Методическая статья

Вывод и характеристика Transgene-свободный человек индуцированных плюрипотентных стволовых клеток линии и превращение в определенных условиях Клинико-класса

7.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52158

⸱

26 ноября 2014 г.

 ,  , 
1Department of Molecular and Medical Pharmacology, University of California, Los Angeles (UCLA), 2Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research, University of California, Los Angeles (UCLA)

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем протокол получения перепрограммированных и охарактеризованных безфакторных человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток на основе лентивирала и преобразования в предполагаемые клинические состояния.

Аннотация

Человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) могут быть получены лентивирусными на основе перепрограммирования методологий. Тем не менее, следы потенциально онкогенных генов, оставшихся в активно транскрибируются областей генома, ограничить их потенциал для использования в терапевтических применений человека 1. Кроме того, нечеловеческие антигены, полученные из стволовых клеток перепрограммирования или дифференциации в терапевтически соответствующих производных исключает эти hiPSCs от использования в человеческом клиническом контексте 2. В этом видео мы представляем процедуру перепрограммирования и анализа факторов без hiPSCs бесплатно экзогенных трансгенов. Эти hiPSCs затем могут быть проанализированы на экспрессии генов отклонений в конкретной интрона, содержащего лентивирусов. Этот анализ может быть проведен с использованием чувствительной количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР), который имеет преимущество по сравнению с менее чувствительными методами, ранее использованный для определения различий экспрессии генов 3. Полная конверсия вклинико-класс надлежащей производственной практики (GMP) условия, позволяет клиническое значение человека. Наш протокол предлагает другой методологии, при условии, что текущие критерии безопасной гавани будет расширяться и включать в себя охарактеризованные hiPSC на основе производных Фактор-бесплатно терапевтических применений-для получения GMP-класса hiPSCs, которые должны устранить любую иммуногенности риск из-за нечеловеческих антигенов человека. Этот протокол широко применима к лентивирусов перепрограммировать клетки любого типа и обеспечивает воспроизводимый метод для преобразования перепрограммировать клетки в условиях GMP-класса.

Введение

Было показано, что клетки взрослого человека способны подвергаться эпигенетическому ремоделированию и перепрограммированию в результате лентивиральной экспрессии четырех ключевых транскрипционных факторов4,5. Важным достижением в области перепрограммирования стало использование одной подакцизной лентивирусной кассеты стволовых клеток (STEMCCA), в которой содержались все четыре перепрограммируемых транскрипционных фактора, что позволило получить точное стехиометрическое соотношение экспрессии белка6. Кроме того, при трансдуцировании в определенных множественных диапазонах инфекций STEMCCA может приводить к преимущественно одногеномным событиям интеграции в процессе перепрограммирования7. Внедрение акцизной версии STEMCCA, в которой используется технология Cre/loxP с последующим удалением вектора перепрограммирования после получения линии стволовых клеток, позволило получить бесфакторные линии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (hiPSC)8. Кроме того, для расширения терапевтического применения ИПСК необходимо было внедрить новую, быструю и легко применимую методологию преобразования клеточных линий на уровне надлежащей производственной практики (GMP) из условий, содержащих ксено, в условия, свободные от ксено. В этой статье мы обсуждаем соответствующую методологию, которая более точно оценивает различия в экспрессии интегрированных генов, особенно при интеграции в интрон, и конверсию клеток клинического класса в предполагаемые условия GMP.

