Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Обнаружение гликогена в мононуклеарных клеток периферической крови с йодной кислотой Шиффа окрашивания

21.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52199

⸱

23 декабря 2014 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Centre for Structural and Functional Genomics, PERFORM Centre, Concordia University, 2Department of Chemistry and Biochemistry, Centre for Structural and Functional Genomics, PERFORM Centre, Concordia University, 3Department of Exercise Science, Centre for Structural and Functional Genomics, PERFORM Centre, Concordia University

В этой статье

Краткое содержание

Периодическое кислотное окрашивание по Шиффу - это метод, который визуализирует содержание полисахаридов в тканях. В данной статье представлен протокол периодического кислотного окрашивания по методу Шиффа, адаптированный для использования на мононуклеарных клетках периферической крови, очищенных из венозной крови человека. Такие образцы обогащены лимфоцитами и другими лейкоцитами иммунной системы.

Аннотация

Периодическое кислотное окрашивание по шкале Шиффа (PAS) — это иммуногистохимический метод, используемый при биопсии мышц и в качестве диагностического инструмента для образцов крови. Полисахариды, такие как гликоген, гликопротеины и гликолипиды, окрашивают ярко-пурпурный цвет, что облегчает перечисление положительных и отрицательных клеток в ткани. В мышечных клетках окрашивание PAS используется для определения содержания гликогена в различных типах мышечных клеток, в то время как в образцах клеток крови окрашивание PAS было исследовано в качестве диагностического инструмента для различных состояний. Кровь содержит долю белых кровяных телец, которые относятся к иммунной системе. Представление о том, что клетки иммунной системы обладают гликогеном и используют его в качестве источника энергии, широко не исследовано. В данной статье мы описываем адаптированный вариант протокола окрашивания PAS, который может быть применен к мононуклеарным иммунным клеткам периферической крови из венозной крови человека. Наблюдались мелкие клетки с PAS-положительными гранулами и более крупные клетки с диффузным окрашиванием PAS. Обработка образцов амилазой аннулирует эти закономерности, подтверждая специфичность пятна. Альтернативная методика, основанная на ферментативном расщеплении, подтвердила наличие и количество гликогена в образцах. Этот протокол полезен для гематологов или иммунологов, изучающих содержание полисахаридов в лимфоцитах крови.

Введение

Шиффа (PAS) окрашивание периодического кислота иммуногистохимическое метод, который широко используется в исследованиях мышц и диагностики. Он также используется в качестве диагностического инструмента на образцах крови. Методика работы с применением раствор периодной кислоты в образце, который окисляет единиц в создании полисахаридных альдегидных групп, которые вступают в реакцию с реагентом бесцветным Шиффа в результате чего получают глубокий пурпурный продукт. Этапы этой процедуры показаны на рисунке 1. Пятно превращается ничего с полисахаридами пурпурного, в том числе гликогена, гликопротеинов, гликолипидов, муцинов или других молекул с полисахаридных фрагментов.

ПАС окрашивание часто используется для определения уровня гликогена в мышечных волокнах. Разделы Мышцы ткани идеально подходят для техники, поскольку они прочно прикрепить к слайду и выдержать многочисленные стирки и окрашивания шаги. Гликоген является самым присутствуют в быстро сокращающиеся Тип II мышечные волокна, которые имеют высокий спросдля быстрого производства АТФ, требующей гликогена для максимального 1,2 производительности. Гликоген представляет собой разветвленный полимер глюкозы, который может быть разбит на свободной глюкозы под действием ферментов гликогенфосфорилазы. Во время отдыха и питательной-достаточности, гликоген пополняется в процессе гликогенеза, в то время как во время питательной недостаточности или высоких энергий спроса; гликоген распадается на глюкозу гликогенолиза. Уже с изучили 1950-х годов клиницисты ученые PAS окрашивания образцов крови для анализа содержания гликогена в различных заболеваний 3-7. Например, в Помпа болезней-добросовестного гликогена болезням лейкоциты накапливать большие количества гликогена, что существенно отличается от здоровых 8.

