Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Возможно данио рерио Модель поликистоза почек: Нокдаун Wnt5a Причины кисты у рыбок данио почек

10.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52156

⸱

2 декабря 2014 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Eastern Virginia Medical School, 2Department of Medicine, Medical University of South Carolina, 3Department of Pediatrics, University of Michigan

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем метод создания возможной модели поликистоза почек у рыбок данио. Мы использовали рыбу Tg(wt1b:GFP) для визуализации структуры почек. Нокдаун wnt5a осуществлялся путем введения морфолино. Образование пронефрической кисты после нокдауна wnt5a наблюдалось у этой трансгенной рыбки данио-рерио GFP.

Аннотация

Поликистоз почек (ПКД) является одной из наиболее распространенных причин терминальной стадии заболевания почек, разрушительного заболевания, от которого нет лекарства. Молекулярные механизмы, приводящие к образованию цисты при PKD, остаются несколько неясными, но считается, что многие гены участвуют в этом. Wnt5a является неканоническим гликопротеином, который регулирует широкий спектр процессов развития. Wnt5a работает через путь плоской полярности клеток (PCP), который регулирует ориентированное деление клеток во время удлинения клеток почечных канальцев. Было обнаружено, что дефекты пути PCP вызывают образование кист почек. В нашей статье описан метод разработки модели кистозной болезни почек у рыбок данио-рерио путем нокдауна гена wnt5a с олигонуклеотидами антисмыслового морфолино (MO) wnt5a. Tg(wt1b:GFP) трансгенные рыбки данио использовались для визуализации структуры почек и кист почек после нокдауна wnt5a. Были использованы два различных антисмысловых MO (AUG- и сплайс-сайт), которые привели к фенотипу кудрявого хвоста и образованию кисты после нокдауна wnt5a. Инъекция мышиной мРНК Wnt5a, устойчивой к МО из-за различия в структуре первичной пары оснований, спасла аномальный фенотип, продемонстрировав, что фенотип не был обусловлен «нецелевыми» эффектами морфолино. Эта работа подтверждает обоснованность использования модели рыбки данио для изучения функции wnt5a в почках.

Введение

Данио рерио (Danio rerio) эмбрионы были широко используется в качестве модели для изучения развития почек и поликистоз почек. Есть много преимуществ в использовании данио в качестве животной модели: технико-экономическое изучения генетических взаимодействий, способность использовать антисмысловые Morpholinos (MO) для белка нокдаун, возможность быстро пробирной большое количество эмбрионов, и легкость просмотра органов фенотипы в жить личинки 1. Предпочка является первым почек развивать у позвоночных и функционально в личиночной рыбок данио 2. Структура данио предпочки относительно проста по сравнению с metanephros млекопитающих, третий и последний почек развивать у млекопитающих. Нефрона является рабочий блок почки, с каждой почки человека, содержащей от 3,4 500,000-1,000,000 нефронов и каждой мыши почки, имеющей приблизительно 13000 нефронов 5, что делает его трудно наблюдать единую структуру нефрона яN человека или мыши почки. Данио имеет только два нефронов, и каждый данио нефрона содержит все основные компоненты, найденные в клубочек и канальцев мышей и человека 6 и аналогичных специализированных видов почечных клеток. По сравнению с другими моделями позвоночных, таких как Xenopus, данио нефрона больше напоминает нефрона млекопитающего, поскольку она имеет закрытую систему 7.

В последние годы, данио геном был секвенирован, что позволяет обеспечить широкое введение генетических средств, обширные мутантных ресурсов и коллекций трансгенных репортерных линий в данио моделей. Данио предпочки формы между 12-72 ч после оплодотворения (ФВЧ) и могут быть легко визуализированы в прозрачных эмбрионов. Опухоль Белок Вильмса WT1 является существенным фактором для развития почек. Трансгенные линии, экспрессирующие данио зеленого флуоресцентного белка (GFP) под контролем промотора в wt1b Tg (wt1b: GFP), показывают, GFP expreделения специально расположен в pronephric регионах у эмбрионов данио рерио, начиная с 17 часов после оплодотворения 8. Nephronophthisis (NPHP), аутосомно-рецессивный поликистоз почек, вызывается мутациями NPHP генов 9. NPHP4 нокдаун в морфолино- вызвало образование кисты в TG (wt1b: GFP). Рыбу 10 Таким образом, эта трансгенная рыба подходит модель для наблюдения структуры почек и образованию кист во время развития почек. Важно отметить, что влияние модуляторов развития почек могут быть изучены с использованием этого штамма в времени и труда эффективным образом.

