Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Обнаружение На месте белок-белковых комплексов в Drosophila Личинок нервно-мышечного соединения, используя Пробирной Расстояние Лигирование

13.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52139

⸱

20 января 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biology and Biochemistry, Simon Fraser University, 2Department of Biomedical Physiology and Kinesiology, Simon Fraser University

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол показывает, как Пробирной Расстояние Лигирование может быть использован для обнаружения в точке белок-белковых взаимодействий на Drosophila личиночной нервно-мышечном соединении. С помощью этого метода, Диски большой и Ху-ли тай Шао показаны с образованием комплекса в постсинаптической области, ассоциация ранее выявленных в рамках совместного иммунопреципитацией.

Аннотация

Discs large (Dlg) является консервативным членом семейства мембраноассоциированных гуанилаткиназ и служит основным белком-каркасом в личиночном нервно-мышечном соединении (NMJ) у дрозофилы. Предыдущие исследования показали, что постсинаптическое распределение Dlg в личиночном NMJ перекрывается с распределением Hu-li tai shao (Hts), гомолога аддуцинов млекопитающих. Кроме того, было обнаружено, что Dlg и Hts образуют комплекс друг с другом на основе экспериментов по совместной иммунопреципитации с участием лизатов целых взрослых мух. Однако из-за характера этих экспериментов было неизвестно, существует ли этот комплекс конкретно в NMJ во время развития личинок.

Proximity Ligation Assay (PLA) — это недавно разработанный метод, используемый в основном в клеточных и тканевых культурах, который может обнаруживать белок-белковые взаимодействия in situ. В этом анализе образцы инкубируются с первичными антителами против двух представляющих интерес белков с использованием стандартных иммуногистохимических процедур. Затем первичные антитела детектируются с помощью специально разработанной пары олигонуклеотид-конъюгированных вторичных антител, называемых зондами PLA, которые могут быть использованы для генерации сигнала только в том случае, если два зонда связаны в непосредственной близости друг от друга. Таким образом, белки, которые находятся в комплексе, могут быть визуализированы. Здесь показано, как PLA может быть использован для обнаружения белок-белковых взаимодействий in situ в NMJ личинок дрозофилы. Методика проводится на препаратах мышечной стенки тела личинок, чтобы показать, что комплекс между Dlg и Hts действительно существует в постсинаптической области NMJ.

Введение

Drosophila Диски большой (DLG) является консервативный член мембраной связаны гуанилатциклазы семейства киназ лесов белков, которые помогают организовать сборку больших белковых комплексов в определенных участках плазматической мембраны. Первоначально идентифицирована как белка-супрессора опухоли, Dlg служит важным фактором, определяющим эпителия апикально-базальной полярности 1,2,3. Dlg также служит в качестве основного модуля лесов в нервно-мышечном соединении (НМС) глутаматэргических двигательных нейронов во время развития личинок 4. Dlg играет разные роли на личиночной НМС, и его pleiotropism зависит от его способности, чтобы связать с несколькими белками 5,6. Одним из таких белков является Ху-ли тай Шао (ВТСП), гомолог к adducins млекопитающих, которые в основном были описаны в отношении их роли в регулировании актин-спектринового цитоскелета 7. Ранее было показано, что Dlg и Hts может образовывать комплекс друг с другом на основе в пробирке совместно иммунопреципитации эксперименты с участием всего взрослого летать лизаты 8. Один из недостатков этих результатов, однако, является то, что они не указывают, когда это сложные формы. С использованием иммуногистохимии, распределения и Dlg Hts наблюдаются перекрываться на постсинаптической мембране личиночных НМС, но они в комплексе в этой области 8? Как показал недавно и подробно описано здесь, Пробирной Расстояние Лигирование (PLA) используется для поиска в месте связи между Dlg и Hts специально на личиночной NMJ 27.