В предыдущем исследовании использовался только относительно нечувствительный транскрипционный анализ микрочипов для анализа различий в экспрессии генов в интегрированных генах после трансдукции STEMCCA3,9. Здесь мы представляем методологию чувствительного количественного анализа полимеразной цепной реакции (ПЦР) для дальнейшего изучения различий в интегральной экспрессии генов. Важно отметить, что в настоящее время критерии «безопасной гавани» исключают гиперПСК, которые имеют гены с вирусными интеграциями, тем самым ограничивая применимость этих клеток для последующей клеточной терапии человека. Мы предполагаем, что статус-кво может измениться с использованием полностью охарактеризованных и свободных от трансгенов интронно перепрограммированных ИПСК. Кроме того, мы представляем надежный протокол конверсии клеток класса GMP, который может быть легко применен к различным типам клеток, которые первоначально были полученыв условиях, содержащих ксено. Это предоставляет значительные возможности для разработки будущих экспериментов по перепрограммированию клеток, которые требуют клинических условий для поддержания терапевтической значимости человека.

Эти методологии обеспечивают основу, на которой текущие критерии безопасной гавани могут быть расширены за счет включения характерных перепрограммированных линий hiPSC STEMCCA, которые поддерживают нормальный профиль экспрессии генов после удаления STEMCCA из интегрированного интрона. Кроме того, полная конверсия в клинические условия, свободные от антигенов животных, поможет включить гораздо больше типов клеток, которые ранее были перепрограммированы и охарактеризованы только в условиях, содержащих ксено. Сочетание этих методологий является убедительным основанием для того, чтобы Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) рассмотрело вопрос о расширении своего ограниченного одобрения с терапевтических препаратов на основе человеческих эмбриональных стволовых клеток (ESC) дотерапевтических средств на основе hiPSC.

Недавно мы подробно описали создание бесфакторной линии hiPSC, которая была полностью охарактеризована и преобразована в предполагаемые клинические условия10. Здесь мы подробно описываем протокол получения hiPSC с помощью лентивируса STEMCCA. Затем эти стволовые клетки подвергаются процессу эксцизии, за которым следует характеристика экспрессии генов. Наконец, ИПСК преобразуются в условия, соответствующие требованиям GMP, с помощью методологии медленного преобразования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Примечание: Этот метод был использован в исследованиях сообщается в страхе и др 10..

1. Перепрограммирование взрослого человека фибробласты кожи с STEMCCA

  1. Оттепель взрослых кожные фибробласты человека (HUFs), прохождение 4 или ниже, в C водяной бане 37 ° в течение 2 мин, следя за тем, чтобы не погрузиться в верхней части флакона с водой.