Это видео-статья демонстрирует адаптированную версию окрашивания PAS для использования на мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) образцов из венозной крови здоровых людей. PBMCs в основном содержат лимфоцитов Т-лимфоцит и семей лимфоцитов B, а также других иммунных клеток, таких как естественных клеток-киллеров и моноцитов. Первый этап очистки удаляет эритроциты, нейтрофилы, гранулоциты и другие. Этот метод позволяет получать данные о концентрированной доли лимфоцитов, позволяющих более надежной подсчета PAS-положительных клеток в сравнении с использованием целых мазки крови.

figure-introduction-1
Рисунок 1:. Шаг за шагом методологии PAS окрашивания на РВМС () Во-первых, изоляция РВМС достигается за счет фиколл градиента, левая панель показывает подготовку перед центрифугированием, правая панель показывает его после центрифугирования, где Баффи пальто, содержащий РВМС наблюдается в центре трубки. (B), выделенные РВМС закреплены на слайде с помощью формалина-этанол фиксирующие Солуния. Ползун осторожно промывают дистиллированной водой из пластиковой бутылки для стирки. (С) слайд помещают в 100 мл химический стакан на полпути, заполненной раствором амилазы, которые будут растворяться гликогена. Ползун осторожно промывали. (D) скольжения обрабатывают раствором йодной кислотой, где окисление происходит сахаридов. Слайды мягко промыть; это будет удалить избыток периодический кислоту и остановить стадию окисления. (е) если реагент Шиффа добавляют к слайдам, он будет реагировать с альдегидами, созданных в ходе стадии окисления. Это бесцветное реагента будет приводить к темно-красного пурпурного продукта. Слайды осторожно промывают, чтобы удалить избыток реагента Шиффа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Исследования с образцами крови человека была одобрена в университете Конкордия этики наблюдательного совета, номер сертификата 10000618. Работа на мышцы мыши было одобрено Университет Конкордия этики наблюдательного совета, номер сертификата 2010BERG.

1. РВМС изоляции из цельной крови

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте эту процедуру в биозащитой с использованием стерильной техники и производитель стерилизовать оборудование.

  1. Осторожно залить 10-15 мл цельной крови из гепаринизированной (антикоагулянт) для сбора крови труб в 50 мл стерильные конические пробирки. При незначительных разливов крови, протрите DDh 2 O и 70% этанола при помощи чистящего ткани.
  2. Развести крови в конической трубе в соотношении 1: 1 с фосфатным буфером физиологический раствор (PBS 1X), рН 7,4. Убедитесь, что Максимальный общий объем не превышает 30 мл.
  3. Осторожно перемешать с помощью серологических пипеток пистолет, избегая пузырьков.
    Примечание: Не перемешать переворачивая пробирку, чтобы избежать кровиccumulation в кепке и последующей фильтрации во время центрифугирования.
  4. Добавить 13 мл Ficoll-Пак (см Материалы и настольные принадлежности), к новому конической трубе 50 мл мощности. Держите трубку вертикально в стойку.
  5. Использование передачи пипетки, принимают разбавленной крови, сенсорный наконечник пипетки к внутренней стенке трубы в верхней. При медленном и устойчивом давлении, передавать кровь вдоль внутренней стенки трубы, образующей слой крови в верхней части слоя сахарозы. Сделать этот шаг несколько раз, пока вся кровь не была передана.
  6. Закройте пробирку крышкой плотно и центрифуги трубки при комнатной температуре в течение 30 мин при 700 мкг в качели ротора с множеством среднего ускорения до 5, и замедление устанавливается в ноль.
  7. Медленно извлеките трубку и, не нарушая слои, принять его обратно в кабинет биологической безопасности.
  8. Осторожно собрать Баффи пальто (тонкий облачно белый слой), где МНПК расположены, расположенный между PBS / плазменнойй фиколл слои с помощью пипетки передачи. Избегайте сбора сахарозы слой и не беспокоить слой красных клеток крови.
  9. Передача поглощающее покрытие в новый 50 мл стерильные конические пробирки. Это может занять несколько раз повторяющихся шаг 1,8, чтобы собрать все РВМС.
  10. Добавить PBS рН 7,4 в трубке с РВМС и заполнить до отметки 45 мл. Встряхнуть пробирку тщательно. Не вихрь.
  11. Промыть 1: Центрифуга течение 15 мин при 480 мкг как с максимальным ускорением и замедлением, установленного до 9. Заметим, формирование гранул из РВМС в нижней части конической трубки.
  12. Отменить PBS (надосадочную) в пластиковый стакан с 10 мл отбеливателя.
  13. Ослабить осадок клеток осторожно "ломают" против волнообразной поверхности (например, пустой стойке). Не вихрь.
  14. Добавить 25 мл свежего PBS рН 7,4 в трубе. Если более чем одна трубка обрабатывается, бассейн гранул вместе в этом шаге.
  15. Вымойте 2: центрифуги трубку в течение 12 мин при 480 мкг в Wiго как максимальное ускорение и замедление набор до 9.
  16. Откажитесь от PBS (надосадочную) в пластиковом стакане со всплеском отбеливателя.
  17. Осторожно "стойку" против волнообразной поверхности (например, пустой стойке). Не вихрь.
  18. Добавить 25 мл свежего PBS на пробирку.
    1. Выньте 50 мкл клеток и передачи в микроцентрифужных трубки для подсчета жизнеспособности.
    2. Добавить равное количество (50 мкл) трипанового синего (жизнеспособность пятен) и пипетки вверх и вниз, чтобы аккуратно перемешать.
  19. Выньте 10 мкл и перенести его на гемоцитометре, чтобы проверить жизнеспособность клеток на мл. Запишите количество клеток / мл.
  20. Вынуть желаемое количество клеток и центрифуги трубки в течение 12 мин при 480 х г и с максимальным ускорением и замедлением, установленным в 9.
  21. Откажитесь от PBS (надосадочную) в стакан с отбеливателем.
  22. Осторожно "стойку" против волнообразной поверхности (например, пустой стойке). Добавить 80 мкл PBS в трубку.

