Удаленная конечностей Ишемическая Предварительная: Нейропротекторное Техника в Грызуны

Summary

Удаленный ишемического прекондиционирования (RIP) является методом кондиционирования тканей от повреждающего стресса. Мы создали метод дистанционного ишемии в задней конечности, с помощью раздувания манжеты сфигмоманометра в течение 5-10 мин. Нейрозащитные возможности RIP были продемонстрированы на модели дегенерации сетчатки у грызунов.

Abstract

Сублетальная ишемии защищает ткани от последующих, более тяжелой ишемии через повышающей регуляции эндогенных механизмов в пораженной ткани. Сублетальная ишемии также было показано, активируют защитные механизмы в отдаленных тканей. Короткий период ишемии (5-10 мин) в задней конечности млекопитающих вызывает самозащиты ответов в мозге, легких, сердца и сетчатки. Эффект известен как удаленный ишемической предварительной (RIP). Это терапевтически перспективным способом защиты жизненно важные органы, и уже в клинических испытаниях для сердца и травмы головного мозга. Эта публикация показывает, контролируемый минимально инвазивной способ изготовления конечность - в частности заднюю конечность крысы - ишемический. Кровяного давления манжеты разработаны для использования в человеческих новорожденных подключен к ручной сфигмоманометра и используется для применения 160 мм рт.ст. давление вокруг верхней части задней конечности. Зонд предназначен для обнаружения температуры кожи используется для проверки ischemi, путем записи падение температуры кожи, вызванного давлением, вызванной закупоркой артерий голени и повышение температуры, которое следует высвобождение манжеты. Этот метод RIP обеспечивает защиту в сетчатке крыс от яркого света и повреждений, вызванных дегенерацией.

Introduction

Выживание наиболее, возможно, все, ткани в условиях метаболического стресса может быть улучшена путем предварительного кондиционирования с периодом ишемии сублетальных ^1,2. Ишемического прекондиционирования (ИП) с практической точки зрения является воздействие на ткани сублетальных ишемии, перед опытом ткани более тяжелые стрессоров, таких как последующего ишемического инсульта. В моделях животных, IP-обеспечивает поразительное защиту головного мозга, сетчатки, сердца и легких ^3-6. Соответственно, наблюдения пациентов, перенесших инсульт в показали связь между предыдущими транзиторных ишемических атак и более клинических исходов ^7,8. ИС также защищает от фоторецепторов сетчатки неишемических травм ^9.

Эффективность ИС в различных тканях и травм показывает, что он активации врожденного механизма выживания клеток присутствует во всех тканях. Ишемического прекондиционирования миокарда было предложено иметь защитный эффект позитивной регуляции черезиз индуцируемого гипоксией фактор (HIF), как известно, регулируют множество метаболических путей через выпуск аденозина или через отверстие митохондриальных АТФ калиевых каналов ^10,11. Аденозин и АТФ-релиз калиевые каналы участвуют в церебральной ишемии, но, расследования Нейрозащитные механизмов ишемического кондиционирования на сегодняшний день были сосредоточены на модификации анти-Эксайтотоксичность, антиапоптотических и анти-воспалительных путей ^12,13. В целом, понимание молекулярной ишемической процесса кондиционирования для защиты нейронов ограничена.

Удаленные ишемические попытки предварительной подготовки, чтобы обусловить отдаленные критически важные органы (сердце, головной мозг, легкие) от генерации ишемии менее важных тканей. Удаленный ишемического прекондиционирования (RIP) с помощью задних конечностей была продемонстрирована нейропротекторное в моделях грызунов инсульта ^14-17. Метод, описанный нами обеспечивает простой, надежный и неинвазивный протocol для индукции RIP.

Подавляющее большинство протоколов RIP включать заднюю конечность, по-видимому, потому что бедренная артерия расположена в верхней задней конечности могут быть легко идентифицированы и доступны для хирургического зажима и использования жгута. В инвазивные конечностей ишемических исследований по изучению мозга и защиты кожи, ишемию индуцируют путем разделения бедренную артерию от паха связок и зажима бедренную артерию ^2,15,18.

Ишемия в результате либо конечности наручников или бедренной артерии зажима была подтверждена изменений на конечности, включая потерю импульса, снижение оксигенации и снижение температуры кожи. Удаленная ишемия может быть подтверждено потери пульса с помощью лазерной доплеровской или Ультразвуковые ^17-19. Температура кожи может быть использован в качестве альтернативы доплеровского хотя отношения является нелинейным ^20,21. Точные температурные записи являются обычным явлением в лабораториях и банкибыть легко включены в отдаленных ишемических исследований.

