Method Article

Моделирование слизистой оболочки кандидоз мальков данио рерио по плавательного пузыря инъекций

DOI:

10.3791/52182

⸱

November 27th, 2014

 ,  , 
1Department of Molecular and Biomedical Sciences, University of Maine, 2Graduate School of Biomedical Sciences and Engineering, University of Maine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vivo пространственно-временные взаимодействия патогена и иммунной защиты на уровне слизистой оболочки не так легко визуализировать у существующих позвоночных хозяев. Представленный здесь метод описывает универсальную платформу для изучения кандидоза слизистой оболочки у живых позвоночных с использованием плавательного пузыря молоди рыбок данио в качестве места инфекции.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В начале защита от слизистой оболочки патогенных микроорганизмов состоит как из эпителиальной барьера и врожденных иммунных клеток. Immunocompetency обоих, и их взаимосвязь, имеют первостепенное значение для защиты от инфекций. Взаимодействия эпителиальных и врожденных иммунных клеток с патогеном лучше всего исследованы в естественных условиях, где сложное поведение разворачивается во времени и пространстве. Тем не менее, существующие модели не позволяют легко пространственно-временной визуализации битве с патогенами на уровне слизистой оболочки.

Модель, разработанная здесь создает слизистой инфекции путем прямой инъекции грибкового возбудителя, Candida Albicans, в плавательного пузыря несовершеннолетних рыбок данио. В результате инфекции позволяет с высоким разрешением изображений эпителиальной и врожденного поведения иммунных клеток в течение развития заболевания слизистой оболочки. Универсальность этого метода позволяет на допрос хозяина, чтобы исследовать подробно последовательность иммунных событий, ведущих к телagocyte набор и изучить роль отдельных типов клеток и молекулярных путей в защите. Кроме того, поведение патогена в зависимости от иммунной атаки могут быть отображены одновременно с помощью флуоресцентного белка, экспрессирующих С Albicans. Увеличение пространственного разрешения взаимодействия хозяин-патоген также возможно с помощью описанной метод быстрого плавательный пузырь рассечение.

Слизистой инфекция модель, описанная здесь, проста и легко воспроизводимым, что делает его ценным инструментом для изучения слизистой кандидоза. Эта система может быть также широко переводимые в другие слизистые патогенов, таких как микобактерий, бактериальных или вирусных микробов, которые обычно инфицируют через эпителиальные поверхности.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Инфекции слизистых оболочек могут привести к опасным для жизни инфекциям кровотока из-за повреждения эпителиального барьера, который позволяет патогенам получить доступ к системной среде1,2. Кроме того, инфекции слизистых оболочек также могут вызывать значительную иммунопатологию даже при наружной локализации3-5. Комменсальный одноклеточный гриб Candida albicans присутствует у большинства населения в полости рта и других участках слизистой оболочки6-9. Несмотря на то, что врожденные иммунные дефекты и медицинские вмешательства обычно сдерживаются врожденными и адаптивными иммунными реакциями, они могут привести к тяжелому кандидозу слизистой оболочки. Воздействие на эпителиальный барьер приводит к повышенному риску угрожающего жизни диссеминированного заболевания, а также иммунопатологии, как в случае вульвовагинального кандидоза, кроме того, колонизация C. albicans была связана с иммунным гомеостазом легких10,11. Диссеминированный кандидоз в настоящее время является четвертой по распространенности инфекцией кровотока в отделениях интенсивной терапииNo12, и смертность до 40% делает его серьезной проблемой. В связи с увеличением числа иммуномодулирующих методов лечения пациентов с аутоиммунными заболеваниями, раком или трансплантацией органов, крайне важно понимать взаимодействие между этим патогеном и иммунным компартментом слизистой оболочки.

Большинство достижений клеточной биологии, касающихся взаимодействия C. albicans и клеток на уровне слизистой оболочки, происходят из моделей in vitro13-15 и мышиных моделей16-18. Оба эти подхода имеют явные преимущества, но возможность визуализации живых клеток с высоким разрешением в интактном хозяине ограничила временную и пространственную характеристику инфекции. Для проведения этих исследований существует потребность в модели in vivo, в которой взаимодействие патогенных, врожденных иммунных и эпителиальных клеток может быть визуализировано в интактном позвоночном организме-хозяине.