PLA является относительно новый метод используется в основном в клеточной и тканевой культуры, которая может обнаружить белок-белковых взаимодействий в месте 9. В этом анализе, первичные антитела против двух белков, представляющих интерес обнаружены с парой видоспецифических вторичных антител, называют PLA зондов, которые конъюгированы с олигонуклеотидами (1А, В). Если два белкас находятся в непосредственной близости друг от друга (т.е. в течение нескольких десятков нанометров), расстояние между прилагаемыми НОАК зондов можно преодолеть путем гибридизации двух дополнительных олигонуклеотидов Connector (рисунок 1в). В этой конформации, свободные концы соединительных олигонуклеотидов достаточно близки, чтобы вступить в контакт друг с другом, и закрыт круглой молекула ДНК может быть сформирован на месте в лигирования (фиг 1D). Круговой молекула ДНК служит в качестве матрицы для амплификации в месте прокатки круга, который заливают в одном из олигонуклеотидов, конъюгированных с зондами PLA (рис 1E). Последовательности в пределах результате усиленного concatemeric продукта ДНК могут быть визуализированы с флуоресцентно меченных комплементарных олигонуклеотидов (фиг 1F). Поскольку усиленный ДНК остается прикрепленной к одному из датчиков PLA, субклеточном локализации взаимодействия withi белок-белокна ткани могут быть легко установлены.

Некоторые методы широко используются для обнаружения белок-белковых взаимодействий в том числе в технике пробирке, такие как совместно иммунопреципитации, выпадающие анализы и дрожжи Двугибридный анализ и методам естественных условиях, таких как Ферстер резонанс переноса энергии (FRET) и Бимолекулярные флуоресценции комплементации ( BiFC). Ловушка из методов в пробирке, что они не определить, где взаимодействие происходит эндогенно, в то время как вышеупомянутые в естественных условиях методы включают искусственный экспрессию слитых белков, которые могут не отражать родной поведение их эндогенных аналогов. Одно из главных преимуществ PLA является то, что способен определить в ткани на внутриклеточную локализацию эндогенных белков interactors, которые находятся в непосредственной близости друг от друга, и, скорее всего, образующих комплекс с степени близости, необходимой для генерирования сигнала, сравнимой с FRET и BiFC. PLA может обнаружить взаимодействие с высокой специфичностью и чувствительностью за счет сцепления распознавания антител и амплификации ДНК. Таким образом, анализ может генерировать дискретные, яркие сигналы в виде Puncta, которые показывают точное положение взаимодействия. Кроме того, почти видимые антигенов могут быть обнаружены. Наконец, PLA не относительно простой метод для выполнения, и он больше не принимает, чем стандартный иммуногистохимического процедуру для завершения. Поэтому, PLA технические преимущества по сравнению с другими анализами взаимодействия белок-белковых, которые часто сталкивается с длительным временем подготовки и обширной устранения неполадок.

Этот протокол показывает, как PLA могут быть применены к Drosophila личинок НМС с целью обнаружения эндогенных белок-белковых взаимодействий на месте. Здесь PLA осуществляется на личиночных мышц стенки тела препаратов, где Dlg и Hts показаны на самом деле существует в комплексе в постсинаптической области НМС, Народно-освободительная армия ранее не использовалась для изучения личинок НМС, и есть в настоящее время только несколько опубликованных работ, которые использовали эту пробу у дрозофилы ткани. Он выразил надежду, что в дальнейшем экспозиция НОАК сообщества дрозофилы приведет к его увеличению использования в качестве дополнительного инструмента в дополнение к другим, более часто используемые анализы белок-белкового взаимодействия.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Тело Wall Подготовка

Примечание: Получение третьей возрастной стадии стенок тела личинки (для изучения НМС, которые иннервируют мышцы стенки тела) проводили, как описано ранее в Brent и др 10, или Рамачандрана и Будник 11,12, но с некоторыми изменениями..