2. Создание РВМС слайд

  1. Поместите 80 мкл клеток на предметное стекло микроскопа. Намажьте падение с помощью другого слайда или поместить 2 капли 40 мкл каждого на обоих концах слайда.
  2. Оставьте слайд в кабинете биологической безопасности для просушки. Этикетка слайд с карандашом на матовом стороны.

3. Крепление образцов на слайдах

  1. Подготовка Фиксирующий раствор путем смешивания 0,5 мл 37% формальдегида в 4,5 мл 99% -ного этанола.
  2. После того, как слайды сушат, вынуть 2 мл свежеприготовленного фиксатора раствора и вылейте его на слайде, чтобы вся поверхность слайда покрыта.
  3. Оставьте раствор на слайде в течение 1 мин. Промыть слайд в течение 1 мин с водопроводной водой и оставить высохнуть на воздухе.

4. Создание Амилаза решение для отрицательного контроля

  1. Возьмем 0,25 г порошка амилазы и растворяют в 50 мл дизамер воды. Налейте раствор в чистую 100 мл химический стакан.
  2. Погрузите слайд в химический стакан, так что половина слайда получает лечение, а другая половина не лечить, а затем инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре (рис 1С).
  3. Запишите, на какой стороне слайда получающего лечение амилазы. Нарисуйте линию на задней части слайда с указанием границы между лечения и контроля.
  4. Вымойте слайды с DDh 2 O, чтобы удалить амилазы решение и оставить слайд высохнуть на воздухе.

5. Выполните йодной кислотой Шифф (PAS) окрашивания и визуализации

ПРИМЕЧАНИЕ: PAS реагенты являются токсичными при вдыхании и вызывают коррозию, поэтому шаги должны быть сделаны в химическом вытяжном шкафу, и отходы должны быть надлежащим образом утилизированы в соответствии с ведомственным руководящим принципам.

  1. Поместите слайд на плоской поверхности и льют 1,50-2,00 мл раствора кислоты Периодической на образце. Incubaте в течение 5 мин при комнатной температуре.
  2. Промыть слайдов в нескольких зарядов дистиллированной воды.
  3. Налейте 1,50-2,00 мл реагента Шиффа на предметное стекло и инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин.
  4. Вымойте слайд с дистиллированной водой в течение 5 мин и оставить высохнуть на воздухе.
  5. Применить 10 мкл крепления СМИ на слайде и накрыть двумя маленькими покровные, или применить 50 мкл и использовать одну большую покровное.
  6. Применить ясный лак для ногтей по краям покровного стекла, просушить в течение ночи.

6. Получение изображений с бинокулярного оптического микроскопа, используя объективные 100X