  2. Поместите 1 мл суспензии фибробластов человека в 15-мл коническую пробирку и медленно поместить 4 мл стандартного HUF информации, предварительно нагретой до 37 ° С, в каплям, чтобы разбавить из диметилсульфоксид (ДМСО) и повторно приостанавливать клеток.
  3. Центрифуга пробирку при 200 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Аспирата супернатант и повторно приостанавливать клеток в достаточный объем информации для создания суспензии 100000 клеток / мл, а затем добавить 2 мл в одну лунку в шесть-луночного планшета, предварительно покрытых в течение 20 мин с 0,2% желатина.
    ПРИМЕЧАНИЕ: сестра также с равным количеством клеток в строке и состояния должна быть заполнена FOR клеток учета / множественность заражения (МВД) расчета.
  4. Рок плиты из стороны в сторону и назад и вперед, чтобы равномерно распределить клетки. Инкубируют в течение ночи при 37 ° С, 5% СО 2 в увлажненном инкубаторе.
  5. В день трансдукции, получить количество клеток (ов) из сестры хорошо (ов) примерно через 24 часа после начального форинтов покрытия.
  6. Оттаять 2 х 10 8 Вт, или эквивалент, Lentiviral концентрат (STEMCCA) и доводят до 1 х 10 8 TU / мл в HUF СМИ.
  7. Трансдукции клеток в соотношении 10 MOI в HUF среде с добавлением 8 мкг / мл трансфекции агента. Смешайте трансдуцированных скважин равномерно и инкубировать в течение ночи при 37 ° С, 5% СО 2 в увлажненном инкубаторе.
  8. Примерно 24 часа после лентивирусным трансдукции, включите СМИ HUF к стандартному человек плюрипотентных стволовых клеток (PSC) среды.
  9. В те дни, со 2 по 6, изменить СМИ ежедневно с человека PSC среды.
  10. На 6-й день, два пластине 0,2% желатина покрытием 10 см пластиныОт 1,5 до 1,75 х 10 6 MEFs, полученные из CF1 мышей форинтов СМИ 12.
  11. На 7-й день, стараясь не центрифугировать более чем 100 XG, используйте при комнатной температуре трипсин поднять выходной день 7 перепрограммировать фибробласты из одной скважины из шести-луночного планшета и прохождения в соотношении 1:16, при посеве все клетки равномерно между два 10 см пластинах, с свежей человеческой PSC СМИ, что высевали с MEFs день раньше. Распределить клеточных агрегатов по часовой спиральной движения и места в 37 ° C, 5% CO 2 в увлажненном инкубаторе в течение ночи.
  12. Примерно через 48 часов после посева перепрограммировать клетки на MEFs и каждый день после этого, измените из потратили PSC СМИ человека со свежими СМИ.
  13. После 3-х до 4 недель, выбрать отдельные колонии с типичной морфологии ESC как с 21-калибровочной иглой и субклонирования вне в 24-луночный планшет, поместив примерно от 8 до 10 отдельных частей конкретных колоний на отдельные лунки в 0,2% желатина покрытием 24-луночный планшет предварительно семянред с MEFs, полученных от мышей CF1 в человеческой PSC среды.
    Примечание: После расширения выбраны колонии, колонии должны быть охарактеризованы как плюрипотентные по эмбриоидного формирования тела и анализа экспрессии маркеров плюрипотентности на уровне белка.

