Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Производство и использование Лентивирус, чтобы выборочно преобразовывать Первичная олигодендроцитов клеток-предшественников для In Vitro миелинизации Анализы

14.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52179

⸱

12 января 2015 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Neuroscience, The University of Melbourne, 2The Florey Institute of Neuroscience and Mental Health Research, The University of Melbourne

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протоколы, которые предлагают гибкую и стратегическую основу для вирусного манипулирования клетками-предшественниками олигодендроцитов для сверхэкспрессии интересующих белков, чтобы конкретно исследовать их роль в олигодендроцитах с помощью модели миелинизации центральной нервной системы in vitro.

Аннотация

Миелинизации представляет собой сложный процесс, который включает в себя как нейроны и миелин, образующий глиальные клетки, олигодендроциты в центральной нервной системе (ЦНС) и шванновских клеток в периферической нервной системе (PNS). Мы используем в пробирке миелинизации анализ, установленную модель для изучения ЦНС миелинизации в пробирке. Чтобы сделать это, клетки олигодендроцит предшественника (OPCS) добавляются к очищенной основной грызунов спинной ганглий корень (DRG) нейронов, чтобы сформировать myelinating сопутствующих культур. Для того, чтобы специально допросить роли, что отдельные белки, выраженные олигодендроцитах оказать на миелинизации мы разработали протоколы, которые избирательно преобразовывать OPCs помощью лентивирус с гиперэкспрессией дикого типа, постоянно активный или доминантных негативных белки перед посеяны DRG нейронов. Это позволяет нам специально допросить роли этих олигодендроглиальным белков в регуляции миелинизации. Протоколы могут быть применены при изучении OTее типы клеток, обеспечивая тем самым подход, который позволяет избирательно манипулировать белков, выраженных от желаемого типа клеток, таких как олигодендроциты для целевого изучения сигнализации и механизмы компенсации. В заключение, сочетая в пробирке миелинизации анализа лентивирусными инфицированных OPCs обеспечивают стратегический инструмент для анализа молекулярных механизмов, участвующих в миелинизации.

Введение

Миелинизации аксонов имеет решающее значение для быстрого и эффективного передачи потенциалов действия как в центральной и периферической нервной систем. Специализированных клеток, шванновских клеток в периферической нервной системе и олигодендроциты в центральной нервной системе, обернуть вокруг и ensheathe аксоны в миелина, эффективно изолирующих нерв и облегчающие сальтаторных проводимость 1. Процесс миелинизации могут быть изучены в лабораторных помощью сетчатки ганглиозных нейронов 2, инженерные нановолокон 3 или задних корешков ганглиев сокультивировали либо с клетками Шванн 4 или олигодендроцитах 5-7. В пробирке миелинизация анализ является известной моделью для изучения нервной системы миелинизации и она повторяет многие из фундаментальных процессов, которые происходят во время миелинизации в естественных условиях 5-8. Анализ включает совместного культивирования очищенных популяций спинных ганглий (DRG) нейронов, с OPCs (для CNS миелинизация) или Шванн клетки (для ПНС миелинизации). При определенных условиях эти myelinating клетки ensheathe DRG аксоны в упорядоченной, ультра структурно проверены, мульти-пластинчатые листа изолирующего клеточную мембрану, что выразить одинаковый набор миелиновых специфических белков, присутствующих в естественных условиях.

Наиболее часто используется сотовый модель изучения ЦНС миелинизации в пробирке является со-культуры DRG нейронов и OPCs, которые были успешно использованы для изучения влияния, что экзогенные факторы, такие как нейротрофинов оказывают на ЦНС миелинизации в пробирке 5,6. Внешние факторы, такие как факторы роста или низкомолекулярных фармакологических ингибиторов широко используется для изучения роли сигнальных путей в миелинизации с помощью DRG-OPC Совместное культивирование модели 7,9. Тем не менее, в случае смешанных со-культуры, которые содержат как нейроны и олигодендроциты, она по-прежнему формально можно что либо факторы роста или Pharmacological ингибиторы могли оказать воздействие на обоих нейронов DRG и олигодендроциты (ПР). Это действительно предлагает способность специфически вскрыть роль, что белки, выраженные только ДРГ или олигодендроглии оказывает на миелинизации с помощью этой системы двойной клеток. Однозначно подтверждают, что сигнальный путь в олигодендроглиальных непосредственно регулирует миелинизация, лентивирусный трансдукция OPCs, перед посевом на DRG нейронов для в пробирке миелинизации анализа, оказалась элегантный способ сверхэкспрессировать как дикого типа и мутантных белков, а также как нокдаун экспрессии конститутивно экспрессированных белков по олигодендроцитах. Таким образом, этот подход дает проспект специально опроса и манипулировать сигнальными путями внутри олигодендроцитах для изучения миелинизации 9,10.