  1. Рассечение
    1. Повышение мухи запасов и кресты при 25 ° С в течение 5:55 дней с использованием стандартных процедур 13.
    2. Выберите ползет личинок третьей возрастной стадии от флаконах или бутылках с использованием тонких щипцов.
    3. Промыть личинок в небольшом чашку Петри, содержащую фосфатный буфер солевом растворе (PBS), чтобы удалить любые частицы пищи.
    4. Поместите одну личинку на Sylgard диска и погрузить его в нескольких капель ледяной PBS. Использование ледяной PBS поможет ошеломить личинку делает его легче манипулировать. На протяжении вскрытия, убедитесь, что препарат всегда погружен в PBS, чтобы предотвратить его от высыхания.
    5. Установите ЛаRVA с его спинной стороной вверх, так что две трахеи участки открыты при вскрытии микроскопа (фиг.2а). Используя пинцет, чтобы схватить minutien штифт, контактный личинку вниз на заднем конце вблизи дыхальца (рис 2b). С другой штифт, проколоть через кутикулу на переднем конце вблизи устья крючки. Осторожно потяните личинку из продольно, то вывод его вниз (рис 2б).
    6. Использование микродиссекции ножницы, щепотка задний конец рядом булавку, чтобы создать небольшое отверстие. Разрез должен быть достаточно поверхностным просто передать через кутикулу.
    7. Размещение кончик нижнего лезвия ножниц в разрез, разрез вдоль всей длины средней линии спины между двумя трахеи путей (фиг.2с). Укажите лезвия ножниц слегка вверх при резке, чтобы избежать повреждения вентральной мускулатуры стенки тела.
    8. Сделайте небольшой горизонтальный разрез немного впереди на должностьeriorly расположенный штифт (рис 2С). Сделайте еще ​​один аналогичный разрез немного кзади от впереди размещенных штифта (рис 2С). Разрезы должны просто пройти через кутикулу.
      Примечание: Три разрезы от шагов 1.1.7 и 1.1.8 в сочетании должна напоминать " figure-protocol-1 "После завершения, т.е. левой и правой заслонки на спинной стороне тела личинки должны быть произведены.
    9. Тщательно очистить внутренние органы с помощью пинцета. Добавление нескольких силовых капель PBS поможет вытеснить органы из тела личинки, тем самым облегчая их удаление. Избегайте тыкать тела личинки, как это может привести к повреждению стенки тела мышц.
    10. Развернуть тела личинки открыты и прикрепить уголки вниз (рис 2D). Когда пиннинга растянуть стенки тела и по горизонтали, и по вертикали, чтобы сформировать равномерно натянута прямоугольник (SEд Рис 2G для формы), стараясь не порвать стенки тела мышцы в процессе.
    11. Завершите удаление любых оставшихся внутренних органов (рис 2E).
  2. Фиксация и пермеабилизирующего
    1. Погрузитесь закрепленного стенки кузова в нескольких капель раствора Буэна. Инкубировать в течение 15 мин на льду. Кроме того, использование 4% параформальдегида (PFA) в качестве альтернативы фиксатором; инкубировать в течение 30 мин.
    2. Промыть три раза с помощью забуференного физраствора с Triton (PBT).
    3. Использование тонких щипцов, тщательно удалить контакты и передать стенки кузова от их углов в силицированного 0,65 мл микроцентрифужных трубки.
    4. не хранить стенки кузова в PBT при 4 ° С до готовности к PLA. Для достижения оптимальных результатов, начните иммуноокрашивания стенки кузова в течение дня или двух вскрытия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы сэкономить на реагенты и обеспечить, чтобы все стены тела имеют равные во время теста, различные генотипы могут быть помещены в единыйтруба. Генотипы можно выделить за счет сокращения углы стен тела по-разному (рис 2F для примеров).

2. Иммуногистохимия

Примечание: Иммуноокрашивание третьей возрастной стадии стенок тела личинки проводили, как описано ранее в Brent др 14 и Рамачандрана и Будник 11, но с некоторыми изменениями. 11,14.
Примечание: Выполнить все шаги при комнатной температуре и при легком перемешивании, если не указано иное.

  1. Блокировки
    1. Вымойте стенки кузова с PBT три раза в течение 10 минут каждый.
    2. Блок 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в течение 1 часа.
  2. Иммуноокрашивание
    1. Инкубируйте стенки кузова с помощью мыши и кролика первичных антител против двух белков, представляющих интерес (разведенного в 1% BSA) в течение 2 ч при комнатной температуре, или в течение ночи при 4 ° С. В этом случае используйте 1:10 мышиное анти-DLG и 1: 250 кроликуNTI-HtsM 15,16. Антитела против маркеров, которые не сделанных в мышь или кролика также могут быть включены - например, использовать 1: 200 козий анти-HRP, чтобы очертить нейронные мембраны.
    2. Промыть PBT три раза в течение 10 мин каждый.
    3. Инкубируйте с флуорофором-конъюгированные вторичные антитела для выявления маркеров (разбавленный в 1% BSA) в течение 2 ч при комнатной температуре, или в течение ночи при 4 ° С. Поскольку сигнал НОА впоследствии визуализированы с красным флуорофором, другой флуорофор должен быть использован для обнаружения маркера - например, использовать 1: 200 FITC-конъюгированного анти-козел для обнаружения козьего анти-HRP-антитела. В связи с использованием светочувствительных реагентов, держать трубки в темноте с этой точки и далее.
      Примечание: Комплект, который используется позволяет PLA быть выполнены между первичными антителами у мышей и кроликов, с сигналом отображаются на красном канале в соответствии с конфокальной микроскопии. Если желательно, другие комплекты доступны, что позволяет анализа должно быть сделано с примаRy антитела, индуцированные у других видов, и сигнал визуализируется на других каналах.