2. вектор интеграции Анализ сайта и STEMCCA Удаление

  1. Анализ сайта интеграции STEMCCA государств, не являющихся ограничительными линейного усиления ПЦР, как описано 10.
  2. После опробования, чтобы обеспечить один интеграцию в нужной области генома, акцизов STEMCCA путем аспирации от старого человека ESC среду. Затем объединить 45 мкл концентрированной аденовирус-Cre-Puror с 8 мкг / мл трансфекции агента в 3 мл стандартных средах PSC в течение 24 ч.
  3. После 24-часового инкубационного периода, аспирация от смешанного вирусной супернатант и промыть клетки в два раза с PSC СМИ человека. Поместите свежей человеческой PSC носитель вместе с 2 мкг / мл пуромицин в течение 5 дней, изменения медиа-дневной умч свежей среды и антибиотик.
  4. После 5 дней, субклон остальные колонии с 21-калибровочной иглой на 0,2% желатином лунок, в 12-луночный планшет, предварительно покрытые MEFs, полученных из CF1mice и расширить, как описано выше.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После достаточное расширение для получения замороженного состава, преобразование в фидерных без условий требуется. Ожидать по крайней мере 95% колоний стволовых клеток смерть как большинство клеток не будет успешно трансдуцированных и поддаваться антибиотика в течение 5-дневного периода инкубации. Хотя Adeno-Cre-Puror объединяет в 0,001-1 эффективности в хромосомы хозяина инфицированных клеток%, reexposing образец фактора без колоний Пуромицин, чтобы обеспечить смерть 100% клеток подтвердит никакой интеграции не произошло 13.
  5. Оттепель одну ампулу предварительно аликвоты базальной мембраны матрицы на льду, в течение приблизительно 2 ч (рекомендациями производителя) до тех пор, пока матрица представляет собой жидкость и разбавленной к конечной концентрации 1:30 в холодной базальной средах. Компанияна желаемое количество лунок в шесть-луночного планшета с 1 мл на лунку. Пусть сидят при комнатной температуре в течение 1 часа.
  6. Кросс-люк (с помощью 18-иглы, или стекла или пластика "наконечник") по крайней мере от 20 до 30 колоний от хорошо предварительно покрыты MEFs. Будьте осторожны, чтобы уменьшить MEF поднимает настроение и передать от пластины.
    1. Генерирование штриховкой устройство с помощью ряда различных подходов, с более сложной нагрева, потянув, и заканчивая стеклянной пипетки Пастера на открытом пламени, в простом использованием стерильной пластиковой пипетки наконечник, или, как в нашем случае, 21- и / или 18 калибра иглы.
  7. Аспирируйте матрицу из лунку, покрытую после инкубации.
  8. Удалить части колоний, осторожно выскабливание от старого пластины с 200 мкл, пипетки и осторожно поместите в 3 мл свежего комбинированных СМИ 1 в пластине матрицы покрытием. Выдержите в течение ночи в 37 ° C, 5% CO 2 увлажненном инкубаторе. Изменить массовой информации 48 часа после пересева,
  9. Извлечение геномной ДНК из пост-вырезали и фидерных без преобразованных hiPSCs, более чем на 80% слияния, используя комплекты коммерческой добычи ДНК.
  10. Анализ для правильного удаления с праймерами, специфичными для внешних интеграции лентивирусов STEMCCA: гДНК-Hendo-MycS вперед, 5'-acgagcacaagctcacctct-3 '; гДНК-hWPRE-наоборот, 5'-tcagcaaacacagtgcacacc-3 ». Восстановить лиофилизированные праймеры с ПЦР-класса водой до 10-мкМ исходного раствора.
  11. Запуск ПЦР со следующими пятиступенчатой ​​протокола: начальная денатурация при 95 ° С в течение 3 мин; 35 циклов каждого из следующего: денатурации при 98 ° С в течение 20 сек, отжиг праймеров при 62 ° С в течение 15 сек и удлинение при 72 ° С в течение 15 сек; с последующим одного цикла конечного удлинения при 72 ° С в течение 3 мин.
  12. Сделать 3% агарозном геле путем взвешивания 1,5 г агарозы и размещение его в 50 мл 1x Трис-ацетат-ЭДТА буфера. Микроволновая печь до агарозы растворяются и место в ДНК в геле пятно на рРазбавление Ропер, смешать, а обойтись надлежащего объема в геле кассеты для отверждения в течение 1 ч при комнатной температуре.
  13. Нагрузка 12 мкл ПЦР-продукта смешивали с 3 мкл загрузочного красител в 3% агарозном геле. Запустите гель в течение 30 мин при 80 В.
  14. Визуализация ультрафиолетовым светом для отсутствие полосы индикации надлежащего иссечение.

3. Количественный анализ различий экспрессии генов с помощью количественной ПЦР с пре- и пост-подакцизных hiPSCs

  1. Извлечение общую РНК из пост-вырезали и фидерных без преобразованных hiPSCs с помощью наборов коммерческих экстракции РНК.
  2. Обратное записать до 1 мкг суммарной РНК с помощью коммерческих наборов в соответствии с инструкциями завода-изготовителя. Используйте якорь-олиго (дТ) 18 и случайных праймеров гексамерных.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что протокол ПЦР специально для генных транскриптов более или менее 4 кб. Специфические праймеры должны быть сделаны для какой ген STEMCCA первоначально Встроенные входыNto.
  3. Развести лиофилизированный праймера с ПЦР-класса водой до 20 мкМ исходного раствора.
  4. Использование 5 нг образца в 20 мкл реакции, который состоит из 10 мкм UPL зонда, 2x LightCycler 480 Probes Master и 20 мкМ прямого и обратного праймеров.