В этой статье мы приводим методы, которые мы разработали для сверхэкспрессии представляющего интерес белка выборочно в олигодендроцитах с помощью лентивирусногоподход к изучению миелинизации в пробирке. Методика начинается с генерации векторов экспрессии, содержащих нужный ген, будь то в дикого типа, конститутивно активным или доминирующей негативной форме, которые затем последовательно клонировали в вектор pENTR (pENTR L1-L2 pENTR4IRES2GFP). Этот вектор (содержащий интересующий ген), ЦМВ промотор донора (pENTR L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV) и 2K7 lentivector объединены в ферментативной реакции с получением 2K7 вектор, содержащий промотор CMV, интересующий ген, Внутренняя рибосомальной сайт вход и GFP (рис 1). Этот шлюз клонировали 2K7 конструкция в сочетании с вирусной оболочки PMD2.G и вирус пакета pBR8.91 могут быть совместно трансфицировали в клетки HEK293T генерировать лентивирус, которые впоследствии могут быть использованы для трансдукции OPCs. После заражения с лентивирусов в OPCs выражают высокий уровень белка, представляющего интерес. Эти OPCs затем могут быть посеяны на DRG нейронов культур и эффект, что экспрессиявысоких уровней нужного белка оказывает на миелинизации может быть допрошен. Со-культуры оценивали на экспрессию белка миелина с помощью Вестерн-блот-анализа и визуализировали для формирования миелиновых аксонов сегментов по иммуногистохимии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все животные, используемые в данном исследовании были смешанного пола и вырос на животных в Департаменте средств анатомии и патологии и Florey Института неврологии и исследований в области психического здоровья в Университете Мельбурна. Все процедуры на животных были одобрены комитетами по экспериментам на животных этики в университете Мельбурна.

1. Клонирование 2K7 Lentivector

  1. Перед клонированием интересующий ген в вектор 2K7 лентивирусов, субклонирования гена в вектор pENTR (3637 п.н., устойчивых к канамицину) с использованием стандартных методов молекулярной 11. Используйте сайты рестрикции EcoRI и SacII для субклонирования.
  2. Усиление 2K7 Lentivector
    1. Преобразование 2K7 lentivector ДНК путем осторожного перемешивания 100 нг плазмидной ДНК с компетентных клеток и инкубируют на льду в течение 30 мин.
    2. Тепловой удар ДНК / компетентные клетки смешивают при 42 ° С в течение 90 сек и пластины их на LB-чашки с агаром, содержащих как ampiciОИСДП (100 мкг / мл) и хлорамфеникол (15 мкг / мл) при 37 ° С в течение 16-18 ч.
      Примечание: хлорамфеникол используется для предотвращения рекомбинации между длинных концевых повторов.
    3. На следующий день, растут выбран бактериальных клонов в LB среде, содержащей как ампициллин (100 мкг / мл) и хлорамфеникол (15 мкг / мл) при 37 ° С в течение 16-18 ч. Извлечение ДНК с использованием коммерческого ДНК плазмиды Maxiprep комплект в соответствии с инструкциями изготовителя.
  3. Sub-клонирование от pENTR вектора к 2K7 Lentivector (Рисунок 1)
    figure-protocol-1
    Рисунок 1:. Схематическое изображение процесса рекомбинации шлюза интерес ген, представленный здесь, как флаг-Erk1, клонировали в вектор pENTR L1-L2. Это будет добавлен в вектор pENTR L4-R1, содержащего промотор CMV и вектор основой 2K7. Эти три вектора рекомбинации по LR Clonase II Plus ферментавставить ген интересов, и промотор в вирусную готовые 2K7 вектора.
    1. Добавить следование 1,5 мл трубки и аккуратно перемешать:
      L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV (промоутер) (60 BNG) 1-2.5 мкл
      L1-L2 pENTR4IRES2GFP (с интересующего гена) (80 Bng) 1-2.5 мкл
      K7 lentivector (80 нг / мкл) 1 мкл
      ТЕ-буфера, рН 82-5 мкл
      Всего 8 мкл
    2. Удалить Clonase смеси ферментов от -80 & deg; С и ​​оттаивают на льду в течение 2 мин. Убедитесь, что этот фермент является свежей аликвоты от -80 & deg; С, как фермент существенно снижается эффективность клонирования с повторными циклами замораживания-оттаивания
    3. Добавить 2 мкл фермента на реакцию и хорошо перемешать с помощью вихря и инкубировать Clonase реакционной смеси при 23-25 ​​° С в течение 6-24 ч.
    4. Добавить 1 мкл протеиназы К раствору (поставляется с комплектом фермента) к реакционной смеси Clonase и инкубировать в течение 10 мин при 37 ° С.
    5. Преобразование Clonase реакционной смеси в компетентные клетки и расти выберитеколонии в LB среде, содержащей ампициллин (100 мкг / мл) при 37 ° С в течение 16-18 ч.
    6. Извлечение и очистить ДНК с использованием коммерческого ДНК плазмиды Miniprep комплект в соответствии с инструкциями изготовителя.
    7. Подтвердите ДНК с помощью пищеварения с помощью ферментов рестрикции Spe I и Sac II и соответствующий буфер в соответствии с инструкцией завода-изготовителя, чтобы удалить фрагмент, содержащий промотор и ген интереса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг важен, чтобы проверить, если субклонирован ДНК имеет правильный ген вставки интересов с правого вектора позвоночника. Размер самого вектора без вставленного фрагмента в 6,7 кб. Размер выпущенного вставленного фрагмента включает в себя как промотор и ген вставки интереса. Рассчитать ожидаемый размер фрагмента из дайджеста для конкретного гена с помощью программы редактирования последовательности ДНК, например, APE - плазмида, редактор.
    8. Проверьте размеры как ДНК вектора позвоночника и отпущенной фрагмента, выполнив 1% агарозном гелев 1x TAE буфер (см таблицу исходных растворов) в 100 В.
    9. Amplify подтвержденный ДНК путем выращивания бактерий в 500 мл LB среде, содержащей ампициллин (100 мкг / мл) при 37 ° С в течение 16-18 ч.
    10. Извлечение и очистить ДНК с использованием коммерческого ДНК плазмиды Maxiprep комплект в соответствии с инструкциями изготовителя.
      Примечание: Maxiprep обычно создает достаточное количество ДНК, необходимое для продуцирования вирусов.
  4. Повторите шаги 1.3.9-1.3.10, чтобы усилить следующие ДНК для лентивирусных препаратов: конверт вектор (PMD2.G, 6,1 кб), пакет вектор (pBR8.91, 12,5 КБ), и пустой Lentiviral вектор в качестве контроля (GFP -CMV-2K7, 8,7 кб).