Альтернативой бедренной зажима хирургию индукции ишемии с использованием жгут. Турникет приложение производит сопоставимое ишемии, что достигается с судна зажима; Kutchner др. по сравнению инвазивной бедренную артерию зажима для неинвазивного жгута и нашел оба метода остановился поток крови к конечности и снижение повреждения кожи в пластической хирургии модели кожного лоскута ишемии ^18. Наручников либо ногу или руку и повышения давления манжеты до выше систолического артериального давления было установлено, защищает от ишемического повреждения у свиней и людей ^17,19,22.

Различные подходы к жгут индукции дистанционного ишемическая включают в себя использование манжеты кровяного давления или резинкой ^17,22,23. Тем не менее, использование резинке, чтобы вызвать ишемию является небезопасным методом, потенциально порождая нерегулируемого количества давления вконечностей, с повышением давления выше 500 мм рт.ст. записывается в людях ^24. Кроме того, ишемия конечности с помощью резинку приводит к повреждению мышц у крыс после удаления полосы ^23, как оценивается Эванс синий краситель, с маркером в естественных условиях мышечное волокно проницаемости ^25. В противоположность этому, поставка регулируемым давлением до жгута может быть достигнуто с помощью кровяного давления манжеты, соединенный с сфигмоманометра ^17,19,22,26.

В этом исследовании, легкая модель травмы дегенерации фоторецептора был использован, чтобы продемонстрировать нейропротекторный эффективность дистанционного ишемической предварительной. Удаленная ишемия была вызвана непосредственно перед легкой травмы, и предотвратить последующее дегенерацию фоторецепторов, что подтверждается сетчатки функции тестирования. Сопровождающие видео демонстрации применения неинвазивного дистанционного ишемии.

Protocol

Заявление по этике: протокол следующим рекомендациям по уходу животное Университета Сиднея, AEC # 5657. Анестезия была одобрена комитетом по этике животных (Университет Сиднея, AEC # 5657).

1. Оборудование Подготовка

1. Используйте отслеживание температуры кожи в режиме реального времени. Включите компьютер, и аппаратные средства сбора данных.
2. Открыть температура программное обеспечение для записи и регулировать настройки температуры до 30-35 ° С и частоту дискретизации до 100 мс каждые.
3. Дополнительно: Вставьте ректального термометра, чтобы обеспечить внутреннюю температуру остается стабильным при температуре 37,5 ° С.

2. Калибровка вручную Сфигмоманометр

1. Подключите новорожденных манжету sphygmomanometer.Use в размер 2 манжеты для 250-550 г крысы. Адаптер может быть необходимо подключить трубки манжеты к сфигмоманометра.
2. Выпустите манжету либо ослабления воздушный клапан или отсоединением трубки манжеты из адаптироватьсяили. Убедитесь в отсутствии давления остается в трубке и манометр игла упирается в ноль внутри овала / прямоугольника.
3. Проверьте давление между насосно-компрессорных труб, манометром и манжеты. Манжету с нежными насосов инфляции лампы, пока не читает 100 мм рт.ст. на манометр. Убедитесь, что давление остается постоянным. Выпустите манжету, медленно открывая значение выпуска воздуха.

3. Подготовка животных

Примечание: животные, которые пройти света травмы требуют адаптации темный ночью дистанционного ишемии. Животные, подвергающиеся ущерб света требуют темно воспитанию (12 ч свет: темно цикл (5 лк))

1. Выполните дистанционного ишемии либо активных или обезболивание грызунов. Убедитесь, что у животных есть здоровый тонус мышц. Убедитесь в этом, зажимая верхнюю заднюю конечность, чтобы подтвердить имеется достаточно присутствовать мышцы. RIP-индуцированной защита от легкого вреда был протестирован в оседлых крыс до 6-месячного возраста.
2. Обезболивание подготовка к RIP
   1. Вводят крыс путем внутрибрюшинной инъекции 60 мг / кг кетамина и 5 мг / кг ксилазина. Проверьте глубину анестезии, расширяя ногу и щипать кожу на нижней части ноги. Животное не имеет рефлекс, если он глубоко обезболивание. Применить искусственные слезы, чтобы избежать сухости роговицы в то время под наркозом.
   2. Поместите крыс либо на площадку тепла или оборотной воды нагреватель трубы для поддержания постоянной температуры тела 37,5 ° С. Расположите крысу в положении лежа с ног колодки нижних конечностей вверх. Либо правой или левой конечности может пройти дистанционное ишемии.
3. Пробудитесь подготовка к RIP
   Примечание: Пробудитесь эксперименты на животных требуется два человека. Один человек сдерживает животное и второй человек работает ручной сфигмоманометром. Экспериментаторы должны быть уверены, чтобы выполнить процедуру, как сдержанность увеличивает риск травмы обработчиков. Крысы, подвергающиеся ишемии дистанционного должны быть выдержаны тО Руководство сдержанность. В зависимости от интуитивных принципов эксплуатации сдержанность должна быть прогресса от 30 сек до максимум 5 мин в течение ряда недель. Робкие животные, которые не акклиматизироваться к ручному ограничений должны быть исключены из активного экспериментирования. Наконец, руководство сдержанность может вызвать стресс (и, возможно, ввести смешивает в исследовании) к животным и фиктивный когорту (размещение манжеты без воспаления) должны быть использованы, чтобы точно интерпретировать результаты RIP исследования.
   1. Вырезать полотенце в 15 см х 30-50 см кусок и поместить короткий край перпендикулярно к позвоночнику крысы, покрывая голову, чтобы в верхней части задних конечностей.
   2. Заправьте короткий край под туловище крысы плотно и начать обернуть крысы с оставшимся длинного края полотенце. Закрепите завернутый животное под рукой в ​​положении лежа на спине. Если крыса проходит под левую руку, правую конечность свободно крысы из полотенца.