Рыбка данио-рерио стала бесценным инструментом для понимания человеческих болезней, в основном благодаря своей прозрачности и податливости к генетическим манипуляциям. Развитие клеток и органов было изучено с мельчайшими деталями, что привело к описанию новых моделей поведения иммунных клеток, таких как поведение Т-клеток в развивающемся тимусе19 или битва между внутриклеточными микобактериями и фагоцитами20-22. В недавней работе описаны взаимодействия кишечных микробов и хозяина у рыбок данио и показано, что микробная колонизация кишечного тракта влияет на физиологию кишечника хозяина и устойчивость к другим инфекциям23,24. Кроме того, инфекция через эпителий кишечника была описана для нескольких патогенов.

В отличие от кишечного тракта, плавательный пузырь представляет собой более изолированную и дополняющую модель слизистой оболочки. Этот орган является продолжением развивающейся кишечной трубки и формируется спереди от печени и поджелудочной железы25,26. Он вырабатывает поверхностно-активное вещество, слизь и антимикробные пептиды27,28 и анатомически, а также онтогенетически этот орган считается гомологом легких млекопитающих29,30. Поскольку пневматический канал остается соединенным с кишечником у рыбок данио, это позволяет инфекции при погружении произойти естественным образом. Примечательно, что единственными известными естественными инфекциями рыб видами Candida являются инфекции C. albicans в плавательном пузыре31. Недавно мы описали экспериментальную модель иммерсионной инфекции, в которой C. albicans инфицирует плавательный пузырь, и обнаружили, что эта инфекция повторяет некоторые признаки взаимодействия C. albicans с эпителием in vitro32,33.

В представленном здесь методе оригинальная модель иммерсионной инфекции улучшена путем прямого введения C. albicans в плавательный пузырь рыбок данио-рерио через 4 дня после оплодотворения (dpf). Это позволяет точно контролировать инфекцию во времени, а также получать высоковоспроизводимый инокулюм. Это позволяет получать детальную прижизненную визуализацию в сочетании с универсальностью модели рыбки данио. В качестве примера того, что можно сделать с помощью этого метода, мы представляем пространственно-временную динамику роста C. albicans вместе с привлечением нейтрофилов к месту инфекции. Поскольку ткань плавательного пузыря рыбок данио сложно визуализировать в естественных условиях, мы также представляем метод быстрой диссекции плавательного пузыря, который улучшает сигнал флуоресценции и микроскопическое разрешение. Эти методы расширяют набор инструментов для грибковых, иммунологических и аквакультурных исследований, а также для описания нового пути заражения, который может быть использован для моделирования других грибковых, бактериальных или вирусных инфекций поверхностей слизистых оболочек.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Все протоколы и эксперименты данио помощи были выполнены в соответствии с NIH руководящих принципов по Уходу за животными и использованию комитета (IACUC) Протокол A2012-11-03.

1. Данио рерио Разведение до 4 дней после оплодотворения

  1. Сбор AB данио, или любые другие трансгенных линий, в течение первых 3 ч после оплодотворения, как показано в другом видео 34.
  2. Инкубируют 120 яиц в 15 см чашки Петри, содержащие 150 мл E3 средств массовой информации (5 мМ NaCl; 0,17 мМ KCl; 0,33 мМ CaCl 2; 0,33 мМ MgCl 2, 2 мМ HEPES; рН 6,8) с метиленовым синим (0,3 мкг / мл конечная Концентрация) в 33 ° C инкубаторе с 12/12 свет / темнота фотопериода.
  3. Заменить СМИ после 6 ч с E3 + ПТУ (1-фенил-2-тиомочевины, 10 мкг / мл конечной концентрации) и удалить мертвые яйца.
  4. Выдержите в течение 4 дней при 33 ° С, обмениваясь СМИ со свежими E3 + ПТУ после 2 дней.