2. 2K7 Вирус Производство

ПРИМЕЧАНИЕ: День 1:

  1. В день трансфекции, плиты 32000000 HEK293 Т-клеток в Т175 колбу, содержащую 25 мл Т-клеток НЕК293 носитель (смотри таблицу исходных растворов). Кроме того, пластина 16 миллионов клеток деньдо трансфекции, если время работает плотно в день трансфекции.
    Примечание: трансфекции может быть с равным успехом путем посева клеток на день трансфекции или до дня. С помощью одного из двух альтернативных вариантов, критическая точка здесь, чтобы убедиться, что клетки застрял вниз на блюдо культуры поверхности до трансфекции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: День 2:
  2. Трансфекция
    1. До трансфекции, разбавленной ДНК 1 мкг / мкл в буфере ТЕ, которые содержат 10 мМ Трис, рН 8, 1 мМ ЭДТА, рН 8 в деионизированной воде.
    2. В 50 мл пробирку, подготовить основной смеси (таблица 1) для трансфекции в колбе Т175. Добавить ДНК подогретого Игла в модификации Дульбекко (DMEM) и хорошо перемешать вихря, а затем добавить стерильную полиэтиленимин (PEI) (смотри таблицу исходных растворов), чтобы избежать преждевременного осаждения. ">
      Вектор Чонг> Концентрация Объем
      pMDG.2 1 мкг / мкл 5 мкл
      pBR8.91 1 мкг / мкл 15 мкл
      2K7 вектор с GFP + интересующего гена 1 мкг / мкл 22 мкл
      Стерильные полиэтиленимина (ПЭИ) 1 г / л 500 мкл
      DMEM 2100 мкл
      Таблица 1: Подготовка трансфекции смесь для 2K7 Касперского.
    3. Хорошо перемешать путем обращения трубку 3-4x и инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре (RT).
    4. Выполнение полного изменения медиа на HEK293T клеток. Аспирируйте от культуральной среды из клеток полностью и кормить подогретым HEK293T среды для культивирования клеток (25 мл на Т175 колбу).
    5. Добавить трансфекции смесь (ДНК / PEI смеси) по каплям к клеток монослоя. Перемещение осторожно, чтобы хорошо перемешать и инкубировать трансфицированные клетки при 37 ° С, 5% СО 2 в течение ночи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: День 3:
    6. Для обеспечения трансфекции успешно, проверить выражение GFP 24 ч после трансфекции с помощью флуоресцентной микроскопии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более 50% клеток, экспрессирующих GFP, как правило, указывает на хорошую трансфекции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: День 4:
  3. В 48 ч после трансфекции, собирать вирусный супернатант и заменить свежими HEK293 Т СМИ (25 мл на Т175 колбу).
    1. Центрифуга вирусной супернатант в 1140 х г в течение 10 мин при 4 ° С для очистки клеточного дебриса от супернатант. Передача очищены супернатанта к 50 мл пробирку и хранят при температуре 4 ° С.
      ПРИМЕЧАНИЕ: День 5:
  4. В 72 ч после трансфекции, собирают вторую партию вирусной супернатант. Повторите шаг 2.3.1 и бассейн 48 и 72 ч очищается супернатантами.
  5. Для концентрации вируса, вирусный супернатант центрифуги в 170000 х г в течение 90 мин при 4 ° С с использованием 30 мл Ультрацентрифуга трубки.
  6. Жидкость над осадком сливают и повторить шаг 2,6, пока все очищены супернатант был центрифугировали оставляя (невидимый) гранул вируса плюс осаждают PEI в базе трубки.
  7. Ресуспендировать вирус, добавить 500 мкл SATO СМИ (см таблицу исходных растворов), чтобы ультрацентрифуга труб. Vortex в течение 30 секунд аго очистить основание трубки с наконечником пипетки механически ослабить вирус. Повторите этот шаг 6x для того, чтобы потерять вирусной гранулы.
  8. Бассейн Ресуспендированный вирус в микропробирок и вращаются очень кратко для удаления нерастворимого PEI. Фильтр супернатанта через 0,45 мкм фильтр для удаления белков.
  9. Алиготе вирус в 20 мкл, 50 мкл и 100 мкл аликвоты и хранят при -80 ° С.