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для проверки реагентов и основную технику, окрашивание PAS было выполнено в соответствии с инструкциями изготовителя по разделам мышечных мыши камбаловидной. Окрашивание было сделано в тот же день в жертву и на последнем этапе окрашивания, срезы фиксированной ксилолом. Камбаловидной мышцы, как известно, содержат ~ 35% гликогена-положительных клеток 9. Окрашенные клетки мышц отображается два различных PAS-положительных гранул Особенности- точечные внутри клетки, а сплошная линия демаркации клеточной мембраны <...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Критические шаги этого видео статьи были во время стирки и амилазы обработки клеток. При промывке слайды, ключевым шагом было с помощью пластиковой податливый стиральная бутылку и вода мягко запустить через образец на слайде и не стремимся непосредственно на образцах. Даже малейшее прямое давление воды может вызвать клетки оторваться от слайда. Другим ключевым шагом было использовать тот же слайд для ± условиях амилазы. После того, как РВМС прикреплен к слайд, слайд был осторожно помещают в химический стакан так что тол...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано грантом от программы NSERC Discovery номер гранта RGPIN 418522-2013. Мы благодарим Р. Килгура за полезные дискуссии, а также Кателин Грести и д-ра А. Бергдала за предоставленные разделы мышечных мышц.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Набор для периодидно-Шиффовой реакцииfigure-materials-1 Sigma-Aldrich395BПеред использованием довести до комнатной температуры. Материалы в данном наборе токсичны и опасны. Соблюдайте осторожность.
α-амилаза из поджелудочной железы свиньиfigure-materials-2 Sigma-AldrichA3176
Бинокулярный микроскопCarl Zeiss MicroscopyAxio Lab A0
Набор для анализа гликогенаfigure-materials-3 Sigma-AldrichMAK016
Ficoll-Paque PLUSfigure-materials-4 VWR, GE Healthcare17-1440-02Неионогенный синтетический полимер сахарозы.
ЦентрифугаДля выделения PBMC использовали ротор с поворотными стаканами.

Ссылки

  1. Rich, P. R. The molecular machinery of keilin's respiratory chain. Biochem. Soc. Trans. 31 (Pt 6), 1095-1105 (2003).
  2. Peter, J. B., Barnard, R. J., Edgerton, V. R., Gillespie, C. A., Stempel, K. E. Metabolic profiles of three fiber types of skeletal muscle in guinea pigs and rabbits). Biochemistry. 11 (14), 2627-2633 (1972).
  3. Jones, R. V., Goffi, G. P., Hutt, M. S. R. Lymphocyte glycogen content in various disease. J. Clin. Pathol. 15 (1), 36-39 (1962).
  4. Scott, R. B. Glycogen in human peripheral blood leukocytes. I. characteristics of the synthesis and turnover of glycogen in vitro. J. Clin. Invest. 47 (2), 344-352 (1968).
  5. Fedele, D., et al. positive index of lymphocytes and metabolic control in insulin-treated and type II diabetes mellitus. Diabete Metab. 9 (3), 188-192 (1983).
  6. Brelińska-Peczalska, R., Mackiewicz, S. Cytochemical studies of peripheral blood granulocytes and lymphocytes in patients with systemic lupus erythematosus. Pol.Med.Sci.Hist.Bull. 15 (2), 231-234 (1976).
  7. Yunis, A. A., Arimura, G. K. Enzymes of glycogen metabolism in white blood cells. I. glycogen phosphorylase in normal and leukemic human leukocytes. Cancer, Res. 24, 489-492 (1964).
  8. Hagemans, M. L., et al. PAS-positive lymphocyte vacuoles can be used as diagnostic screening test for pompe disease. J. Inherit. Metab. Dis. 33 (2), 133-139 (2010).
  9. Totsuka, Y., et al. Physical performance and soleus muscle fiber composition in wild-derived and laboratory inbred mouse strains. 95 (2), 720-727 (2003).
  10. Murat, J. C., Serfaty, A. Simple enzymatic determination of polysaccharide (glycogen) content of animal tissues. Clin. Chem. 20 (12), 1576-1577 (1974).
  11. Arrizabalaga, O., Lacerda, H. M., Zubiaga, A. M., Zugaza, J. L. Rac1 protein regulates glycogen phosphorylase activation and controls interleukin (IL)-2-dependent T cell proliferation. J. Biol. Chem. 287 (15), 11878-11890 (2012).
  12. Pelletier, J., G, J., Mazure, N. M. Biochemical titration of glycogen in vitro. J.Vis.Exp. (81), (2013).
  13. Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D. Tagliabracci V.S. Glycogen and its metabolism: Some new developments and old themes. Biochem.J. 441 (3), 763-787 (2012).
  14. Salmoral, E. M., Tolmasky, D. S., Krisman, C. R. Evidence for the presence of glycogen in rat thymus. Cell Mol.Biol. 36 (2), 163-174 (1990).
  15. Darlington, P. J., et al. Diminished Th17 (not Th1) responses underlie multiple sclerosis disease abrogation after hematopoietic stem cell transplantation. Ann.Neurol. 73 (3), 341-354 (2013).
  16. Multiple Sclerosis International Federation Atlas of MS. , Available from: http://www.atlasofms.org (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Обнаружение гликогена в мононуклеарных клеток периферической крови с йодной кислотой Шиффа окрашивания
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.