3. Пробирной Расстояние Лигирование

Примечание: Выполнить все шаги при комнатной температуре и при легком перемешивании, если не указано иное.

  1. PLA зонды
    1. Вымойте стенки кузова с PBT три раза в течение 10 минут каждый.
    2. Инкубируйте с PLA зондов (разведение 1: 5, каждый на 1% BSA) в течение 2 ч при 37 ° С. В этом случае используйте 40 мкл PLA зонда анти-мыши минус, 40 мкл PLA зонда анти-кролика плюс и 120 мкл 1% BSA в целях обеспечения надлежащего погружение и перемешивание 5-10 стенах тела. До разведении зондов PLA 1:25 все еще ​​может привести к адекватной отношение сигнал-шум (то есть, для этого эксперимента).
  2. Перевязка
    1. Вымойте стенки кузова промывочным буфером дважды в течение 5 минут каждый.
    2. Инкубируют при лигирования раствора (1:40 разбавление в лигазы буфера дл лигировани) в течение 1 ч Ат 37 ° C. В этом случае используйте 5 мкл лигазы 40 мкл 5 буфера для лигирования и 155 мкл воды высокой степени чистоты для обеспечения надлежащего погружение и перемешивание 5-10 стенах тела.
  3. Усиление
    1. Вымойте стенки кузова промывочным буфером дважды в течение 2 мин каждый.
    2. Инкубируйте раствором усиления (1:80 разбавление полимеразы в буфере Amplification) в течение 2 ч при 37 ° С. В этом случае используйте 2,5 мкл полимеразы, 40 мкл 5 Amplification буфера и 157,5 мкл воды высокой степени чистоты для обеспечения надлежащего погружение и перемешивание 5-10 стенах тела.
  4. Подготовка для работы с изображениями
    1. Вымойте стенки кузова промывочным буфером В два раза по 10 минут каждый.
    2. Промыть 0.01x промывочного буфера B один раз в течение 1 мин.
    3. Равновесие в несколько капель раствора для монтажа по меньшей мере, 30 мин до начала монтажа, или хранить в течение ночи при 4 ° С.
    4. Использование тонких щипцов, тщательно передачи стенки кузова на платформе слайд шIth их кутикулы вниз. Расположите стенки кузова в рядах и в той же ориентации в пределах или две капли mountant. Поставьте 22 мм х 40 мм покровным за подготовкой, стараясь не произвести пузырьки воздуха, плотно закройте слайд с прозрачным лаком для ногтей.
    5. Храните слайды в темноте при -20 ° С до готовности для конфокальной микроскопии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В дикого типа третьего возраста личинок НМС, Dlg в основном находится на постсинаптической мембране типа I глутаматергических бутонов, а уровни иммунореактивности DLG быть более выражен в вида И. Б. бутонов, чем типа является бутоны (3А) 4. Hts присутствует на всей мышцы, а концентрируется на постсинаптической области с Hts уровни иммунореактивности появляться одинаковые по типу I бутоны, и также обнаружили пресинаптически (3А ") 8,17. Следует отметить, что распред...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот отчет показывает, как PLA могут быть применены к дрозофилы личиночной НМС. Анализ проводят на личиночных стенки тела препаратов мышечных с целью обнаружения эндогенных белок-белковых взаимодействий, присутствующих в НМС. С помощью этого метода, Dlg и Hts показаны, чтобы быть в непосредственной близости друг от друга, и, таким образом, существуют в комплексе, в частности, в постсинаптической области 27. В поддержку этого результата, предыдущее исследование предоставило доказательства их связи со ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Блумингтон дрозофилы фондовый центр для обеспечения запасов лету. Мы также благодарим Развивающие Studies гибридомы банк и Линн Кули (Йельский университет) для предоставления антител. Особая благодарность идет к AhHyun Ю за помощь в рукописи. Эта работа была поддержана грантами от естественных наук и инженерного исследовательский совет Канады (Кригер), Уильяма и Ада Изабель стали фонда (Кригер), и Канадского института исследований в области здравоохранения (Харден).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Щипцы (тонкие #5)AlmedicA10-704