3. Определение титра вируса в клетках HEK293T

  1. Чтобы проверить экспрессию интересующего белка и определить оптимальную концентрацию вируса для экспериментов, добавить серию последовательных разведений вируса наличии (например, 0, 5, 10, 20, 40, 80 мкл) в трансдукции Т-клеток НЕК293 высевают в 6-луночные планшеты, и культуры в течение 24 часов при 37 ° С, 5% СО 2. Этот протокол, как правило, формирует вирус, который может быть использован в концентрациях от 1:50 до 1: 200, что достичь надежной экспрессии геназаинтересованность.
  2. 48 часов после вирусной трансдукции, лизируют клетки HEK293T в TNE буфера (см таблицу маточного раствора) с ингибиторами протеазы.
    1. Промыть лунки дважды охлажденной DPBS и затем добавить 150 мкл буфера ТНЭ в каждую лунку.
    2. LYSE клетки с помощью пипетки вверх и вниз 5-10 раз. Передача лизаты клеток в 1,5 мл микроцентрифужных трубки и инкубировать на льду в течение 15-30 мин.
    3. Центрифуга лизаты при 4 ° С в течение 30 мин при максимальной скорости (20000 х г) и передачи сбрасывается супернатант в чистую пробирку для определения белка по Bradford и последующего Вестерн-блоттинга.
  3. Определение уровня экспрессии интересующего белка с помощью стандартных Вестерн-блот-анализа в то время зондирования антител против самого белка и плавленого тега (т.е., флаг). Используйте вирусный разведения, который дает> 95% GFP + клеток и сильную экспрессию белка интереса для экспериментов.

4. Выделение и культивирование DRG, (Figure 2 шаги 1 и 2)

figure-protocol-2
Рисунок 2:. Принципиальная схема в пробирке миелинизации нейронов DRG анализа расчленены из P2-3 крысят, затем очищают и культивированных в течение двух недель (1-2). OPCs очищают от крыс мозга P7-9 использованием immunopanning (3). OPCs затем инфицировали лентивирусов и культивировали в течение 48 ч (4). OPCs затем высевали на DRG, и любые факторы роста, такие как интерес BDNF добавляют (5). Со-культуры затем культивировали в течение 2 недель, чтобы позволить OPCs дифференцировать и myelinate аксоны (6). И, наконец, со-культуры либо лизируют для вестерн-блоттинга или фиксированной для иммуногистохимии (7).

ПРИМЕЧАНИЕ: День 1 2 дня до вскрытия:

<ол>
  • Шерсть в автоклаве 22 мм х 22 мм покровные с поли-L-орнитин (0,5 мг / мл) в 6-луночный планшет, и инкубируют при 37 ° С в течение ночи.
  • На следующий день, пальто покровные снова ламинином (20 мкг / мл в MEM) при 37 ° С в течение ночи, аспирация лишнюю и сухой в течение 20 минут в капот культуры ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ: День 2: Вскрытие и изоляции ДРГ:
  • Жертва P2-P3 крысята 12x шейным перерезки.
  • Удалить кожу, покрывающий мышцы от задней части животного. Используйте Vännäs ножницы, чтобы открыть позвонков отверстия и использовать пинцет, чтобы аккуратно выкопать спинного мозга.
  • Выклюй ДРГ, которые лежат между позвоночнику и отрезать прикрепленные спинного нервных волокон, а затем поместить ДРГ в блюдо 33 мм Петри, содержащую 3 мл L-15 средств массовой информации. Это, как правило, можно собрать от 8 до 12 DRG с каждой стороны спинного мозга
  • Передача собраны DRGs наряду с L-15 средств массовой информации в 15 мл трубки, центрифуге при 180 мкг в течение 5 мин.
  • Придыхательныйсупернатант, добавить 2 мл 0,25% трипсина в DRG гранулы и инкубировать при 37 ° С в течение 30 мин.
  • Добавляют 5 мл среды М1 (табл исходного раствора) к DRG гранул, чтобы остановить трипсина и центрифуге при 180 х г в течение 3 мин при комнатной температуре.
  • Отберите супернатант, вновь приостановить осадок в 2 мл подогретого среды М1 (не с факторами роста). Растирают ганглиев гранул с помощью пипетки 50x или до ганглии рассеяны. Центрифуга клеточной суспензии при 180 мкг в течение 3 мин.
  • Ресуспендируют диссоциируют нейроны в M1 сред и пластины вниз в 6-луночный планшет в 5 ганглиев на 100 мкл на лунку.
  • Для удаления пролиферирующих без нервных клеток, после как минимум 4 ч инкубации для облегчения присоединения, снимите M1 СМИ и кормить нейроны М2 СМИ (см таблицу маточного раствора). Культура DRG нейроны в присутствии NGF (100 нг / мл), чтобы очистить культуры ФРН-зависимых TrkA экспрессирующих DRG,. Кроме того, использование BDNF (100 нг / мл), чтобы очистить BDNF-зависимого TrkB-Expresпеть ДРГ.
  • Поддержание нейронов в М1 СМИ (+ NGF или BDNF на 100 нг / мл), чередующиеся с антимитотическую М2 СМИ в течение 2 недель, как показано ниже.
  • Поддержание среды M1 (+ NGF или BDNF на 100 нг / мл) в дни: 4-6, 8-10, 12-14 и М2 носитель (+ NGF или BDNF на 100 нг / мл) с FDU и уридин в дни 1, чтобы 4, 6-8, и 10-12. Минимум 3 циклов очистки M2 медиа требуется.
  • Поддержание DRGs в M1 в покое еще на одну неделю после завершения 2 недели антимитотической цикл. Изменить M1 СМИ каждые 2-3 дня.