4. Применение Ое температуры кожи зонда

1. Продлить ногу крысы, который должен пройти ишемии и поместить зонд кожи на подушечку. Поместите зонд кожи, чтобы максимизировать контакт между датчиком температуры и кожи. Плотно вставьте щуп в подушечку лапы и прикрепить датчик с бумажной лентой.
2. Проверьте размещение зонда кожи путем отслеживания температуры на программное обеспечение для записи температуры. Убедитесь, что температура кожи между 30-34 ° С и остается стабильной. Отслеживание температуры кожи в течение 1-2 мин. Регулировка зонда кожи, если температура является нестабильным или ниже 30 ° С.

5. Дистанционное ишемии

1. Выпустите манжету и обеспечить клапан давления воздуха закрыт. Продлить ногу и свободно облегать манжету на верхней задней конечности. Используйте указательный и большой палец, чтобы продлить ногу и нижние цифры, чтобы освободившуюся манжету в положении.
2. Поднять давление в манжете в обезболивание животного до 160 мм рт.ст., а у бодрствующих животных растет в ценеаза давления манжеты до 180 мм рт.
   Примечание: обезболивание кровяное давление у крыс колеблется от 120-140 мм рт.ст. и поднимается до 160 мм рт когда в сознании. Начать таймера и температуры ног записи сразу правильное давление достигается.
   Примечание: температура нога должна упасть на 2 ° С, после 5 мин постоянном давлении.
3. Поддерживать позицию выше животного "колена" на протяжении ишемии манжеты. Давление в манжете начнет падать после нескольких минут, или если конечности крысы движется.
4. Неоднократно насос для накачивания лампу в виде коротких пакетов, чтобы поддерживать требуемое давление в манжете повторяющийся короткий всплеск накачки
5. Удаленный ишемии могут быть доставлены непрерывно в течение от 5 до 15 мин. Протокол ишемии реперфузии включает 2 периода 5 мин ишемии с промежуточным 5 мин реперфузии.
6. Выпустите давление в манжете, ослабив клапан давления воздуха. Проверка изменения температуры в течение ишемии протокол. Отпустите манжету.
7. Продолжайте травмы экспериментов. Животные под действием анестезии должны быть помещены на площадку тепла. Продолжайте следить животных, пока амбулаторно. Животные не могут быть возвращены в корпусе до тех пор, ходьбе.

6. Свет Травмы - дегенерация сетчатки Модель

1. Темно-адаптировать животных в течение ночи (12-15 ч),. Сразу же после дистанционного кондиционирования ишемии или фиктивный дистанционного ишемии (животное) сдержанность место животных в плексигласа жилья с пищей и водой.
2. Включите флуоресцентного освещения (1000 лк), расположенного выше плексигласа жилья в 9 часов утра в течение 24 часов. После воздействия света, вернуть животных, чтобы затемнить циклического освещения в течение 7 дней.