Наша статья описывает использование ТГ (wt1b: GFP) рыбы в качестве модели для визуализации формирование почек кисты после генной модуляции. Мы использовали пуско-и сайту сплайсинга, анти-смысл МО, чтобы сбить ген Wnt5A у рыбок данио. Wnt5a является неканонической секретируется гликопротеин из семейства Wnt, который играет важную роль в развитии различных органов и послеродовой сотовойФункция 11. Wnt5a работает через неканонических Wnt путей, в том числе плоской клеточной полярности (PCP) пути, который был найден, чтобы играть важную роль в ориентированной клеточное деление в процессе почечных канальцев удлинения. Wnt5a регулирует Wnt / PCP путь, формируя комплекс с рецептором, как тирозинкиназы (Ryk), который дополнительно преобразовывает сигналы Wnt5a путем образования комплекса с плоской VANGL клеточной полярности белка 2 (Vangl2), тем самым способствуя стабильности Vangl2 12. Дефекты в PCP пути может привести к разделению случайной клеток и вызывать образование почечных кист. Мы использовали Tg (wt1b: GFP) данио линию наблюдать формирование почек кисты после Wnt5A нокдаун. Tg (wt1b: GFP) данио модель позволяет живого изображения и своевременной наблюдение структуры почек. После Wnt5A нокдаун, формирование почек киста была обнаружена, начиная с 24 часов после оплодотворения; в 72 часов после оплодотворения, кисты могут быть найдены в клубочках и проксимальных канальцах. Этот метод также может быть использован для SCreen другие гены, которые могут привести к образованию почек кисты.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

О себе Этика:: Примечание Все данио эксперименты были одобрены уходу и использованию комитета Институциональная животных в Восточной Вирджинии медицинской школы в.

1. Морфолино Подготовка

  1. Дизайн и синтезировать перевод блокирующие (ческого увеличения) и сплайсинга ингибирования (сращивания) анти-смысл морфолино (MO) олигонуклеотиды для интересующего гена в соответствии с указаниями изготовителя (рис 1а). Пожалуйста, смотрите информацию изготовителя в таблице 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: МО поставляются в виде лиофилизированных запасов в стеклянных бутылках.
  2. Добавить полноценный стерильную воду в стеклянных бутылках, чтобы повторно приостанавливать МО до конечной концентрации 25 мкг / мкл. Убедитесь, что олигонуклеотид полностью не растворится. Если некоторые твердые остатки, нагреть флакон фондового олигонуклеотидную решение в 65 ° С в течение от 5 до 10 мин, а вихрь кратко.
  3. Храните маточного раствора МО при комнатной температуре. Не следует хранить их при 4 ° С или -20 °С, так как при более низких температурах может привести олигонуклеотид МО связываться с стенки контейнера. Измерьте концентрацию раствора с помощью спектрофотометра (см табл.1) каждый раз новый MO исходный раствор.
  4. Приготовления рабочего раствора MO в день инъекции разбавлением исходного раствора с высококачественной стерильной водой до желаемой дозы. Добавить 0,5% фенола-красного до достижения концентрации 0,05%. Например, чтобы сделать 5 мкл рабочего раствора с концентрацией 15 нг / нл, добавить 3 мкл исходного раствора MO и 0,5 мкл 0,5% фенола-красного до 1,5 мкл воды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При этой рабочей концентрации, каждая капля (500 ФЛ) инъекций содержит 7,5 нг МО и две капли содержат 15 нг МО.