    • 5. Выделение и культивирование OPCs (рис 2 шаг 3)

    ПРИМЕЧАНИЕ: День 1 2 дня до вскрытия:

    1. Coat 10 см ткани культуральные планшеты с поли-D-лизина (PDL, 10 мкг / мл в стерилизованной деионизированной воды) при 4 ° С в течение ночи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: День 2: 1 день до вскрытия:
    2. Вымойте PDL пластины стерильной деионизированной воды для 3x. Дайте высохнуть в течение ~ 6 ч в капот культуры ткани. Если не используется сразу, оберните и магазиндо 4 недель при 4 ° С.
    3. Подготовка пластин вторичных антител для immunopanning. Для 1 мозга вскрытия, подготовки 2x IgG пластинок (для RAN2 антитела, чтобы удалить астроцитов и О1 антитела, чтобы удалить premyelinating олигодендроцитов), с 45 мкл Козье α мыши IgG в DPBS (15 мл) в 10 см чашки Петри; 1x IgM пластина для (O4 антитела для выбора клетки-предшественники олигодендроцитов), 45 мкл Козье α мыши IgM в DPBS (15 мл) в 10 см чашки Петри.
      ПРИМЕЧАНИЕ: День 3: день вскрытия:
    4. Добавить 200 единиц папаина в 10 мл буфера папаина (таблица 2), и нагревают до при 37 ° С, пока буфер не станет прозрачной.
      Концентрация 250 мл Конечная концентрация
      EBSS акции 10x 25 мл 1x
      MgSO 4 100 мМ 2,5 мл 1 мм
      Глюкоза 30% 3 мл 0,46%
      ЭГТА 0,5 М 1 мл 2 мм
      NaHCO 3 1 М 6,5 мл 26 мм
      Доведите объем до 250 мл с помощью деионизированной воды и фильтра стерилизуют
      Таблица 2: Получение папаина буфера.
    5. Вымойте все тарелки вторичные антитела с DPBS для 3x.
    6. Вылейте RAN2 и O1 антитела на пластинах IgG и O4 гибридомы к IgM пластины. Инкубируйте все эти пластины первичного антитела в течение 2 ч при комнатной температуре.
    7. Проанализируйте один мозг от P7 крысы. Обезглавить щенка с заостренными ножницами и удалить кожа, покрывающая череп с ножницами.
      1. Сокращение вокруг черепа, затылочной доли, височной доли и лобной доли. Удалить мозг от черепа с помощью щипцов и аккуратно перенести его на 35-мм чашки Петри с 1 мл DPBS.
      2. Нарезать мозг на мелкие кусочки примерно с ножницами или стерильной лезвия.
    8. Фильтр предварительно нагревают папаин буфера (10 мл) в новую пробирку, содержащую 15 мл несколько зерен L-цистеина, затем добавить 200 мкл ДНКазы (12500 ЕД / мл) в буфере фильтровали папаина.
    9. Вылейте папаин буфер на нарезанные кубиками тканях мозга; инкубировать при 37 ° С в течение 90 мин.
    10. Gentlly передачи диссоциируют ткани головного мозга в 50 мл пробирку с использованием 25 мл пипетки идают отстояться.
    11. Удалить папаин буфер, добавьте 2 мл Lo Ово (Овомукоид) к тканям мозга и titurate в 5-10 раз с помощью пипетки, чтобы разбить куски тканей головного мозга, дают отстояться и снимите верхнюю 2 мл супернатанта в новую пробирку.
    12. Добавить еще 2 мл Lo ово к тканям мозга и повторите шаг 5,11 до исчезновения куски ткани не останется. Tituration можете получить более агрессивным.
    13. Центрифуга диссоциированных клеток суспензии в течение 15 мин при 200 х г. Аспирируйте от супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 10 мл Hi Ово и центрифуги в течение 15 мин при 200 х г.
    14. Вымойте первый immunopanning пластину (Ran 2 пластины) с DPBS для 3x. Аспирируйте супернатант, ресуспендирования клеток в 10 мл буфера панорамирования (таблица 2) и залить на первом immunopanning пластины (RAN 2 пластины). Инкубируйте клетки в течение 15 мин при комнатной температуре.
    15. Вымойте второй immunopanning пластину (O1 планшета) DPBS для 3x.
    16. После инкубации в первый immunopanning пластины, наконечник клеточной суспензии на второйimmunopanning пластина (пластины О1), промыть любые свободные клетки с поверхности пластины с 1-3 мл буфера панорамирования и передачи с помощью пипетки на O1 пластины. Инкубируйте клетки в течение 15 мин при комнатной температуре.
    17. Вымойте третий immunopanning пластину (O4 пластины). Эта пластина является позитивной селекции пластины, где OPCs связать его поверхность. Вымойте O4 тарелку с DPBS для 3x.
    18. После инкубации на второй immunopanning пластины, передать клеток до конечного immunopanning пластины (пластины) О4, инкубировать клетки в течение 45 мин при комнатной температуре. Этот шаг будет выбрать O4 + OPCs.
    19. Аспирируйте супернатант из последнего immunopanning пластины (O4 пластины) и промойте пластину с EBSS для 6х.
    20. Чтобы удалить OPCs от пластины, инкубировать клетки с 5 мл теплого 0,05% трипсин-ЭДТА разводили 1:10 в EBSS при 37 ° С в течение 8 мин.
    21. Добавляют 5 мл 30% FBS (сделано в EBSS) для нейтрализации трипсина. Удалить клетки с поверхности пластины с помощью пипетки в течение примерно 50 раз.
    22. Перенесите все клеткиСуспензию в новую пробирку и центрифугируют в течение 15 мин при 200 х г.
    23. Удалите супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 1 мл предварительно нагретой САТО медиа с последующим подсчетом клеток. Вскрытие один мозг может дать 1,5-2 млн OPCs.
    24. Пластина клеток на сухих пластин, покрытых PDL при плотности между 1 х 10 5 и 5 × 10 5 на 10 см пластины с в средах САТО (10 мл), содержащие цилиарного нейротрофического фактора (CNTF, 10 нг / мл), тромбоцитарный фактор роста (PDGF, 10 нг / мл,), нейротрофина 3 (NT3, 1 нг / мл), и форсколин (4,2 мкг / мл) 2,12. Культура OPCs при 37 ° С, 8% СО 2.

