEF можно использовать
DPBSCorning21-031-CV
Cell sither (40 μ m)Чашка22363547
100 x 20 ммBD Falcon353003
Multiwell 6-луночныеBD Falcon
1,5 мл микроцентрифужные пробиркиСША Scientific1615-5500
15 мл центрифужные пробиркиBD Falcon352096
центрифужные пробирки 50 млBD Falcon352070
Полистирольная трубка с круглым дном 5 мл с крышкой для ячеек-ситечковBD Falcon352235Тубы для FACS 
Клетки ES R1ATCCSCRC-1011
OP9 Cellsможно получить в репозитории клеток Riken Laboratory Cell Repository (Япония).
Клетки OP9-DL1       Ячейки могут быть запрошены в Zú ñ iga-Pflü Лаборатория CKER.
Программное обеспечение FlowJo Анализ данных Tree StarFACS
Проточный цитометрBDFACScan, FACSCalibur и FACSVantage были использованы в нашей лаборатории
для культуры тканей Fisher микроцентрифужные пробирки 353046

Ссылки

  1. Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5, 410-417 (2004).
  2. Pui, J. C., et al. Notch1 expression in early lymphopoiesis influences B versus T lineage determination. Immunity. 11, 299-308 (1999).
  3. Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture. Science. 265, 1098-1101 (1994).
  4. Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
  5. Chen, J., Lansford, R., Stewart, V., Young, F., Alt, F. W. RAG-2-deficient blastocyst complementation: an assay of gene function in lymphocyte development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 4528-4532 (1993).
  6. de Pooter, R. F., Cho, S. K., Carlyle, J. R., Zuniga-Pflucker, J. C. In vitro generation of T lymphocytes from embryonic stem cell-derived prehematopoietic progenitors. Blood. 102, 1649-1653 (2003).
  7. Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009, (2009).
  8. Arsov, I., et al. A role for autophagic protein beclin 1 early in lymphocyte development. J Immunol. 186, 2201-2209 (2011).
  9. Lahiji, A., et al. Complete TCR-alpha gene locus control region activity in T cells derived in vitro from embryonic stem cells. J Immunol. 191, 472-479 (2013).
  10. Hirashima, M., Kataoka, H., Nishikawa, S., Matsuyoshi, N., Nishikawa, S. Maturation of embryonic stem cells into endothelial cells in an in vitro model of vasculogenesis. Blood. 93, 1253-1263 (1999).
  11. Nishikawa, S. I., Nishikawa, S., Hirashima, M., Matsuyoshi, N., Kodama, H. Progressive lineage analysis by cell sorting and culture identifies FLK1+VE-cadherin+ cells at a diverging point of endothelial and hemopoietic lineages. Development. 125, 1747-1757 (1998).
  12. de Pooter, R. F., et al. Notch signaling requires GATA-2 to inhibit myelopoiesis from embryonic stem cells and primary hemopoietic progenitors. J Immunol. 176, 5267-5275 (2006).
  13. Watarai, H., et al. Generation of functional NKT cells in vitro from embryonic stem cells bearing rearranged invariant Valpha14-Jalpha18 TCRalpha. 115, 230-237 (2010).
  14. Pipkin, M. E., et al. Chromosome transfer activates and delineates a locus control region for perforin. Immunity. 26, 29-41 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Дифференцировка Т-клетоксистема кокультивирования с клетками OP9гемопоэтические клетки-предшественникианализ методом проточной цитометрииподдержание клеточных культурмонослой стромальных клетокразвитие Т-лимфоцитовмодель in vitroCD4+ CD8+ дважды положительные клетки
Вывод Т-клеток In Vitro От эмбриональных стволовых клеток мыши
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.