2. Получение инъекционного устройства

  1. Покупка стекла предварительно вытащил иглы (см таблицу 1 для получения более подробной информации). Кроме того, вытащить иглу Wi впрыска стеклаго иглы съемник.
  2. Включите компрессор воздуха и регулировать величину до 50 фунтов на квадратный дюйм давления. Включите рассекает микроскопа источника света и Пико микро-топливного насоса и настройте параметры следующим образом: удерживая давление 20 фунтов на квадратный дюйм, извлеките давление 10 фунтов на квадратный дюйм, период значение 2,5 и 100 мкс диапазоне стробирования.
  3. Загрузите стеклу, предварительно вытащил иглу с 5 мкл раствора для инъекций и поместите иглу в вертикальном положении с острием вниз. Подождите, пока весь раствор не достигнет кончика иглы без видимых пузырьков воздуха. Установите держатель иглы в соответствующем положении рядом с микроскопом и вставьте стекло иглу в держатель. Регулировка угла впрыска до 45 градусов.
  4. Принесите наконечник в целях иглы под микроскопом, высоко над сценой, и сосредоточить внимание на самой тонкой области кончика. Перерыв с кончика иглы с тонкой точечных пинцетом.
  5. Поместите линейку и капиллярную трубку с внутренним диаметром 0,15 мм бок о бок под микроскопом;инъекции раствора в один конец капиллярной трубки, чтобы столб жидкости. Отрегулируйте время извлечения для достижения каждые 17 капель в 1 мм колонке длина жидкой, то объем каждой капли 1 п (объем капли = π х 2 радиус х длина (от столба жидкости) / кол-во (капель).
    Примечание: падение с диаметром 0,1 мм дает объем впрыска около 500 мкл (объем капли = 4/3 х π х радиус 3).

3. Подготовка оплодотворенной эмбрионов данио рерио и впрыска с Morpholinos

  1. Настройка Tg (wt1b: GFP) трансгенные данио гнездящихся пар в соответствии с опубликованными протоколами для стандартной данио хозяйства и технического обслуживания. Сбор эмбрионов после стихийных икры, и держать их в 10 см чашку Петри, заполненную E3 воды (5 мм NaCl, 0,17 мм KCl, 0,33 мМ CaCl 2, 0,33 мМ MgSO 4). Начните МО инъекции сразу 13. Монитор эмбриона морфологии под микроскопом и убедиться, что инъекции МО на одно-стадия ячейку, либо не позднее стадии четыре клетки.
    1. Трансфер эмбрионов в 10 см чашки Петри с клиновидным агар впадин. Аспирируйте дополнительный E3 воду и слегка нажмите эмбрионов в желобов.
    2. Манипулировать эмбрионов с микропипеткой для визуализации эмбрионов 1-клеток сцене под рассекает микроскопом. Проникнуть хориона и затем желток придать одну или две капли МО в желток (1 капле = 500 PL). Передача инъекционные эмбрионов в 10 см чашки Петри с E3 воды и инкубировать при 28,5 ° С.
  2. После инъекции, удалить мертвые эмбрионы и записать число вводимых эмбрионов. Замените воду E3 в блюдо каждый от 24 до 48 ч.

4. Фенотип Спасательные Эксперименты

  1. Выберите ортолог от других видов, что имеет другой первичный пар оснований ее структуре (обычно 3-7 пар оснований несоответствия) и, следовательно, устойчивых к МО, для спасения. Например, в этом эксперименте мы выбралимыши, потому что последовательность мыши Wnt5a мРНК отличается от данио последовательности.
  2. Разработка набора праймеров с прямой праймер, начиная с поступательным сайта и обратного праймера в непосредственной близости от конца кодирующей области мРНК. Добавить последовательность промотора Т7 в 5'-конце последовательности праймера вперед. В этом эксперименте мы использовали следующие последовательности праймеров; вперед: 5'-НТО TAC ПКК TCA кту тег GGA кту TGA ТГК ТГК TGA AGC TGA а- 3 'и обратного: 5'-TCA СТТ ГПК ПКК GTA CTG gtc- 3 ».
  3. Выполнение 50 мкл полимеразной цепной реакции (ПЦР) с набором праймеров (0,5 мкМ каждого праймера) предназначен выше и 0,1 мкг матричной ДНК, содержащей мыши Wnt5a кДНК последовательность со следующей программой: ПЦР 1 цикл при 95 ° С в течение 5 мин; 35 циклов 95 & deg; С (30 сек), 58,5 ° С (30 сек), 72 & deg; С (1 мин); и заключительный шаг удлинение при 72 ° С в течение 7 мин.
  4. После окончания тон цикл, запустить 2 мкл ПЦР-продукта на 1% агарозном геле, чтобы убедиться, полоса правильный размер. Очищают продукт ПЦР с ПЦР-набор для очистки в соответствии с инструкциями изготовителя. Проверка концентрации ДНК с помощью спектрофотометра. Хранить очищенный продукт ПЦР при -20 ° С или непосредственно использовать в ограничен транскрипции РНК на следующей стадии.
  5. Обобщить в пробирке с крышкой мРНК с ограничен набором синтеза РНК в соответствии с инструкциями изготовителя. Развести мРНК в 20 мкл РНКазы свободной воды и определить концентрацию. Алиготе РНК и хранить при температуре -80 ° C.
  6. В день инъекции, подготовить рабочий раствор мРНК с РНКазы свободной стерильной воды. Следует отметить, что 40 мкг, как правило, высокие дозы РНК, при которой не происходит неспецифические или токсические эффекты РНК. Держите рабочий раствор на льду. Вводите эмбриона с МО, а затем спасательную мРНК, или совместно вводить оба вместе. Например, если концентрация мРНК В ведениеред на этапе 4,5 0,6 мкг / мкл, добавить 0,67 мкл мРНК (0,4 мкг) с 4,33 мкл РНКазы свободной воды, чтобы получить конечную концентрацию 0,08 мкг / мкл, а затем одну каплю (500 мкл) из каждой инъекции содержит 40 стр мРНК. Подготовка MO, как описано в шаге 3.