2. Впроекция Micro-иглы Подготовка

  1. Потяните боросиликатного капилляра (OD 1,2 мм; ID 0,69 мм) в микро-иглы с помощью иглы съемник со следующими параметрами (550 тепла; 0 Потяните; 130 скорость; 110 раз).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти параметры будут отличаться в зависимости от нити к нити накала, чтобы получить подобную форму микро-иглы (рисунок 1) и должны быть скорректированы, когда установлен новый накаливания.
  2. Заполните микро-иглы с 3 мкл 0,4 мкм фильтруется фосфатного буфера солевым раствором (PBS; 137 мМ NaCl; 2,7 мМ KCl; 10 мМ Na 2 HPO 4, 1,8 мМ KH 2 PO 4, рН 7,4) с использованием 20 мкл пипетки microloader Подсказка.
  3. Настройка микро-иглы на держателе микропипетки на микроманипулятора подключена к системе впрыска под давлением. Установите давление впрыска до 30 МПа, а продолжительность импульса на 30 мс.
  4. Использование чашку Петри с дистиллированной водой, снизить микро-иглы до 1/5 иглы не находится в воде. Клип микро-иглы Wiго мелкие пинцет чуть ниже уровня воды. Принесите микро-иглы из воды и нажмите педаль несколько раз, пока не появится болюса.
  5. Измерьте диаметр болюса путем снижения микро-иглы на гемоцитометра слоистой одной каплей типа погружения масла. Регулировка длительности импульса для получения нужного объема (таблица 1).
  6. Установка противодавление на болюса оставаться стабильными в масле (понизить давление если увеличивает объем болюса и увеличить противодавление, если объем болюса уменьшение). Запишите длительность импульса для каждого микро-иглы.
  7. Снимите PBS с микро-иглы путем аспирации его с помощью пипетки microloader и изгнать левой над PBS, поместив его на форсунки и листать непрерывный переключатель импульса. Забронируйте каждый микро-иглы.

3. Candida Подготовка

  1. Подряд Candida Albicans превращается с кодон-оптимизированный dTomato, GFP, BFP, EOS или далекоКрасный из замороженного запаса (-80 ° С запас в 25% глицерин) с помощью стерильного деревянный дюбель на дрожжи peptine декстрозы (YPD) агаром (10 г / л дрожжевого экстракта, 20 г / л пептона, 20 г / л декстрозы , 20 г / л агара, в автоклаве и выливают в 25 мл в чашки Петри) и инкубируют в течение ночи при 30 ° С.
  2. Выбор одной колонии с помощью стерильной деревянный дюбель и инокуляции до 5 мл YPD жидкости (10 г / л дрожжевого экстракта, 20 г / л пептона, 20 г / л декстрозы, в автоклаве и асептически аликвоты в 5 мл в 16 х 150 мм стекл культуры трубы).
  3. Инкубируют в течение ночи при 30 ° С в валец при 60 оборотах в минуту.
  4. Соберите 1 мл C. Albicans культура и передачи в 1,7 мл стерильную центрифужную пробирку.
  5. Центрифуга на 5000 мкг в течение нескольких секунд. Слейте супернатант и добавить 1 мл стерильной PBS, вихря тщательно. Повторите это дважды.
  6. Граф колоний, используя гемоцитометра путем разбавления 1 мл бульона 1: 1000 в стерильной PBS.

4. инъекционных данио рерио вПлавательный пузырь

  1. Теплый инъекций блюдо (2% агарозном) в течение 30 мин в 33 ° C инкубаторе.
  2. В нужное время, удалить 100 из 150 мл E3 + ПТУ из 15 см чашки Петри, содержащую рыб, чтобы ввести с помощью 25 мл пипетки без аспирации любой данио.
  3. Обезболить 4 DPF рыбок данио, добавив 2 мл 4 мг / мл Буферизованные Tricaine метансульфоната складе (TR) к 50 мл среды остальные (конечная концентрация 200 мкг / мл) и подождите в течение 15 мин.
  4. Под микроскопом рассекает, выберите рыбу с завышенной плавательного пузыря. Рыба также может быть показан на то время для однородной фенотипа, таких как распределение нейтрофилов в МРО: GFP линии с помощью эпифлуоресцентной рассекает микроскопа.
  5. Развести С Albicans складе от своей первоначальной концентрации (шаг 3,8) до 1,5 × 10 7 колониеобразующих единиц на мл (КОЕ / мл) в PBS.
  6. Трансфер 30 данио на инжекторный чашки с помощью пластиковых передачи трубыTTE и удалить излишки средства массовой информации.
  7. Использование рыболовные проволоки инструмент (0,012 дюйма диаметр лески супер-склеиваются в боросиликатного капилляра), сделайте 3 линии 10 рыб, удерживая впрыска блюдо вертикально и ориентироваться рыбу вертикально.
  8. Удалить излишки средств массовой информации.
  9. Тщательно вихрь трубки с 1,5 х 10 7 КОЕ / мл C. Albicans.
  10. Наполните одну микро-иглы с 3 мкл C. Albicans, используя новый наконечник microloader пипетки и установить длительность импульса на соответствующую настройку (см шаг 2,9).
  11. Поверните инъекции блюдо, чтобы сделать угол 20 ° между микро-иглы и головы рыбы, стремясь к задней части плавательного пузыря (рис 3а).
  12. Нажмите микро-иглы в плавательного пузыря, убедившись, что отверстие иглы в просвете, и нажмите на педаль.
  13. Повторите для каждой рыбы и передать в послеоперационную блюдо (25 мл E3 + ПТУ) от наводнения блюдо с E3 вd опорожнения в аварийный блюдо.
  14. Перевести еще 30 рыбу впрыска блюдо.
  15. Повторите инъекции с новой микро-иглы, наполненный тщательно перемешивали C. Albicans.
  16. Отделка путем введения контроля PBS, в случае необходимости, с использованием другого инъекции тарелку, чтобы избежать загрязнения и передачи в отдельную посуду восстановления (этап 4.10).