4. Преобразование в GMP-класса условий

  1. На первый день перехода пост-вырезали hiPSCs к условиям GMP-класса, сделать смесь массовой информации, состоящей из человеческого PSC в сочетании СМИ 1 (1 в сочетании СМИ) и клиническая оценка надлежащей производственной практики (GMP), совместимые средства массовой информации (в сочетании СМИ 2 ) при соотношении 80:20.
  2. Аспирируйте от старых комбинированных средах 1 и 3 место мл нового комбинированного СМИ 1 и 2, предварительно нагретой при отношении 80:20. Изменение формата носителя в день в течение 3 дней с этой определенном соотношении. Место клетки обратно в 37 ° C, 5% СО 2 инкубатора.
  3. На 4-й день, чтобы объединенный носитель 1 и 2 в соотношении 50:50. Аспирируйте от старого среды и замее с предварительно нагретой СМИ, с комбинированными сред 1 и 2 в соотношении 50:50. Изменение формата носителя в течение 3 дней с этой определенном соотношении. Место клетки обратно в 37 ° C, 5% СО 2 инкубатора.
  4. На 7-й день, чтобы объединенный носитель 1 и 2 в соотношении 20:80. Аспирируйте от старого среды и заменить подогретого СМИ, с комбинированным сред 1 и 2 в соотношении 20:80. Изменение формата носителя в течение 3 дней с этой определенном соотношении. Место клетки обратно в 37 ° C, 5% СО 2 инкубатора.
  5. На 10 день, чтобы суммарный сред 1 и 2 на 0: соотношение 100. Аспирируйте от старого среды и заменить подогретого СМИ, с комбинированными сред 1 и 2 на 0: соотношение 100. Изменение формата носителя каждый день в этом определенном соотношении. Клетки сейчас в совершенно определенной Xeno без средств массовой информации. Место клетки обратно в 37 ° C, 5% СО 2 инкубатора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время всего этого процесса преобразования, процедура пассажи с 18-иглы необходимо для поддержания нужного размера колонии и плотность. План по рassaging клетки каждые 4 до 5 дней на основе размера колонии, слияния и дифференциации.
  6. Шерсть один и в шесть-луночного планшета с определенной Xeno свободной подложки в соответствии с рекомендациями производителя.
  7. Механически проход сливной хорошо, уже превращается в Xeno без условия медиа, от шести-луночного планшета с 18-иглы. Важно отметить, что размещать новые средства массовой информации (в сочетании с медиа-2) на клетках с рок-ингибитора 1x в течение 1 часа, прежде чем пассажей в предварительное условие СМИ.
  8. Аспирируйте синтетический раствор субстрата с нового пластины, что клетки перечисляется на. Удалите все носители, содержащие стволовые клетки сгустки из старой плиты и передать новой пластинкой.
  9. Место клетки обратно в 37 ° C, 5% CO 2 инкубаторе в течение 2 дней с минимальной физической нарушения (в идеале пластины, как только внутри инкубатора, непосредственно не затронуты в любом случае), чтобы обеспечить максимальную вложение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки потребует ежедневные изменения средств массовой информации. Постоянное passaginг каждые 4 дня будут иметь важное значение. Использование 21-иглы, прохождение только части колоний с оптимальным ESC морфологию (высокая цитоплазматический отношение). Это позволит обеспечить выделение для собственных колоний hiPSC, которые будут расти хорошо и в конечном итоге дают однородные колонии. Общее время на выводе ESC как колоний между 15-20 дней после первого комбинированного смены носителя.
  10. Промерзать пост-вырезали hiPSCs GMP-класса по первой штриховки всех из этих колоний, используя 18-иглы. Лифт все куски у с помощью 200 мкл пипетки и передавать все носители, содержащие клетки в 15 мл коническую пробирку и центрифугируют при 200 х г в течение 5 мин при 4 ° С.
  11. В то время как клетки центрифугированием, чтобы морозильную носитель, состоящий из равных объемов холодной комбинированных средах 2 и замораживания среды с конечной концентрацией ДМСО 7,5%.
  12. После Клетки осаждают, аспирация от старого среды и по каплям вновь приостановить гранул с морозильной СМИ. Сразу TRansfer во флаконы замораживания и поставить в -80 ° C морозильнике.