5. Подготовка закачанного эмбрионов для флуоресцентных изображений

  1. После инкубации при 28,5 ° CO / N, добавить 0,003% N-фенилтиомочевины (ПТУ) в воде E3, чтобы предотвратить меланизации, который влияет на наблюдение структуры предпочки с помощью флуоресцентной микроскопии. Однако, не добавляйте ПТУ до гаструляции, потому что это влияет на раннее эмбриональное развитие.
  2. В 48 часов после оплодотворения, вручную dechorionate эмбрионов с мелкими пинцетом. Выполняйте съемку 48 и 72 часов после оплодотворения эмбрионов под световым микроскопом рассечение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти фотографии могут быть приняты без анестезии.
  3. Около 10 минут до визуализации под флуоресцентным микроскопом, обезболить эмбрионов, помещая их в10 см чашку Петри, содержащую 160 мкг / мл забуференного Tricaine. Подождите 5-10 минут, а затем они слегка касались данио, чтобы подтвердить, что они не двигаются, и поэтому анестезия работает.
  4. После того, как эмбрионы под наркозом, смонтировать их в 3% растворе метилцеллюлозы и ориентировать их в положении лежа при вскрытии микроскопа (пожалуйста, обратитесь к таблице 1).
  5. Обратите внимание на структуру предпочки под флуоресцентным микроскопом (пожалуйста, обратитесь к таблице 1) и сфотографироваться на разных увеличениях (10x и 20x).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Wnt5a сбить была достигнута путем введения перевод блокирующий МО (август-MO) или экзон / интрон границы сращивания MO (разъем-MO), чтобы эмбрионов данио на стадии одной клетки. Авг-мишени из стартовый кодон и, следовательно, ингибирует матери и зиготического сообщение Wnt5A. Сплайсинга мишени из третьего сращивания доноров сайт и ингибирует только зиготического стенограмму Wnt5A (рис 1а). Ческого увеличения и сращивания морфанты phenocopied друг с другом с несколькими дефектами, в том...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Поликистоз почек (ДОК) является одним из ведущих причин терминальной стадии почечной болезни у людей и характеризуется образованием прогрессивной кисты, почечной расширения, и аномального развития канальцев 14. Аутосомно-доминантное PKD (ADPKD) является генетическим заболеванием, в котором мутация или PKD1, кодирование Polycystin-1 (PC1), или PKD2, кодирование Polycystin-2 (PC2), приводит к поликистозных почек. Многие другие гены, особенно те, кодирования белков, обнаруженных в первичной реснички являются дум...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана NIH (DK093625 с ЛГ, и DK069909 и DK047757 в лдх) и VA (Merit Award I01BX000820 в лдх). Мы хотели бы поблагодарить д-ра Майкла обновления и доктора Джи Не при Университете Пенсильвании, данио рерио Core, для обеспечения необходимой поддержки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,5% фенол-красныйSigmaP0290Цветовой индикатор для инъекций
MorpholinoGenn Tools, LLC(по индивидуальному заказу)Индивидуально разработан в соответствии с интересующим геном
Предварительно вытащенная иглаTritech ResearchMINJ-PPЕсли требуется большое количество иглы, вы также можете приобрести съемник игл и подготовить иглу в лаборатории
T7 mMessage KitAmbion1344Для транскрипции in vitro для получения кэпированной мРНК для спасательного эксперимента
N-фенилтиомочевинаSigmaP7629Для профилактики меланизации
ТрикаинSigmaA5040Также называется этил 3-аминобензоат, для анестезии рыбок данио
МетилцеллюлозаSigmaM-0387Для положения рыбок данио
Набор для очистки ПЦР QIAquick Qiagen28104Для очистки продукта ПЦР для синтеза кэп-РНК.
dNTP mixPromegaU1511Для PCR
Tag DNA PolymeraseInvitrogen10342-053Для PCR
NanoDrop спектрофотометрThermo ScientificND-1000Для измерения концентрации морфолино и РНК
Air CompressorWerther International, Inc.Panther Compact 106Источник воздуха для впрыска
Микроинжекционный насос PicoWorld Precision Instruments IncPV830 Pnematic PicoPumpМожно использовать другие типы систем микровпрыска.
МикромануплаторWorld Precision Instruments IncMMJRПравосторонний (MMJL для левшей)
ИглодержательWorld Precision Instruments Inc5430-ALLДля удержания иглы для микроманипуляций
Пинцет DumontFine Surgical Tools11253-20Для отламывания кончика иглы
Препарирующий микроскопLeica M205C Для наблюдения и визуализации эмбрионов рыбок данио-рерио
Флуоресцентный микроскопZeiss Axio Obserer D1m  Для визуализации капиллярной трубки рыбок данио
(внутренний диаметр 0,15 мм)VitroComCV1525Q-100Для измерения объема каждой введенной капли
...