    6. преобразующие OPCs

    1. Культура первичные OPCs в САТО сред (10 мл / 10 см пластины) с CNTF (10 нг / мл), PDGF (10 нг / мл), NT3 (1 нг / мл), и форсколином (4,2 мкг / мл) при 37 ° С, 8% СО 2 в течение 24 ч после вскрытия.
    2. Полностью аспирации и выключение OPC питательных сред, кормить клетки с свежеприготовленной SATO СМИ (10 мл) С факторами роста (см выше в пункте 6.1).
    3. Добавить вируса к OPCs в оптимальной концентрации, определенной стадии 3 (фиг 2, стадия 4), культура OPCs еще в течение 48 ч.

    7. OPC заполнение для Myelinating сокультурах (рис 2, пункты 5 и 6)

    1. Чтобы удалить OPCs от поверхности, Вначале промыть OPC пластины с 8 мл EBSS дважды, затем инкубировать клетки с 5 мл теплой 0,05% трипсина-EDTA разбавляют 1:10 EBSS при 37 ° С в течение 2 мин.
    2. Нейтрализовать трипсина с 30% FBS в EBSS (5 мл) и удаления ячеек из пластины с помощью пипетки. Передача клеточной суспензии в 15 мл пробирку, центрифугируют при 180 х г в течение 15 мин при комнатной температуре.
    3. Отберите у супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 1 мл подогретого SATO СМИ с последующим подсчетом клеток.
    4. До OPC посева, полностью аспирации СМИ от DRG культуры пластины. Аккуратно семян 200000 OPCs каплям на ГВС нейронов, как описано выше 4-6.
      ПРИМЕЧАНИЕ:Общий объем ОРС посева должна быть меньше 200 мкл на 22 мм покровным.
    5. Оставить клеток, чтобы без перемещения пластины в течение 10 мин в капот культуры ткани, затем осторожно долить 1 мл подогретого SATO среды на лунку.
    6. Replate оставшиеся сестры OPCs с SATO СМИ с факторами роста (см шаг 6,1). Используйте эти сестра OPCs проверить экспрессию белка интереса.
    7. После 24 часов, замените СМИ SATO с со-культуральной среды (2 мл / лунку), содержащие SATO СМИ (без факторы) и Neurobasal (v / v) с 1% B27. Поддерживать совместные культуры в течение 14 дней с изменением среды каждые 2-3 дня.
    8. Оценка совместного культивировани миелин для экспрессии белка с помощью Вестерн-блот-анализа и визуализации для формирования миелиновых аксонов сегментов, дважды иммунного окрашивания с антителами против миелинового основного белка маркеров и нейрональных маркеров 4-6.