Sylgard DiscWorld Precision InstrumentsSYLG184Смешайте эластомерную основу и отвердитель в соотношении 10:1. Заставьте на 30 мин. Вылейте в форму (например используйте 12-луночный планшет для клеточной культуры). Дайте застыть не менее 24 часов. При вскрытии приклеивайте к крышке чашки Петри размером 60 x 15 мм.
Булавки Minutien (0.0125  мм диаметр наконечника)Fine Science Tools26002-10
Ножницы для микродиссекции (ультратонкие)Fine Science Tools15200-00
Platform Slides Приклейтедва 22 x 22 мм2 покровные наносятся на предметное стекло микроскопа с прозрачным лаком для ногтей, оставляя < Зазор 20 мм между образцами для монтажа образца.
w1118Bloomington Drosophila Stock Center3605
hts01103Bloomington Drosophila StockCenter 10989Запас был перебалансирован над балансировщиком GFP, чтобы гомозиготные мутанты могли быть выбраны на основе отсутствия сигнала GFP.
1x PBS (фосфатно-солевой буфер): 3  mM2PO4, 7  mM Na2HPO4, 130  mM NaCl, pH 7,02PO4 (Caledon Laboratories - 8180-1), Na2HPO4 (Caledon - 8120-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
Раствор БуинаSigma-AldrichHT10132
4% PFA (параформальдегид): 4% PFA в 1x PBSПФА (наука об анахемии - 66194-300). Смотрите doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 для получения инструкций о том, как сделать решение.
[header]
1x PBT (фосфатно-солевой буфер с тритоном): 1x PBS с 0,01% TritonTriton X-100 (Sigma-Aldrich - T8787)
1% BSA (бычий сывороточный альбумин): 1% BSA в 1x PBTBSA (Bioshop Canada - ALB001). Хранить при температуре 4 °C.
мышиный анти-Dlg (диски большие)Исследования развития Hybridoma Bank4F3Используйте в разведении 1:10 в 1% BSA.
кролик анти-HtsM (Hu-li tai shao)Предоставлено доктором Линн Кули (Йельский университет). Используйте в разведении 1:250 в 1% BSA.
Анти-Пак кролик (p21-активированная киназа)Предоставлено доктором Николасом Харденом (Университет Саймона Фрейзера). Используйте в разведении 1:500 в 1% BSA.
мышиный анти-Wg (бескрылый)Исследования развития Hybridoma Bank4D4Использование в разведении 1:5 в 1% BSA.
козий анти-Hrp (пероксидаза хрена)Jackson                          ImmunoResearch123-065-021Использовать в разведении 1:200 в 1% BSA.
FITC-конъюгированный ослиный антикозийJackson                        ImmunoResearch705-095-003Использовать в разведении 1:200 в 1% BSA.
Duolink In Situ PLA Probe anti-mouse MINUSSigma-AldrichDUO92004
Duolink In Situ PLA Probe antirabbit PLUSSigma-AldrichDUO92002
Duolink In Situ Detection Reagents RedSigma-AldrichDUO92008
1x Wash Buffer A: 0,01  М Трис, 0.15  M NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,4Sigma-AldrichDUO82049Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific - BP337)
1x Буфер промывки B: 0,2  М Трис, 0.1  M NaCl, pH 7,5Sigma-AldrichDUO82049Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
0,01x Буфер для промывки B: 2  mM Tris, 1  mM NaCl, pH 7,5Sigma-AldrichDUO82049Tris (Caledon Laboratories - 8980-1), NaCl (Caledon - 7560-1)
Монтажная среда Duolink in situ с DAPISigma-AldrichDUO82040