5. Скрининг Рыба для Желаемые инокулята

  1. Подготовка 40 мл 0,4% низкой расплава раствор агарозы (LMA), добавив 160 мг низкой расплава агарозы в 40 мл Е3, кипения от микроволновой печи до полного растворения и охлаждения до 37 ° С. Добавить 400 мкл TR (конечная концентрация 200 мкг / мл) один раз охлажденным.
  2. После 30 мин восстановления, анестезию рыб, как описано (шаг 4,3 с использованием только 1 мл TR в 25 мл Е3 + ПТУ, конечная концентрация 200 мкг / мл).
  3. Передача 30 рыба (с минимальным СМИ, как это возможно) до 2 мл LMA в весовой лодке.
  4. Отберите индивидуальный рыба с пипетки и пластины рыбы с 1 капли LMA в визуализации 96-луночного планшета, используя только центральные скважин 10 х 6.
  5. Повторите, пока все рыбы на экран не будут загружены в изображений пластины.
  6. Пусть носитель затвердевают при комнатной температуре в течение 5 мин.
  7. Расположите рыбу на их стороне, убедившись, что они находятся в контакте с прозрачным дном.
  8. Использование цели 20X на перевернутом эпифлуоресцентной / конфокальной микроскопии и соответствующий фильтр, запишите номер С. альбиканс дрожжевые клетки в плавательного пузыря каждой рыбы-х годов.
  9. Выбор рыбы с 15-25 дрожжевых клеток в плавательного пузыря (или желаемого посевной материал), эвтаназии невыбранные рыбы (800 мкг / мл TR в Е3) и возврата выбранный рыбу глубокой чашке Петри с 50 мл Е3 + ПТУ по добавив 3 капли E3 на изображения плит выбранных скважин и отсасывание рыбу с пластиковой пипетки.
  10. Инкубировать при 33 ° С в течение требуемой продолжительности.

6. Визуализация Рыба Post-скрининг

  1. В нужное время, удалить 25 из 50 мл E3 + ПТУ СМИ из глубокой чашке Петри, содержащую рыб к изображению.
  2. Анестезировать рыбу, как описано (шаг 4,3 с использованием только 1 мл TR в 25 мл Е3 + ПТУ остальные, конечная концентрация 200 мкг / мл).
  3. Пластина рыбу в 96-луночного планшета изображений и положения соответствующим образом (шаги 5,3 - 5,7).
  4. Изображение на сканирующей конфокальной микроскопии, используя соответствующие лазеры и фильтры выбросов. Сначала сфокусируйтесь на рыбу, используя цели 4X под дифференциальный интерференционный контраст (DIC) и получать изображения интересующей области, используя цели 20X с конфокальной лазеров в режиме сканирования с 2 скорости мкс / пиксель и 1024 х 600 пикселей соотношением. Приобретать Z-стеки с размером шага 1 мкм, применяя режим фильтра Калмана из 3 кадров.
  5. Вернуться в глубокое блюдо Петри с 50 мл Е3 + ПТУ или в individuaл скважины (блюдо культуры 24-а, 3 мл E3 + ПТУ) и инкубировать при 33 ° C.