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Результаты

    Флаг-меченый внеклеточного сигнала, связанных киназы 1 (Флаг-Erk1) используются в качестве конструкции для производства лентивирусов проверяется ферментом рестрикции переварить из конструкций, используемых, в том числе оба 2K7 конструкции и упаковки и вспомогательных конструкций, необходимых для производства вирусов (фигура 3) ,

    figure-results-1
    Рисунок 3: конструкция ДНК...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Обсуждение

    Миелинизации аксонов важный процесс для оптимального функционирования как центральных, так и периферической нервной системы позвоночных. Производство и техническое обслуживание миелиновых аксонов является сложным и скоординированный процесс с участием молекулярных взаимодействий между нейронов, глиальных (от шванновских клеток или олигодендроциты) и внеклеточного матрикса белков. Значение и применимость этого протокола является то, что она позволяет манипулировать белков в одном конкретном типе клеток в смешанных устано...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Раскрытие информации

    Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в отношении данного исследования.

    Благодарности

    Эта работа была поддержана Австралийским национальным советом по здравоохранению и медицинским исследованиям (стипендия NHMRC #454330 для JX, грант на проект #628761 для SM и APP1058647 для JX), Исследование рассеянного склероза в Австралии (MSRA #12070 для JX), Схема поддержки исследовательских грантов Мельбурнского университета и Мельбурнская исследовательская стипендия CI для JX, а также стипендии для аспирантов Австралии для HP и AF. Мы хотели бы выразить признательность за схему операционной инфраструктуры Департамент инноваций, промышленности и регионального развития, Виктория, Австралия.

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Материалы

    Список материалов, использованных в этой статье
    ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
    2K7 лентивектор Добрый подарок от доктора Suter9
    5-Fluoro-2′-дезоксиуридинSigma-AldrichF0503-100mg
    Alexa Fluor 488 Козий антимышиный IgGJackson Immunoresearch115545205
    Alexa Fluor 488 козий анти-кроличья IgG (H+L)Life TechnologiesA11008
    Alexa Fluor 594 козий анти-мышиный IgG (H+L)Life ТехнологииA11005
    Alexa Fluor 594 козий антикролик IgG (H+L)Life TechnologiesA11012
    АмпициллинSigma-AldrichA9518-5G
    B27 - NeuroCul SM1 Нейрональная добавкаТехнологии стволовых клеток 5711
    BDNF (человек)PeprotechPT450021000
    биотин (d-биотин)Sigma AldrichB4639
    Bradford ReagentSigma AldrichB6916-500ML   
    BSASigma AldrichA4161
    ХлорамфениколSigma-AldrichC0378-100G
    CNTFPeprotech450-13020
    DAKO флуоресцентный монтажный материалDAKOS302380-2
    DMEM, высокий уровень глюкозы, пируват, без глутаминаLife Technologies10313039
    DNaseSigma-AldrichD5025-375KU
    DPBSLife Technologies14190250
    DPBS, кальций, магнийLife Technologies14040182
    EBSSLife Technologies14155063
    EcoRI-HFNEBR3101
    Входные векторы для промотора и интересующегоГенерация по протоколам 1-2
    Фетальная бычья сывороткаSigma-Aldrich12003C
    Forskolin Sigma AldrichF6886-50MG
    Глюкоза (D-глюкоза)Sigma-AldrichG7528
    GlycerolChem SupplyGL010-500MСмотреть исходные решения
    Goat Anti-mouse IgGJackson ImmunoResearch115005003
    Goat Anti-mouse IgM Jackson ImmunoResearch115005020
    козий антикрысиный IgGJackson ImmunoResearch112005167
    Hoechst 33342Life TechnologiesH3570
    IgepalSigma AldrichI3021-100ML 
    Инсулин Сигма ОлдричI6634 
    КанамицинСигма-Олдрич60615
    ЛамининLife Technologies23017015
    LB MediumСм. стоковые решения
    LB-AgarСм. стоковые решения
    L-цистеинSigma-AldrichC-7477
    Leibovitz's L-15 MediumLife Technologies11415064
    L-глутаматSigma-AldrichG1626
    L-глютамин- 200 мМ (100x) LiquidLife Technologies25030081
    LR Clonase II Plus ферментLife Technologies12538-120
    MEM, NEAA, без глютаминаLife Technologies10370088
    мыши α β III Тубулин Мышь PromegaG7121
    & MBP (моноклональный)MilliporeMAB381
    Na pyruvate Life Technologies11360-070
    NACSigma AldrichA8199
    NcoI-HFNEBR3193S
    NEBuffer 4NEBB7004S
    Нейробазальная средаLife Technologies21103049
    NGF (мышь)Alomone LabsN-100
    NT-3Peprotech  450-03
    Антитело O1 - Мышиный анти-O1MilliporeMAB344Альтернатива, если клетки гибридомы O1 недоступны
    гибридомы O1Кондиционированная среда, содержащая антитело против O1 для использования для иммунопанирования
    антитела O4 - мышиный анти-O4MilliporeMAB345Альтернатива, если клетки гибридомы O4 недоступны
    O4 гибридомные клеткиКондиционированная среда, содержащая антитела против O4, для использования для иммунотерапии
    компетентных клетокLife TechnologiesA10460
    One Shot Stbl компетентных клетокLife TechnologiesC7373-03
    Суспензия папаинаWorthington/CooperLS003126
    pBR8.91Добрый подарок от доктора Denham10
    PDGF-AA (Человек)PeprotechPT10013A500   
    Пенициллин-стрептомицин 100х растворLife Technologies15140122
    pENTRY4IRES2GFPInvitrogen11818-010 
    pMD2.GAddgene12259
    Poly-D-лизинSigmaP6407-5MG
    Полиэтиленимин (PEI) Sigma-Aldrich408727-100ML
    Поли-Л-орнитинСигма Олдрич P3655
    Прогестерон Sigma AldrichP8783
    Таблетка ингибитора протеазы (Полный мини)Roche11836153001
    Proteinase KВ комплекте фермент клоназа
    PutrescineSigma AldrichP-5780
    Кролик и альфа-нейрофиламентMilliporeAB1987   
    Кролик & альфа; MBP (поликлональный)MilliporeAB980
    Ran2 гибридомные клеткиATCCTIB-119Кондиционированная среда, содержащая антитела против Ran2 для использования для иммунотерапии
    Антитело крысы против CD140A/PDGFRaBD Pharmingen558774
    SacIINEBR0157
    SOC средаПоставляется с компетентными бактериями
    Селенит натрия Sigma AldrichS5261
    spe INEBR0133S
    T4 ДНК-лигазаNEBM0202S
    T4 ДНК-лигаза буферNEBB0202S
    TE буфер pH8Смотрите стоковые растворы
    TNE лизис буфер
    Микроэлементы BCellgro 99-175-CI
    Трансферрин (апо-трансферрин человека)Sigma-AldrichT1147
    Triton X-100Sigma-AldrichT9284 
    Ингибитор трипсинаSigma-AldrichT9201-1G
    белка куриного яйцаRoche10109878001
    Trypsin-EDTA (1x), феноловый красный (0.05%)Life Technologies25300-054
    Неконъюгированный лектин Griffonia simplicifolia BSL-1Vector laboratories L-1100
    УридинСигма-ОлдричU3003-5G
    гена Клетки из

