In Vitro анализ MyD88-опосредованной клеточного иммунного ответа на вирус Западного Нила мутантный штамм инфекции

Краткое содержание

Два метода, основанные на проточной цитометрии – анализ прайминга Т-клеток in vitro и окрашивание внутриклеточных цитокинов были использованы для измерения антигенпрезентативной способности дендритных клеток и антиген-специфических Т-клеточных ответов на мутантную инфекцию вируса Западного Нила у мышей.

Аннотация

Ослабленных вирусов Западного Нила (WNV), неструктурных (NS), 4B-P38G мутант, индуцированной выше врожденную цитокинов и Т-клеточный ответ, чем дикого типа у мышей WNV. Недавно миелоидной фактор дифференциации 88 (MyD88) сигналов было показано, что важно для первоначального грунтовки Т-клеток и развитие Т-клеток памяти во WNV NS4B-P38G мутантного инфекции. В этом исследовании две течь методы, основанные на цитометрии - в пробирке Т-клеток грунтовки анализа и внутриклеточного окрашивания цитокинов (ICS) - были использованы для оценки дендритные клетки (DC) и функции Т-клеток. В Т-клетки заливной анализа, пролиферации клеток анализировали с помощью проточной цитометрии после совместного культуры ДК с обеих группах мышей с карбоксифлуоресцеин сукцинимидил эфира (CFSE) - помечены CD4 ⁺ Т-клетки OTII трансгенных мышей. Такой подход обеспечил точное определение процента пролиферирующих лимфоцитов CD4 ⁺ Т-клеток со значительно улучшилось общее чувствительность, чем традицииаль-анализов с радиоактивными реагентами. Система микроцентрифужных трубки был использован как в культуре клеток, и цитокин окрашивания процедур протокола ICS. По сравнению с традиционной системой пластины на основе культуры ткани, этот модифицированный порядок проще было выполнить на уровне биобезопасности (BL) 3 объектов. Кроме того, WNV- инфицированные клетки обрабатывали параформальдегидом в обоих анализах, которые позволили дальнейшего анализа за пределами BL3 объектов. В целом, эти в пробирке иммунологические анализы могут быть использованы для оценки эффективного клеточно-опосредованные иммунные ответы в течение WNV инфекции.

Введение

Вирус Западного Нила (ЛЗН), нейротропные, плюс зондирования флавивирус, является новым угрозу для здоровья населения. В настоящее время нет вакцины не были одобрены для использования человеком ^1. Ослабляется WNV штамма, который имеет замену P38G в неструктурного (NS) 4B белка, как известно, не вызывают не летальность у мышей, но выше, врожденные цитокинов и Т-клеточный ответ у мышей, чем дикого типа штамма WNV NY99 ^2. Мышей, иммунизированных мутантом NS4B-P38G все были защищены от вторичного заражения летальной дикого типа WNV. Это говорит о том, что мутант NS4B-P38G имеет соответствующие возможности для кандидата в идеальном вакцины. Механизмы, посредством которых мутант NS4B-P38G индуцирует высокие защитные адаптивного иммунитета не ясно еще понял. Toll-подобные рецепторы (TLRs), которые распознают патоген-ассоциированные молекулярные паттерны, играют важную роль в инициации врожденного иммунитета к вирусной инфекции. Сигнальный путь TLR ядро ​​использует миелоидный дифференциация первичного ответа GENE 88 (MyD88) в качестве основного адаптера ^3,4. В недавнем исследовании, сигнализация MyD88 было показано, играют важную роль в развитии клеточный иммунитет во время ЛЗН NS4B- P38G мутанта инфекции у мышей ^5. Dentritic клетки (ДК) являются одним из наиболее важных антиген-представляющих клеток, обладающих уникальной способности инициировать реакцию первичного Т-клеток при вирусной инфекции ^6,7. CD4 ⁺ и CD8 ⁺ Т-клетки и способствуют длительной защитного иммунитета и имеют важное значение для выживания хозяина после дикого типа ЛЗН инфекции ^8,9. Два иммунологические анализы были использованы в данном исследовании для оценки функции этих клеток у мутантных мышей, инфицированных NS4B-P38G.