7. Пройдя плавательного пузыря

  1. Заполните 10 мл шприц с высокой вакуумной смазки.
  2. Приготовьте 2% LMA (шаг 5,3 с 160 мг низкой температурой плавления агарозы в 8 мл E3).
  3. В нужное время, анестезию рыбу (шаг 5,2).
  4. Передача 10 рыб в 1,7 мл центрифужную пробирку с 1 мл Е3 и эвтаназии путем добавления 200 мкл 4 мг / мл Tricaine (конечная концентрация 800 мкг / мл) в центрифужную пробирку и инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре.
  5. Подготовка предметное стекло визуализации путем размещения 4 капли вакуумной смазки в квадрат, 1 см друг от друга на microslide (75 х 25 мм, на рисунке 2).
  6. Поместите 2 капли 2% LMA в центре площади.
  7. Поместите одну рыбу на отдельном стекле под микроскопом рассекает и убедитесь, что сердце перестало биться, удалить лишнюю воду.
    8. Использование тонких пинцетом рассекают плавательный пузырь, поддерживая голову в фиксированном положении с левой пинцетом и тянет вниз переднюю кишку с правом пинцет (рис 4а).
  8. Возьмите плавательный пузырь пневматическим канала с левой пинцетом, отделяя его от желудочно-кишечного тракта, и поместите его в центре 2% LMA, прежде чем он затвердевает.
  9. Место крышку скольжения (18 х 18 мм) на верхней части изображения стекло и вставьте его, пока он не коснется вакуумной смазки, а также LMA (рисунок 2).
  10. Изображение течение 10 мин вскрытия, как описано в стадии 6,4. Повторите шаг 7,7 - 7,11 с другой рыбой.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микроинъекция в задней плавательного пузыря

Экспериментальный метод, представленный здесь описывает введение постоянной дозы С. альбиканс дрожжевые клетки в плавательного пузыря из 4 DPF рыбок данио. Предыдущая работа с моделью погружения предполагает, что плавательный пузырь иммунный ответ на С. Albicans аналогична млекопитающих кандидоза слизистой оболочки 32. Здесь мы показываем, модифицированный метод инфекция, которая более проста, воспроизводимым и быстрым; не...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Достижения и ограничения микроинъекции модели болезни плавательного пузыря