    Ссылки

    1. Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiol Rev. 81 (2), 871-927 (2001).
    2. Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system. Neuron. 60 (4), 555-569 (2008).
    3. Lee, K., et al. MDGAs interact selectively with neuroligin-2 but not other neuroligins to regulate inhibitory synapse development. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (1), 336-341 (2013).
    4. Xiao, J., et al. BDNF exerts contrasting effects on peripheral myelination of NGF-dependent and BDNF-dependent DRG neurons. J Neurosci. 29 (13), 4016-4022 (2009).
    5. Chan, J. R., et al. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).
    6. Xiao, J., et al. Brain-Derived Neurotrophic Factor Promotes Central Nervous System Myelination via a Direct Effect upon Oligodendrocytes. Neurosignals. 18 (3), 186-202 (2010).
    7. Lundgaard, I., et al. Neuregulin and BDNF induce a switch to NMDA receptor-dependent myelination by oligodendrocytes. PLoS Biology. 11 (12), e1001743(2013).
    8. Kleitman, N., W, P. M., Bunge, R. P. Tissue culture methodes for the study of myelination. , MIT Press. Cambridge, MA. (1991).
    9. Xiao, J., et al. Extracellular signal-regulated kinase 1/2 signaling promotes oligodendrocyte myelination in vitro. J Neurochem. 122 (6), 1167-1180 (2012).
    10. Wong, A. W., Xiao, J., Kemper, D., Kilpatrick, T. J., Murray, S. S. Oligodendroglial expression of TrkB independently regulates myelination and progenitor cell proliferation. The Journal of Neuroscience. 33 (11), 4947-4957 (2013).
    11. Li, Z., et al. Molecular cloning, Characterization and Expression of miR-15a-3p and miR-15b-3p in Dairy Cattle. Molecular and Cellular Probes. , (2014).
    12. Emery, B., et al. Myelin gene regulatory factor is a critical transcriptional regulator required for CNS myelination. Cell. 138 (1), 172-185 (2009).
    13. Murai, K., et al. Nuclear receptor TLX stimulates hippocampal neurogenesis and enhances learning and memory in a transgenic mouse model. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (25), 9115-9120 (2014).

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Перепечатки и разрешения

    Теги

    in vitroGFP
    Производство и использование Лентивирус, чтобы выборочно преобразовывать Первичная олигодендроцитов клеток-предшественников для In Vitro миелинизации Анализы
    Свяжитесь с нами
    Рекомендовать библиотеке

    Конфиденциальность

    Условия эксплуатации

    Политика

    Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.