Во-первых, грунтовки анализа в пробирке Т-клеток использовали для сравнения антиген-представляющих возможность ДКС WNV-инфицированных дикого типа и MyD88 ^{- / -} мышей. Для повышения чувствительности анализа, наивный CD4 ^{+ Т-клетки были выделены из OTII трансгенных мышей, которые выражают специфику Vα2 / Vβ5 TCR для курицы яичного белка (OVA) пептид 323 - 339. ДК ЛЗН инфицированных мышей были очищены, и совместно культивировали с карбоксифлуоресцеин сукцинимидиловый Пасхи (CFSE ) меченных CD4 + Т-клетки в присутствии пептида OVA. После 5 дней совместного культивирования клетки собирали и фиксировали параформальдегидом (PFA) и анализировали с помощью проточной цитометрии. Пролиферативные анализы традиционно осуществляется посредством включения 5-бром-2'-дезоксиуридина (BrdU) или тритием тимина deoxyriboside (3) 10 HTdr. Тем не менее, эти анализы либо радиоактивных и / или нуждаются в специальных оборудования на уровне биобезопасности (BL) 3 объектов, где WNV исследования, проведенного. Анализ проточной цитометрии пролиферации лимфоцитов путем последовательного сокращения вдвое интенсивности флуоресценции витальным красителем CFSE стала более широко используется в иммунологических анализах, как краситель является более стабильнои равномерно включены в клетках, обнаруживается легко с помощью проточной цитометрии, и нерадиоактивных 11. Анализ также имеет возможность оценить количество клеточных делений. Одно из главных преимуществ использования этого теста в исследованиях ЛЗН, что фиксация инфицированных клеток с 1-2% PFA может инактивировать ЛЗН 12, что позволит приобретение пример с проточной цитометрии в BL2 лаборатории.}

Далее, процедура модифицированного внутриклеточное окрашивание цитокинов (ICS) был использован для изучения роли MyD88 сигнализации в регуляции ЛЗН конкретных ответов Т-клеток в NS4B-P38G мутантных-инфицированных мышей. В этом анализе спленоцитов, выделенных из инфицированных мышей обрабатывали в пробирке с WNV конкретных пептидов. Брефелдин был добавлен, чтобы сохранить цитокинов в клетке. После 5 ч инкубации клетки собирали, промывали и окрашивали на Т-клеток подмножеств. Затем клетки фиксировали в PFA, проницаемыми и окрашивали в течение интерферона (IFN) -γ и анализировали с помощью проточной цитометрии.Как и в другом потоке анализа на основе цитометрии, когда клетки обрабатывают с фиксацией и пермеабилизации буфере, содержащем PFA, инфицированные образцы могут быть переданы в BL2 лаборатории для дальнейшей обработки и анализа. В нескольких опубликованных исследований, мы использовали ICS для измерения Т клеточных функций эффекторных в WNV-инфицированных мышей ^13,14. Хотя это хорошо известно, один главный недостаток данного метода является то, что процедура очень длительная и может быть более трудоемким, когда выполняются внутри BL3 объектов. Здесь метод ИКС микро-центрифужные пробирки на основе было показано, что более реально, проще, чтобы продолжить и меньше времени, когда выполняется в BL3 лаборатории.

Протокол

Все эксперименты на животных были одобрены уходу и использованию комитета животных в университете штата Техас медицинского отделения мимо.