5. Характеризуя GMP-класса Post-подакцизных hiPSCs

  1. Для обеспечения надлежащего выражения маркеров плюрипотентности после преобразования используйте QPCR для количественной оценки экспрессии ключевых маркеров плюрипотентности (SOX2, OCT4 и NANOG) с помощью праймеров, перечисленных в таблице 1 те же действия, как указано в пункте 3. QPCR методологий следовать те же самые шаги, перечисленные в пункте 3.
  2. Использование проточной цитометрии для обнаружения не-человеческого сиаловой кислоты Neu5Gc (N -glycolylneuraminic кислоты) в соответствии со стандартными условиями, перечисленными в комплекте, как описано ранее 10.
  3. Осторожно промыть клеточной культуры пластины с клетками с помощью 1x фосфатно-солевом буфере (PBS).
  4. Диссоциируют колонии с помощью 1x диссоциации реагента в течение 5 мин при комнатной температуре.
  5. Во время 5-минутного периода инкубации на стадии 5.4, подготовить блокирующий раствор (представленную вКомплект), сделав 0,5% блокирующий агент в ледяной PBS.
  6. Этикетка следующий набор труб для проточной цитометрии: неокрашенные; 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) DAPI; Антитело управления 1: 200; Первичное антитело 1: 200; Вторичный антитела 1: 200 осел Анти-курицы IgG (H + L); Примеры MEFs; Примеры пост-вырезали клетки на матрице; и образец после вырезали клетки на синтетической подложке.
  7. Осторожно сместить клеточных агрегатов с шага 5,4 путем добавления 2 мл блокирующего раствора и передачи содержимого в 15-мл коническую трубку. Центрифуга на 80 мкг в течение 5 мин при 4 ° С.
  8. Вымойте клетки в два раза с блокирующим раствором и центрифуги, как указано в пункте 5.7.
  9. Осторожно повторно приостанавливать приблизительно 1 × 10 6 клеток в 100 мкл блокирующего раствора с соответствующим объемом разбавления каждого антитела. Инкубируют при осторожном встряхивании при 4 ° С в течение 1 часа.
  10. Повторите моет три раза, как в шаге 5.8.
  11. Повторное приостановить осадок клеток в 400 мкл разбавителя Buffer (с комплектом) с 1: 100 в DAPI для труб 2, 6, 7, и 8, перечисленных в соответствии с шагом 5,6.
  12. Штамм клеток через 40 мкм сито и проходят через проточной цитометрии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мы представляем протокол для получения фактора без hiPSCs клинико-класса с помощью подход перепрограммирования STEMCCA лентивирусный основе. 1А показывает репрезентативную картину трех различных предварительно вырезали линий hiPSC, после перепрограммирования с подходом STEMCCA на слое MEFs. Основное преимущество подхода перепрограммирования STEMCCA заключается в последовательном успеха перепрограммирования достигается несколькими учеными, в различных научно-исследовательских групп и мест. Фиг.1В...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мы описываем методологию получения фактора без hiPSCs и сделать их клиническое значение путем преобразования этих клеток в условиях GMP-класса для последующего дифференцировки клеток в будущих терапии человека. Хотя этот протокол является широко применимы к различным типам клеток, мы выбрали перепрограммировать дермальные фибробласты человека, из-за простоты извлечения из пациента и их применимости к индивидуальной терапии человека. После того, как ограничения устранены, насколько полной дифференциации в клинически знач...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Джеймс А. Бирн (JAB) и Агустин Вега-Креспо получают финансирование от Fibrocell Science, Inc. JAB является научным консультантом Fibrocell Science, Inc. Никакие другие авторы не имеют конкурирующих интересов, которые могли бы раскрыть.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Патрика С. Ли, Сирила Раматала и Сараванана Карумбаярам (SK) за их помощь в проведении экспериментов по получению и характеристике iPSC; Аарону Куперу за проведение экспериментов по анализу iPSC; Витторио Себастьяно и Рене А. Рейо Пера за руководство первоначальными усилиями по перепрограммированию; С.К., Уильяму Э. Лоури, Джерому А. Заку и Дональду Б. Кону за руководство созданием объектов GMP Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе, позволяющих конверсию и определение характеристик ИПСК клинического уровня; Густаво Мостославский за предоставление нам полицистронного вектора перепрограммирования STEMCCA. Эта работа основана на исследовательском сотрудничестве с Fibrocell Science и Инициативой по клиническим исследованиям дермальных производных мезенхимально полученных (CIDMOD) с целью создания безопасных персонализированных клеточных терапевтических средств. Эта работа была поддержана финансированием Центра регенеративной медицины и исследований стволовых клеток Эли и Эдит Броуд в Калифорнийском университете в Лос-Анджелесе, Фондом семьи Фелпс, Fibrocell Science, Inc. и премией ученых CTSI Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе для JAB.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Media and reagents