Модель, представленная здесь расширение слизистой кандидоза погружения модели, описанной в Gratacap и др (2013).; он добавляет преимущества управляемой времени инфекция, высоко воспроизводимую дозу инфекции, и, следовательно, повышение эффективности. Мы демонстрируем здесь новые методы, которые позволяют неинвазивного временной документации динамики заражения в мельчайших подробностях, а также с большим разрешен...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят доктора Ле Трин и д-р Тобин щедро предоставляя α-катенин: линии цитрин рыбы и Билл Джекман за предоставленную нам возможность сделать съемку в своей лаборатории. Авторы признают, источники финансирования Национальные институты здоровья (гранты 5P20RR016463, 8P20GM103423 и R15AI094406) и USDA (Проект № ME0-H-1-00517-13). Эта рукопись опубликована в качестве основного сельского и лесного хозяйства эксперимента публикации Номер станции 3371.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Пробирки 1,7 млAxygenMCT-175-C
Глубокие чашки ПетриFisher Scientific89107-632
Трансферные пипеткиFisher Scientific13-711-7M
Экстракт дрожжейVWR Scientific90000-726
ПептонVWR Scientific90000-264
ДекстрозаFisher ScientificD16-1
АгарVWR Scientific90000-760
Тонкий пинцет (Dumont Dumoxel #5)Fine Science Tools11251-30
Деревянные дюбелиVWR Scientific10805-018
Низкоплавкий агарозныйVWR Scientific12001-722
Flaming Brown микропипеткаSutter InstrumentsP-97
Боросиликатные капиллярныеинструменты СаттераBF120-69-10
Система впрыска MPPI-3Прикладные научные приборыMPPI-3
Установка обратного давленияПрикладные научные приборыBPU
Комплект держателей микропипетокПрикладные научные приборыMPIP
Ножной переключательПрикладные научные Контрольно-измерительные приборыFSW
МикроманипуляторПрикладные научные приборыMM33
Магнитная базаПрикладная научная аппаратураМагнитная основа
Трикаин метансульфонатWestern Chemical Inc.MS-222
Препарирующий микроскопOlympusSZ61 top SZX-ILLB2-100 база
Конфокальный микроскопOlympusIX-81 с лазерной сканирующей конфокальной системой
20X объектив микроскопаOlympusUPlanSApo 20x/0.75
Роликовый барабанNew Brunswick ScientificTC-7
Микрозагрузчик наконечники дляпипетокСтеклянные
(16 x 150 мм)VWR Scientific60825-435
NaClVWR ScientificBDH4534-500GP
KClVWR ScientificBDH4532-500GP
MgSO4VWR ScientificBDH0246-500GP
HEPES (Corning)VWR ScientificBDH4520-500GP
Детская глина (Play-Doh)Hasbro
CaCl2Fisher ScientificC69-500
Метиленовый синийVWR ScientificVW6276-0
PTU SigmaP7629-10G Чашки
ПетриFisher ScientificFB0875712
Гемоцитометр ( Hausser scientific)VWR Scientific15170-172
Тип A Иммерсионное маслоBlue Marble Products51935
ЦентрифугаEppendorf5424
Vortex GenieVWR Scientific14216-184
Agarose (Lonza)VWR Scientific12001-870
Na2HPO4 Fisher ScientificS374-500
KH2PO4Fisher ScientificP285-500
Ловильная проволокаStren
96 луночная пластина для визуализации (Sensoplate)Greiner Bio-One655892
высоковакуумная смазка (Dow Corning)VWR Scientific59344-055
Микрослайд (25 x 75 мм)VWR Scientific48300-025
Защитные стекла (18 x 18 мм), No 1,5VWR Scientific48366-045
Чашка Петри 15 см (пластики Olympus)Genesee Scientific32-106
Глицерин (химикаты EMD)VWR ScientificEMGX0185-5
24-луночная чашка для культивирования (пластики Olympus)Genesee Scientific25-107
Вес катеров (8,9 см)VWR Scientific89106-766
FV-1000 пробирки для культивирования Eppendorf 930001007