7. После удаленные процедуры ишемии

1. Оценка Видение с электроретинограммы (ЭРГ):
   Примечание: ЭРГ настройки и протокол флэш последующим Brandli и камень ^26.
   1. Темно-адаптировать животных в течение ночи (12-15 ч). Подяркость красного освещения анестезию животных путем внутрибрюшинной инъекции кетамина и ксилазина (60 мг / кг и 5 мг / кг, соответственно). Расширением зрачка (атропина сульфат 1,0%), роговицы анестетик (proxymetacaine 0,5%).
   2. Применение роговицы гидратации (карбомер полимер) глазные капли немедленно роговицы. Применить гель для глаз на 20-минутные интервалы для поддержания роговицы гидратации.
   3. Нарисуйте свободно привязанную нить вокруг глазного яблока, чтобы помочь стабильные записи ЭРГ. Монитор температуры с помощью ректального зонда и поддерживать температуру тела животного на 37-37.5 ° C.
   4. Расположите голову внутри Ganzfeld интегрирующей сферы.
      Примечание: Ganzfeld является полностью программируемым световой раздражитель, который обеспечивает единые ничуть мигает с светодиодов в глаза.
   5. Запишите электроретинограммы используя заказные 4 мм платины положительный электрод слегка касаясь роговицы и 2 мм диаметром Ag / AgCl электрода осадок, вставленный в рот. Ссылка оба электрода с иглой из нержавеющей сталивставляется подкожно в крупу.
   6. Запись сигналов с настройкой полосовой из 0.3-1,000 Гц (-3 дБ), уровень сбора 2 кГц (AD инструментов). После стабильной записи ЭРГ установлено субъекту животное к 10 мин темновой адаптации перед началом записи.
   7. Следуйте протокол флэш, как описано ранее Brandli и камень ^26.
      1. Программирование длительности вспышки (мы использовали мигает 1-2 мсек длительности), и установите его интенсивность в -4.4 до 2.0 Журнал шотландец cd.sm ^-2. Используйте яркие вспышки (Вход 2.0 шотландец cd.sm ^-2, 1 мс) для измерения функции сетчатки. В этом исследовании это сравнение между контролем, легкого вреда здоровью и легкого вреда здоровью с RIP.

8. Анализ TUNEL

1. Эвтаназии животных внутрибрюшинной инъекцией фенобарбитала передозировки (100 мг / кг). Выяснять глаза и зафиксировать в 4% параформальдегида.
2. Вымойте глаза PBS, прежде чем cyroprotectingглаза в течение ночи в 30% сахарозы (масса / объем). Вставить глаза в октябре соединения и сократить на 20 мкм сагиттальных срезах с помощью криостата.
3. Выполните TUNEL анализ на сетчатке секций с окрашиванием DAPI в соответствии с протоколом о Maslim др. ²⁷
4. Использование флуоресцентной микроскопии для TUNEL пунктам сетчатки. TUNEL клетки были зафиксированы от наружного ядерного слоя (ONL); Наружный слой сетчатки, который содержит фоторецепторов ядра. В этом исследовании, на счету TUNEL были сделаны в трех экземплярах для каждого глаза, с 5 глаза для каждой группы обработки.
5. Используйте одностороннюю ANOVA статистической сравнивать группы средств управления, легкого вреда здоровью, и легкими травмами + RIP крыс.

Results

Манжета для измерения кровяного давления повышен выше 160 мм рт.ст. останавливает приток крови к задней конечности, как показано на рисунке четко 1В. Отсутствие оксигенации тканей в результате снижения температуры ног животного для протокола ишемии-реперфузии (рис 2). Температура футов (33 ° С) была ниже, чем внутренняя температура и надежно уменьшается во время подъема давления манжеты (31 ° C) восходящего когда манжета была спущена (32 ° С). Один 1000 лк легкий вред з...

Discussion

Грызунов задних конечностей ишемии был успешно индуцированных с ручным сфигмоманометра и манжету доставки нейропротекции, чтобы фоторецепторов сетчатки. Вывод согласуется с ишемической кондиционирования индуцированной защиты фоторецепторов от легкого вреда ^9,28.

По сути, пульт ишемия вызывает краткое кислорода к тканям лишения. Следовательно, дистанционное ишемическая предварительная имеет много общего с ишемической кондиционирования или в качестве альтернативы называют ишемическо...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Золотая серия DuraShock ручной анероидный сфигмоманометр	Welch Allyn	DS56	Ручной сфигмоманометр
для новорожденных [размер 2] 1 тюбик, 10 шт	Welch Allyn	5082-102-1	Манжета для измерения артериального давления конечностей
Адаптер замка Люэра	Welch Allyn	5082-178	Адаптер для неонатальной манжеты
Термистор капсула	AD Instruments	ML 309	блок для измерения температуры кожи
Зонд для измерения температуры кожи	AD Instruments	MLT 422/A
Powerlab, 4-х канальная аппаратура	для приобретения AD Instruments	PL 35044
Гомеотермическая система одеяла с гибким зондом	Harvard Appartus	507222F
Полотенце			опционально: пробуждение дистанционной ишемии
Isoflo - 100% Изофлуран (250 мл)	Abbot Animal Health	05260-05	по желанию: инфрезионный анестетик для дистанционной ишемии
Кетамил - кетамин 100 мг/мл (50 мл)	Troy Laboratories Pty Ltd		по желанию: инъекционный анестетик дистанционная ишемия
ксилий - ксилазин 100 мг/мл (50 мл)	Troy Laboratories Pty Ltd		по желанию: инъекционный анестетик для дистанционной ишемии