DMEM/F12 (базальная среда)Invitrogen (Carlsbad, CA, США)11330057
Фетальная бычья сывороткаInvitrogen16000044
Минимальная незаменимая среда (MEM) заменимые аминокислоты (NEAA), 100xInvitrogen11140050
Glutamax, 100xInvitrogen35050-061
PenStrep, пенициллин-стрептомицин, 100xInvitrogen15140-122Размораживание при 4 градусах; C, aliquot и хранить при &минус; 20 ° C
Нокаутирующая замена сывороткиИнвитроген10828028размораживание при 4 °°С; C, aliquot и хранить при &минус; 20 ° C
Трипсин/ЭДТА, 0,5%Инвитроген15400-054Разбавить запас до 0,05% в 1x PBS
Основной фактор роста фибробластовGlobalStem (Роквилл, Мэриленд, США)GSR-2001Восстановить до 10 & микро; г/мл запаса в 0,1% бычьей сыворотке альбумина, растворенного в 1x PBS и хранить при &минус; 80 ° C
β-меркаптоэтанолMillipore (Billerica, MA, США)ES-007-E
Matrigel (матрица базальной мембраны)BD Biosciences (Сан-Хосе, Калифорния, США)356231Разбавьте флакон Matrigel 10 мл DMEM/F12 на льду для разведения в соотношении 1:2. Аликвот и хранить в &минус; 20 °C.
CELLstart (синтетический субстрат)InvitrogenA1014201
Stemmolecule Y27632Stemgent (Кембридж, Массачусетс, США)04-0012-02
PuromycinInvitrogenA1113802
LightCycler 480 Probes MasterRoche (Базель, Швейцария)4707494001
ProFreeze-CDM Medium/freezing mediumLonza (Базель, Швейцария)12-769E
ДиметилсульфоксидSigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США)D8418
PBSInvitrogen14190-250
BP DNA LadderInvitrogen15628019
SYBR Safe DNA Gel Stain 10,000xInvitrogenS33102
AgaroseBio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, США)161-3101
Желатин, из свиной кожиSigma-AldrichG1890-100GСделать запас 0,2% в PBS, автоклав и хранить при комнатной температуре.
mTeSR1StemCell Technologies (Ванкувер, Британская Колумбия, Канада)5850Комбинированная добавка 5x с основной средой, аликвотой и хранением при 4 градусах; C в течение 2 недель.
Stemedia NutriStem XF/FF Культуральная средаStemgent05-100-1AРазмораживание при 4°С; C O/N, aliquot и хранить по адресу 4 ° C в течение 2 недель.
PrimocinInvivoGen (Сан-Диего, Калифорния, США)ant-pm-1
Accutase (реагент диссоциации)InvitrogenA1110501
Donkey Anti-Chicken IgG AlexaFluor 488Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, США)703-546-155
Полибрен/трансфекционный агентMilliporeTR-1003-G
Plasticware
12-луночные пластиныVWR (Вест Честер, Пенсильвания, США)29442-038
6-луночные пластиныVWR29442-042
10-сантиметровые пластиныSigma-AldrichZ688819
игла 18-го калибраFisher Scientific (Питтсбург, Пенсильвания, США)148265D
игла 21-го калибраFisher Scientific14-829-10D
Equipment
BD LSRII Проточный цитометрKSystem by Nikon (Токио, Япония)
BD FACSDiva Version 6.1.3 SoftwareBD Biosciences
Kits
PureLink Genomic DNA Mini KitInvitrogenK182000
KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR kitKAPA Biosystems (Уилмингтон), MA, США)KK2601
Набор для выделения высокочистых РНКRoche11828665001
Набор для синтеза кДНК первой нити транскриптораRoche4379012001
Sialix anti-Neu5Gc Basic Pack KitSialix (Newton, MA, США)Basic Pack
Media
Combined media 1StemCell Technologies и StemgentСостоит из равных частей mTeSR1 и Nutristem
Комбинированные среды 2StemCell Technologies и StemgentСостоит из равных частей TeSR2 и Nutristem
HUF MediaDulbecco' s модифицированный Eagle' s medium/F12 [DMEM/F12] с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 1x заменимых аминокислот, 1x Glutamax и 1x Primocin
Human Pluripotent Stem Cell MediaDMEM/F12 с добавлением 20% нокаутирующей замены сыворотки, 1x Глутамакса, 1x заменимых аминокислот, 1x Primocin, 1x β-меркаптоэтанола и 10 нг/мл основного фактора роста фибробластов.
DMEM/F12, Dulbecco' s модифицированный Eagle' s средний/F12; PBS, фосфатно-солевой буфер.