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (3), 141-153 (2014).
  2. Elinav, E., Henao-Mejia, J., Flavell, R. A. Integrative inflammasome activity in the regulation of intestinal mucosal immune responses. Mucosal Immunol. 6 (1), 4-13 (2013).
  3. Sansonetti, P. J. To be or not to be a pathogen: that is the mucosally relevant question. Mucosal Immunol. 4 (1), 8-14 (2011).
  4. Tlaskalová-Hogenová, H., Stěpánková, R., et al. The role of gut microbiota (commensal bacteria) and the mucosal barrier in the pathogenesis of inflammatory and autoimmune diseases and cancer: contribution of germ-free and gnotobiotic animal models of human diseases. Cell Mol Immunol. 8 (2), 110-120 (2011).
  5. Pasparakis, M. Regulation of tissue homeostasis by NF-kappaB signalling: implications for inflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 9 (11), 778-788 (2009).
  6. Scully, C., el-Kabir, M., Samaranayake, L. P. Candida and oral candidosis: a review. Crit Rev Oral Biol Med. 5 (2), 125-157 (1994).
  7. Reef, S. E., Lasker, B. A., et al. Nonperinatal nosocomial transmission of Candida albicans in a neonatal intensive care unit: prospective study. J Clin Microbiol. 36 (5), 1255-1259 (1998).
  8. Soll, D. R., Galask, R., Schmid, J., Hanna, C., Mac, K., Morrow, B. Genetic dissimilarity of commensal strains of Candida spp. carried in different anatomical locations of the same healthy women. J Clin Microbiol. 29 (8), (1991).
  9. Rindum, J. L., Stenderup, A., Holmstrup, P. Identification of Candida albicans types related to healthy and pathological oral mucosa. J Oral Pathol Med. 23 (9), 406-412 (1994).
  10. Mear, J. B., Gosset, P., et al. Candida albicans airway exposure primes the lung innate immune response against Pseudomonas aeruginosa infection through innate lymphoid cell recruitment and IL-22 associated mucosal response. Infect Immun. 82 (1), 306-315 (2013).
  11. Faro-Trindade, I., Willment, J. A., et al. Characterisation of innate fungal recognition in the lung. PLoS ONE. 7 (4), 35675(2012).
  12. Wisplinghoff, H., Bischoff, T., Tallent, S. M., Seifert, H., Wenzel, R. P., Edmond, M. B. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clin Infect Dis. 39 (3), 309-317 (2004).
  13. Schaller, M., Zakikhany, K., Naglik, J. R., Weindl, G., Hube, B. Models of oral and vaginal candidiasis based on in vitro reconstituted human epithelia. Nat Protoc. 1 (6), 2767-2773 (2006).
  14. Weindl, G., Naglik, J. R., et al. Human epithelial cells establish direct antifungal defense through TLR4-mediated signaling. Clin Invest. 117 (12), 3664-3672 (2007).
  15. Moyes, D. L., Runglall, M., et al. A biphasic innate immune MAPK response discriminates between the yeast and hyphal forms of Candida albicans in epithelial cells. Cell Host and Microbe. 8 (3), 225-235 (2010).
  16. Conti, H. R., Shen, F., et al. Th17 cells and IL-17 receptor signaling are essential for mucosal host defense against oral candidiasis. J Exp Med. 206 (2), 299-311 (2009).
  17. Hise, A. G., Tomalka, J., et al. An essential role for the NLRP3 inflammasome in host defense against the human fungal pathogen Candida albicans. Cell Host Microbe. 5 (5), 487-497 (2009).
  18. Gladiator, A. A., Wangler, N. N., Trautwein-Weidner, K. K., Leibundgut-Landmann, S. S. Cutting Edge: IL-17-Secreting Innate Lymphoid Cells Are Essential for Host Defense against Fungal Infection. J Immunol. 190 (2), 521-525 (2013).
  19. Hess, I., Boehm, T. Intravital imaging of thymopoiesis reveals dynamic lympho-epithelial interactions. Immunity. 36 (2), 298-309 (2012).
  20. Roca, F. J., Ramakrishnan, L. TNF Dually Mediates Resistance and Susceptibility to Mycobacteria via Mitochondrial Reactive Oxygen Species. Cell. 153 (3), 521-534 (2013).
  21. Tobin, D. M., Vary, J. C., et al. The lta4h locus modulates susceptibility to mycobacterial infection in zebrafish and humans. Cell. 140 (5), 717-730 (2010).
  22. Cambier, C. J., Takaki, K. K., et al. Mycobacteria manipulate macrophage recruitment through coordinated use of membrane lipids. Nature. 505 (7482), 218-222 (2014).
  23. Semova, I., Carten, J. D., et al. Microbiota regulate intestinal absorption and metabolism of fatty acids in the zebrafish. Cell Host and Microbe. 12 (3), 277-288 (2012).
  24. Rendueles, O., Ferrières, L., et al. A new zebrafish model of Oro-intestinal pathogen colonization reveals a key role for adhesion in protection by probiotic bacteria. PLoS Pathog. 8 (7), 1002815(2012).
  25. Field, H., Ober, E., Roeser, T., Stainier, D. Formation of the digestive system in zebrafish I. Liver morphogenesis. Dev Biol. 253 (2), 279-290 (2003).
  26. Field, H., Dong, P., Beis, D., Stainier, D. Formation of the digestive system in zebrafish. Dev Biol. 261 (1), 197-208 (2003).