Ссылки

  1. Choi, S. Y., et al. Cdc42 deficiency causes ciliary abnormalities and cystic kidneys. J Am Soc Nephrol. 24 (9), 1435-1450 (2013).
  2. Hostetter, C. L., Sullivan-Brown, J. L., Burdine, R. D. Zebrafish pronephros: a model for understanding cystic kidney disease. Dev Dyn. 228 (3), 514-522 (2003).
  3. Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. Anat Rec. 232 (2), 514-201 (1992).
  4. Keller, G., Zimmer, G., Mall, G., Ritz, E., Amann, K. Nephron number in patients with primary hypertension. N Engl J Med. 348 (2), 101-108 (2003).
  5. Cullen-McEwen, L. A., Kett, M. M., Dowling, J., Anderson, W. P., Bertram, J. F. Nephron number, renal function, and arterial pressure in aged GDNF heterozygous mice. Hypertension. 41 (2), 335-340 (2003).
  6. Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 559-585 (2013).
  7. Igarashi, P. Overview: nonmammalian organisms for studies of kidney development and disease. J Am Soc Nephrol. 16 (2), 296-298 (2005).
  8. Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am J Physiol Renal Physiol. 299 (5), 1040-1047 (2010).
  9. Liu, S., et al. A defect in a novel Nek-family kinase causes cystic kidney disease in the mouse and in zebrafish. Development. 129 (24), 5839-5846 (2002).
  10. Slanchev, K., Putz, M., Schmitt, A., Kramer-Zucker, A., Walz, G. Nephrocystin-4 is required for pronephric duct-dependent cloaca formation in zebrafish. Hum Mol Genet. 20 (16), 3119-3128 (2011).
  11. Huang, L., et al. The role of Wnt5a in prostate gland development. Dev Biol. 328 (2), 188-199 (2009).
  12. Andre, P., et al. The Wnt coreceptor Ryk regulates Wnt/planar cell polarity by modulating the degradation of the core planar cell polarity component Vangl2. J Biol Chem. 287 (53), 44518-44525 (2012).
  13. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  14. Torres, V. E., Harris, P. C., Pirson, Y. Autosomal dominant polycystic kidney disease. Lancet. 369 (9569), 1287-1301 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Wnt5aTg wt1b GFPWnt5a
Возможно данио рерио Модель поликистоза почек: Нокдаун Wnt5a Причины кисты у рыбок данио почек
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.