Ссылки

  1. Sommer, C. A., Mostoslavsky, G. The evolving field of induced pluripotency: Recent progress and future challenges. J Cell Physiol. 228, 267-275 (2013).
  2. Lu, H. F., et al. A defined xeno-free and feeder-free culture system for the derivation, expansion and direct differentiation of transgene-free patient-specific induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35, 2816-2826 (2014).
  3. Karumbayaram, S., et al. From skin biopsy to neurons through a pluripotent intermediate under Good Manufacturing Practice protocols. Stem Cells Transl Med. 1, 36-43 (2012).
  4. Mostoslavsky, G. Concise review: the magic act of generating induced pluripotent stem cells: many rabbits in the hat. Stem Cells. 30, 28-32 (2012).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  6. Sommer, C. A., et al. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 27, 543-549 (2009).
  7. Somers, A., et al. Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 28, 1728-1740 (2010).
  8. Sommer, C. A., et al. Excision of reprogramming transgenes improves the differentiation potential of iPS cells generated with a single excisable vector. Stem Cells. 28, 64-74 (2010).
  9. Papapetrou, E. P., et al. Genomic safe harbors permit high beta-globin transgene expression in thalassemia induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29, 73-78 (2011).
  10. Awe, J. P., et al. Generation and characterization of transgene-free human induced pluripotent stem cells and conversion to putative clinical-grade status. Stem Cell Res Ther. 4, (2013).
  11. Receives FDA Clearance to Begin World's First Human Clinical Trial of Embryonic Stem Cell-Based Therapy. Geron Corporation Press Release. , Geron. (2009).
  12. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. 64, 3810-383791 (2012).
  13. Mitani, K., Kubo, S. Adenovirus as an integrating vector. Curr Gene Ther. 2, 135-144 (2002).
  14. Patterson, M., et al. Defining the nature of human pluripotent stem cell progeny. Cell Res. 22, 178-193 (2012).
  15. Schroder, A. R., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110, 521-529 (2002).
  16. Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CreGMP

Похожие статьи