1. Выделение домена от не-инфицированных и ЛЗН-инфицированных мышей

1. По возрасту и полу матч 6-10-недельных дикого типа C57BL / 6 (В6) и MyD88 ^{- / -} мышей. Привить внутрибрюшинно (IP) с 500 бляшкообразующих единицы (БОЕ) ЛЗН NS4B- P38G мутанта. В 3-й день после заражения, усыпить B6 и MyD88 ^{- / -} мышей с CO _2. Используйте неинфицированных мышей обеих групп в качестве контроля. Использование трех мышей из каждой группы.
2. Мокрый мех на левой стороне жертву мыши, используя 70% этанола и срезать шерсть с левой стороны мыши, примерно на полпути между передней и задней ноги. Разрежьте полость тела. Удалить селезенки с помощью пинцета. Поместите селезенки в чашке Петри с RPMI.
3. Изолировать селезенки РС с помощью анти-CD11c магнитных шариков в соответствии синструкции завода-изготовителя.

2. Очистка и маркировка Т-клетки OTII трансгенных мышей

1. Урожай один селезенки от наивных OTII мыши, как описано в этапе 1.2 выше, и гомогенизации селезенки между матовыми концами на двух слайдов. Передача клеточной суспензии в 15 мл коническую пробирку, добавить RPMI среду до 14 мл. Пусть подвеска сидеть в течение 5 мин и передать 13 мл этом новом 15 мл коническую трубку.
2. Изолировать селезенки CD4 ⁺ Т-клеток с использованием набора изоляторе CD4 ⁺ T в соответствии с инструкцией завода-изготовителя.
3. Передача клеток в 50 мл коническую трубку, дважды промывали PBS. Ресуспендируют клеток в PBS с 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в 1 × 10 ⁶ клеток на мл, и добавить 0,5 мкмоль / мл CFSE. Инкубируют при 37 ° С в течение 10 мин в защищенном от света.
4. Добавить 5 мл холодного полной среде (RPMI-1640 с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки, 1/100 обантибиотики / противогрибковые, 1/100 т L-глутамина и 1/1000 об из 1000 х 2-меркаптоэтанола).
5. Инкубируют на льду в течение 5 мин. Промывают клетки один раз PBS, фиксируют 0,2 × 10 ⁶ меченных CD4 ⁺ Т-клеток в 2% PFA и приобрести на проточном цитометре. Используйте этот образец, чтобы определить исходный уровень CFSE. Re-приостановить отдых меченых клеток в полной среде.

3. Сотрудничество культуры OTII Т-клеток ДК ЛЗН-инфицированных мышей

1. Культура 2 х 10 ⁵ очищенных CD4 ⁺ Т-клетки мышей OTII в одиночку или с очищенной ДК дикого типа или MyD88 ^{- / -} мышей (2 х 10 ⁴⁾ в 24-луночного планшета с или без OVA остатка 323-339 (1 г / мл) в 1 мл полной среды на лунку.
2. Инкубируйте клетки при 37 ° С в течение 5 дней. Урожай клетки, мыть два раза в FACS буфере (PBS с 1% FBS) и зафиксировать в 0,25 мл 2% PFA. Vortex немедленно.

4. проточной цитометрии в пробирке </ EM> Т-клеток Грунтовка

1. Для приобретения, дважды щелкните проточной цитометрии значок программного обеспечения. Для плотности участка линейного FSC-против линейного SSC-А, выберите каналы от 0 до 200000 на FSC-A и от 0 до 200000 на SSC-А. Затем создайте ворота на живые клетки (P2; рис 1а).
2. Для анализа интенсивности флуоресценции CFSE, открыть гистограмму для канала FL1 и приобрести 20000 событий на закрытом населения. Настройка маркер на образцах для OTII клеток, культивируемых в одиночку (Рисунок 1А).
3. Приобретение образцы для OTII клеток, культивируемых совместно с ДК дикого типа (фиг.1В) или MyD88 ^{- / -} DCS (рисунок 1c) аналогичным образом.