Ссылки

  1. Woods, D. F., Bryant, P. J. The discs-large tumor suppressor gene of Drosophila encodes a guanylate kinase homolog localized at septate junctions. Cell. 66, 451-464 (1991).
  2. Yamanaka, T., Ohno, S. Role of Lgl/Dlg/Scribble in the regulation of epithelial junction, polarity and growth. Front Biosci. 13, 6693-6707 (2008).
  3. Humbert, P. O., et al. Control of tumourigenesis by the Scribble/Dlg/Lgl polarity module. Oncogene. 27, 6888-6907 (2008).
  4. Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X. X., Budnik, V. The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure. Neuron. 13, 823-835 (1994).
  5. Ataman, B., Budnik, V., Thomas, U. Scaffolding proteins at the Drosophila neuromuscular junction. Int Rev Neurobiol. 75, 181-216 (2006).
  6. Thomas, U., Kobler, O., Gundelfinger, E. D. The Drosophila larval neuromuscular junction as a model for scaffold complexes at glutamatergic synapses: benefits and limitations. J Neurogenet. 24, 109-119 (2010).
  7. Matsuoka, Y., Li, X., Bennett, V. Adducin: structure, function and regulation. Cell Mol Life Sci. 57, 884-895 (2000).
  8. Wang, S., et al. Drosophila adducin regulates Dlg phosphorylation and targeting of Dlg to the synapse and epithelial membrane. Dev Biol. 357, 392-403 (2011).
  9. Soderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45, 227-232 (2008).
  10. Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J Vis Exp. (24), (2009).
  11. Ramachandran, P., Budnik, V. Immunocytochemical staining of Drosophila larval body-wall muscles. Cold Spring Harb Protoc. 2010, (2010).
  12. Ramachandran, P., Budnik, V. Dissection of Drosophila larval body-wall muscles. Cold Spring Harb Protoc. , (2010).
  13. Ashburner, M. Drosophila: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (1989).
  14. Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ immunohistochemistry. J Vis Exp. (25), (2009).
  15. Parnas, D., Haghighi, A. P., Fetter, R. D., Kim, S. W., Goodman, C. S. Regulation of postsynaptic structure and protein localization by the Rho-type guanine nucleotide exchange factor dPix. Neuron. 32, 415-424 (2001).
  16. Petrella, L. N., Smith-Leiker, T., Cooley, L. The Ovhts polyprotein is cleaved to produce fusome and ring canal proteins required for Drosophila oogenesis. Development. 134, 703-712 (2007).
  17. Pielage, J., Bulat, V., Zuchero, J. B., Fetter, R. D., Davis, G. W. Hts/Adducin controls synaptic elaboration and elimination. Neuron. 69, 1114-1131 (2011).
  18. Spradling, A. C., et al. The Berkeley Drosophila Genome Project gene disruption project: Single P-element insertions mutating 25% of vital Drosophila genes. Genetics. 153, 135-177 (1999).
  19. Bokoch, G. M. Biology of the p21-Activated Kinases. Annu Rev Biochem. 72, 743-781 (2003).
  20. Bahri, S., et al. The leading edge during dorsal closure as a model for epithelial plasticity: Pak is required for recruitment of the Scribble complex and septate junction formation. Development. 137, 2023-2032 (2010).
  21. Albin, S. D., Davis, G. W. Coordinating structural and functional synapse development: postsynaptic p21-activated kinase independently specifies glutamate receptor abundance and postsynaptic morphology. J Neurosci. 24, 6871-6879 (2004).
  22. Koles, K., Budnik, V. Wnt signaling in neuromuscular junction development. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, (2012).
  23. Packard, M., et al. The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation. Cell. 111, 319-330 (2002).
  24. Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Rev Proteomics. 7, 401-409 (2010).
  25. Thymiakou, E., Episkopou, V. Detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using PLA, a proximity ligation assay. J Vis Exp. (49), (2011).
  26. Maglione, M., Sigrist, S. J. Seeing the forest tree by tree: super-resolution light microscopy meets the neurosciences. Nat Neurosci. 16, 790-797 (2013).
  27. Wang, S., et al. Phospho-regulated Drosophila adducin is a determinant of synaptic plasticity in a complex with Dlg and PIP2 at the larval neuromuscular junction . Biol. Open. 3 (12), 1196-1206 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

НМС личинок Drosophilaбелок-белковое взаимодействиеконфокальная микроскопияиммунофлуоресценцияпостсинаптическая мембранакомплекс Dlg HtsПЛА-зондыамплификация по методу катящегося кольцаpreparation стенки тела
Обнаружение На месте белок-белковых комплексов в Drosophila Личинок нервно-мышечного соединения, используя Пробирной Расстояние Лигирование
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.