  27. Sullivan, L., Daniels, C., Phillips, I., Orgeig, S., Whitsett, J. Conservation of surfactant protein A: evidence for a single origin for vertebrate pulmonary surfactant. J Mol Evol. 46 (2), 131-138 (1998).
  28. Oehlers, S. H., Flores, M. V., Chen, T., Hall, C. J., Crosier, K. E., Crosier, P. S. Topographical distribution of antimicrobial genes in the zebrafish intestine. Dev Comp Immunol. 35 (3), 385-391 (2011).
  29. Winata, C., Korzh, S., Kondrychyn, I., Zheng, W., Korzh, V., Gong, Z. Development of zebrafish swimbladder: The requirement of Hedgehog signaling in specification and organization of the three tissue layers. Dev Biol. 331 (2), 22-236 (2009).
  30. Zheng, W., Wang, Z., Collins, J. E., Andrews, R. M., Stemple, D., Gong, Z. Comparative transcriptome analyses indicate molecular homology of zebrafish swimbladder and mammalian lung. PLoS ONE. 6 (8), 24019(2011).
  31. Galuppi, R., Fioravanti, M., Delgado, M., Quaglio, F., Caffara, M., Tampieri, M. Segnalazione di due casi do micosi della vescica natatoria in Sparus aurata e Carrassius auratus. Bollettino Societa Italiana di Patologic. 32, 26-34 (2001).
  32. Gratacap, R. L., Rawls, J. F., Wheeler, R. T. Mucosal candidiasis elicits NF-κB activation, proinflammatory gene expression and localized neutrophilia in zebrafish. Dis Model Mech. 6 (5), 1260-1270 (2013).
  33. Brothers, K. M., Gratacap, R. L., Barker, S. E., Newman, Z. R., Norum, A., Wheeler, R. T. NADPH oxidase-driven phagocyte recruitment controls Candida albicans filamentous growth and prevents mortality. PLoS Pathog. 9 (10), (2013).
  34. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), (2009).
  35. Anaissie, E. J., Bodey, G. P. Fungal infections in patients with cancer. Pharmacotherapy. 10 (6 pt 3), 1648-1698 (1990).
  36. Fidel, P. L., Barousse, M., et al. An intravaginal live Candida challenge in humans leads to new hypotheses for the immunopathogenesis of vulvovaginal candidiasis. Infect Immun. 72 (5), 2939-2946 (2004).
  37. Akova, M., Akalin, H. E., et al. Efficacy of fluconazole in the treatment of upper gastrointestinal candidiasis in neutropenic patients with cancer: factors influencing the outcome. Clin Infect Dis. 18 (3), 298-304 (1994).
  38. Farah, C. S., Elahi, S., et al. T cells augment monocyte and neutrophil function in host resistance against oropharyngeal candidiasis. Infect Immun. 69 (10), 6110-6118 (2001).
  39. Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  40. Kanther, M., Sun, X., et al. Microbial Colonization Induces Dynamic Temporal and Spatial Patterns of NF-κB Activation in the Zebrafish Digestive Tract. Gastroenterology. 141 (1), 197-207 (2011).
  41. Trinh, L. A., Hochgreb, T., et al. A versatile gene trap to visualize and interrogate the function of the vertebrate proteome. Genes Dev. 25 (21), 2306-2320 (2011).
  42. Trinh, L. A., Fraser, S. E., Moens, C. B. Zebrafish Neural Tube Morphogenesis Requires Scribble-Dependent Oriented Cell Divisions. Curr Biol. 21 (1), 79-86 (2011).
  43. Oehlers, S. H. B., Flores, M. V., et al. Expression of zebrafish cxcl8 (interleukin-8) and its receptors during development and in response to immune stimulation. Dev Comp Immunol. 34 (3), 352-359 (2010).
  44. Bast, D. J., Yue, M., et al. Novel murine model of pneumococcal pneumonia: use of temperature as a measure of disease severity to compare the efficacies of moxifloxacin and levofloxacin. Antimicrob Agents Chemother. 48 (9), 3343-3348 (2004).
  45. Davis, J., Clay, H., Lewis, J., Ghori, N., Herbomel, P., Ramakrishnan, L. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
  46. Pack, M., Solnica-Krezel, L., et al. Mutations affecting development of zebrafish digestive organs. Development. 123, 321-328 (1996).
  47. Le Guyader, D., Redd, M. J., et al. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111 (1), 132-141 (2008).
  48. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  49. Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238 (12), 2975-3015 (2009).
  50. Noverr, M. C., Huffnagle, G. B. Does the microbiota regulate immune responses outside the gut. Trends in Microbiology. 12 (12), 562-568 (2004).
  51. Huffnagle, G. B. The microbiota and allergies/asthma. PLoS Pathog. 6 (5), 1000549(2010).
  52. Kim, Y. -G., Udayanga, K. G. S., Totsuka, N., Weinberg, J. B., Núñez, G., Shibuya, A. Gut dysbiosis promotes M2 macrophage polarization and allergic airway inflammation via fungi-induced PGE2. Cell Host Microbe. 15 (1), 95-102 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mucosal CandidiasisZebrafish ModelSwimbladder InjectionCandida AlbicansConfocal MicroscopyNeutrophil RecruitmentHost Pathogen InteractionFluorescent ProteinSwimbladder DissectionJuvenile Zebrafish

Related Articles