5. Выделение и стимуляция спленоцитах для анализа на цитокины

1. Infect B6 и MyD88 ^{- / -} мышей с WNV NS4B-P38G мутанта с использованием той же процедуры, как описано в STEр 1,1. В 30-й день после инфицирования, повторно задача выживших мышей с 2000 БОЕ дикого типа WNV штамма ИС на 8 дней и 21 после первичной инфекции WNV или на 4 день после вторичной инфекции, эвтаназии мышей с CO ₂ для сбора селезенки ,
   Примечание: Мы использовали 2-3 мышей на группу для каждой временной точки.
2. Сделать суспензии отдельных клеток спленоцитов, как описано выше в стадии 1,2 & 2,2 шага. Граф клеток с использованием гемоцитометра и вновь приостановить их в 10 мл полной среды.
3. Развести клетки с полной среде до 2,5 × 10 ⁶ клеток / мл. Добавить 1 мл спленоцитов в 1,5 мл микро-центрифужную пробирку.
4. Для моделирования CD8 ⁺ Т-клеток, разбавленные WNV конкретных NS4B и Е пептиды (SSVWNATTA и IALTFLAV) до 1 мг / мл в ДМСО. Для стимуляции CD4 ⁺ Т-клеток, разбавленные WNV конкретных NS3 и Е пептиды (RRWCFDGPRTNTILE и PVGRLVTVNPFVSVA) до 1 мг / мл в ДМСО. Добавить 10 мкл пептидов к клеткам followed по 1 мкл раствора брефелдин A. Использование клеток без обработки пептидов в качестве контрольной группы. Смешайте клетки.
5. Удар два отверстия с помощью 18 G иглы в крышке пробирки. Инкубируйте клетки при 37 ° С в течение 5 часов.

6. Внутриклеточные окрашивание цитокинов

1. Передача клетки к новому микро-центрифуги трубы. Спин клетки в течение 5 мин при температуре 300-400 мкг и слейте супернатант. Добавить 1 мл FACS буфера, спин 5 мин при температуре 300-400 мкг и вновь приостановить клеток с помощью пипетки с 120 мкл FACS буфера.
2. Добавить 2 мкл Fc блокатор и инкубировать клетки при комнатной температуре в течение 10 мин. Добавить 1 мл FACS буфера в каждую пробирку. Спин 5 мин при 300 - 400 х г.
3. Повторное приостановить клеток в 300 мкл FACS буфера и разделить их на три трубки (около 0,8 х 10 ⁶ клеток на пробирку). Как показано в таблице 1, резервировать первую трубку каждого условия культивирования для крыс IgG-PE окрашивания. Для второй трубы, добавляют 3 мкл анти-CD4 APC с CD4 пептидов-обработанные клетки, 3 μл анти-CD8 FITC с CD8 пептиды-обработанных клеток или обоих антител к клеткам без пептидов лечения. Используйте третий трубку для окрашивания компенсации. Для каждого состояния культуры, используют три трубки клеток, окрашенных APC-сопряженных CD4, FITC-конъюгированного CD8 или ПЭ меченых CD3 только антител (3 мкл на пробирку), как контроль компенсации за FL1, FL2 и FL4 каналов.
4. Вихревые клетки кратко. Оставьте на льду в течение 20 мин и защищать от света. Добавить 1,4 мл FACS буфера. Спин 5 мин при температуре 300-400 мкг и слейте супернатант.
5. Перемешивайте, чтобы сорвать осадок клеток (или, коротко вихрь). Повторное приостановить осадок клеток в 250 мкл фиксации / пермеабилизации solutionby пипетки. Инкубируют при комнатной температуре в течение 20 мин и защищать от света.
6. Добавить 1,2 мл FACS буфера. Спин 5 мин при 300-400 мкг в и ресуспендирования клеток в 300 мкл FACS буфера.
   Примечание: В этот момент клетки могут быть переданы в лабораторию BL2 для дальнейшей обработки или хранить в холодильнике и защищен от света для ир до трех дней.
7. Добавить 500 мкл FACS буфера. Спин 5 мин при 300-400 мкг в и ресуспендирования клеток в 500 мкл 1x буфер пермеабилизации / стирки. Спин 5 мин при температуре 300-400 х г.
8. Повторное приостановить клеток в 100 мкл 1x Пермский край / штат Вашингтон, добавить 3,5 мкл анти-IFN,-PE к трубе ранее добавленного с антителами для CD4 и / или CD8 Т-клеточных маркеров в шаге 6.3 и 3.5 мкл крысы IgG-PE в трубке защищены для контроля IgG в течение 25 мин на льду и защищать от света. Вымойте клеток путем добавления 1,4 мл 1x пермеабилизации / промывочного буфера. Спин 5 мин при температуре 300-400 х г. Повторите этап промывки путем добавления 1,4 мл 1x пермеабилизации / промывочного буфера.
9. Спин 5 мин при температуре 300-400 мкг и переливать супернатант. Промыть клеток путем добавления 1,4 мл FACS буфера и вновь приостановить в 400 мкл FACS буфера для окончательного сбора.

7. проточной цитометрии внутриклеточного окрашивание цитокинов

1. Используйте те же настройки сбора, как в шаге 4.1. Creaте ворота на живые клетки (P2; рис 2а). Отрегулируйте напряжение с помощью компенсационных трубы для каждой группы.
2. Открыть два новых точек участки, один для отображения данных, собранных для FL1 против. FL2 (CD8 против. IFN-γ), а другой для отображения данных, собранных для FL4 против. FL2 (CD4 против. IFN-γ). Приобретать 50000 мероприятий для закрытого населения каждого образца.

Результаты

В Т-клеток заливной анализа, CFSE меченые CD4 ⁺ Т-клетки культивировали с очищенными ДК из NS4B-P38G мутантного-инфицированных дикого типа и MyD88 ^{- / -} мышей в присутствии или в отсутствие OVA пептидов. Меченые Т-клеток, культивируемых в одиночку или без OVA в течение 5 дней были использованы в качестве отрицательного контроля. Как показано на фиг.1А, всего Т-клетки закрытого для анализа интенсивности флуоресценции по каналу FL1. Маркер был создан на основе свежей меченых CD4

Обсуждение

ЛЗН возбудитель BL3. В соответствии с правилами техники безопасности, иммунологические анализы с образцами WNV-инфицированных часто ограничиваются наличием оборудования на BL3 объектов или более длительным и утомительным для выполнения. В недавнем исследовании мы использовали два цитометрии на основе методов проточной изучать клеточные иммунные ответы во время ЛЗН инфекции ^5. В обоих анализах, WNV-инфицированные клетки обрабатывают 1-2% PFA непосредственно или с фиксацией / пермеабилизации раствора, содержаще...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
RPMI 1640	Invitrogen	11875	прогрев при 37 °°; C
анти-CD11c магнитные шарики	Miltenyi Biotec	130-052-001	следуйте указаниям производителя s инструкция
анти-CD4 магнитные шарики	Miltenyi Biotec	130-095-248	следуйте указаниям производителя s инструкция
CFSE	Invitrogen	C34554
OVA остаток 323-339	Genscript Corporation	RP10610
Пептиды	Проиммунный	PC0AD-D
Брефельдин А раствор	BD Bioscience	555029
мыши Fc Blocker	e-Bioscience	14-0161-85
APC-конъюгированный CD4	e-Bioscience	17-0041-81
FITC-конъюгированный CD8	e-Bioscience	11-0081-82
Раствор для фиксации/пермеабилизации	BD-Bioscience	554722
Буфер для пермеабилизации/промывки	BD-Bioscience	554723
анти-IFNγ-PE	e-Bioscience	12-7311-82
Проточный цитометр	Accuri BD Бионаука