Методическая статья

Эффективное Вывод пигментного эпителия сетчатки клеток из стволовых клеток

DOI:

10.3791/52214

⸱

8 марта 2015 г.

 ,  ,  , 
1Department of Cell and Molecular Biology, The Scripps Research Institute, 2Lowy Medical Research Institute

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клетки пигментного эпителия сетчатки (RPE), полученные из стволовых клеток, могут быть использованы для различных применений, включая клеточную терапию дегенерации сетчатки, моделирование заболеваний и исследования лекарств. Здесь мы представляем простой протокол для воспроизводимого получения РПЭ из стволовых клеток.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Не было найдено лекарства от возрастной макулярной дегенерации (ВМД), основной причины потери зрения у людей старше 55 лет. ВМД является сложным мультифакториальным заболеванием с неизвестной этиологией, хотя в основном считается, что оно возникает из-за гибели или дисфункции пигментного эпителия сетчатки (РПЭ), монослоя клеток, который лежит в основе сетчатки и обеспечивает критически важную поддержку фоторецепторов. Стратегии замещения клеток RPE могут иметь большие перспективы для обеспечения терапевтического облегчения для большой подгруппы пациентов с ВМД, и клетки RPE, которые сильно напоминают первичные клетки человека (hRPE), были получены в нескольких независимых лабораториях, включая нашу собственную. Кроме того, использование iPS-RPE не ограничивается клеточной терапией, но также используется для моделирования заболеваний RPE. Эти типы исследований могут не только пролить свет на молекулярные основы заболеваний, но и послужить бесценными инструментами для разработки и тестирования новых лекарств. Мы представляем здесь оптимизированный протокол направленной дифференцировки РПЭ из стволовых клеток. Добавление никотинамида и активина А или IDE-1, небольшой молекулы, которая имитирует его эффекты, в определенные моменты времени, значительно увеличивает выход клеток RPE. Используя этот метод, мы можем получить большое количество РПЭ с низким проходом уже за три месяца.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Различные типы клеток, которые занимают сетчатку, организованы в функциональную архитектуру. Фоторецепторы в задней части сетчатки отвечают за преобразование света в электрические импульсы посредством фототрансдукции. Тем не менее, фототрансдукция не может произойти без скоординированных усилий других соседних типов клеток, включая глию Мюллера и клетки пигментного эпителия сетчатки (РПЭ). Монослой клеток РПЭ отделяет сенсорную сетчатку от хориокапилляров, основного источника крови для фоторецепторов, и идеально расположен для контроля нескольких функций, важных для гомеостаза фоторецепторов. На самом деле, РПЭ и фоторецепторы настолько взаимозависимы, что широко рассматриваются как единая функциональная единица. (Обзор всех разнообразных функций RPE см. в Strauss, 20051.) Гибель или дисфункция клеток пигментного эпителия сетчатки может вызвать возрастную макулярную дегенерацию (ВМД), которая является основной причиной необратимой потери зрения в промышленно развитых странах2-4.

ВМД является многофакторным заболеванием РПЭ, фоторецепторов и сосудистой сети хориоидеи; факторы риска разнообразны и включают комбинации экологических и генетических влияний5,6. Методы лечения ВМД очень ограничены, но одной из перспективных потенциальных терапий является замена клеток RPE7,8. Несмотря на то, что результаты были неоднозначными, трансплантация клеток РПЭ у пациентов с ВМД (и у других пациентов с дегенерацией сетчатки), а также у грызунов с моделями дегенерации сетчатки имеет потенциал для временного предотвращения значительной атрофии фоторецепторов9-23. (Животной моделью, обычно используемой для этих исследований, являются крысы Королевского колледжа хирургов (RCS), которые несут мутацию в гене MerTK. Эта мутация делает клетки RPE неспособными к фагоцитозу внешних сегментов фоторецепторов и способствует дегенерации сетчатки24.) В то время как зарегистрированные показатели выживаемости имплантированных РПЭ в субретинальном пространстве крыс и мышей с РКС сильно варьируются, существует вероятность того, что они смогут выжить в течение нескольких месяцев или лет9,10,12,20.

Клетки RPE могут быть получены в достаточном количестве для трансплантации, получив их из плюрипотентных стволовых клеток9-14,25-28. Несколько независимых групп продемонстрировали, что эти клетки функционируют аналогично своим соматическим аналогам, а долгосрочные исследования показывают, что они безопасны при имплантации в модели болезней крыс и мышей9,10,12,14,19,20,25,29-32. Использование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток вместо эмбриональных стволовых клеток может быть выгодным, поскольку этические проблемы и иммунологические проблемы, связанные с аллогенным РПЭ, могут быть устранены33,34. Еще одним интересным применением технологии iPS является моделирование болезней35. Возможность опроса большого количества клеток RPE, полученных от пациентов с заболеваниями RPE, может быть неоценимой для понимания их молекулярной основы. Этот тип исследования был недавно проведен с участием пациента с болезнью Бест РПЭ и может проложить путь к аналогичным исследованиям наследственных макулопатий.

Получение RPE из стволовых клеток является относительно простым процессом и может быть выполнено полностью в условиях, свободных от ксено. Простейшей стратегией является получение монослоев клеток RPE спонтанно, однако выход может быть значительно увеличен с помощью методов направленной дифференцировки. Но эти методы включают использование экзогенных белковых факторов, которые могут быть дорогостоящими и часто образуются в бактериях или других источниках, отличных от человека10,12,37. В наших исследованиях мы следовали установленному протоколу10, в котором используются никотинамид и активин А, сигнальный фактор, который, как было показано, достаточен для спецификации РПЭ38. Здесь мы продемонстрируем, что малая молекула IDE-1 может адекватно заменить активин А, тем самым снижая затраты и снимая проблемы, связанные с использованием рекомбинантных белков39. Кроме того, мы используем заменитель сыворотки, не содержащий ксено, и культивируем дифференцирующие клетки RPE на синтетическом субстрате, не содержащем ксено. Ранее было показано, что клетки RPE очень эффективно дифференцируются при использовании этогоподхода40.

При дифференцировке в качестве монослоя мы визуализируем пигментированные колонии, содержащие клетки RPE, уже через пять недель12. Как только они достигнут достаточного размера, их можно вручную вырезать и переложить в другую посуду для расширения. Клетки RPE печально известны своей дедифференцировкой с каждым пассажем, поэтому следует избегать использования клеток старше пяти пассажей (мы обнаружили, что достаточное количество клеток для характеристики и трансплантации на животных моделях может быть легко получено после двух или трех пассажей). После полной дифференцировки мы используем несколько методов для определения анатомической и функциональной характеристики клеток, чтобы гарантировать, что они будут служить адекватной заменой больным РПЭ. Описание этих методов, а также протокол имплантации iPS-RPE в субретинальное пространство грызунов выходят за рамки данной методики и были ранее опубликованы12,32,41.

Хотя разработка стандартизированных протоколов для эффективного получения iPS-RPE явно важна для клиник, также предстоит еще проделать значительную доклиническую работу на животных моделях. Существуют опасения по поводу иммуногенности клеток, полученных из iPS, и в настоящее время изучаются различные методы имплантации, включая имплантацию клеток на искусственные субстраты. По этим причинам мы считаем, что публикация стандартизированных протоколов полезна для облегчения как клинических, так и доклинических исследований. Особенно если будут проводиться прямые сравнения iPS-RPE клеток, полученных в разных лабораториях разными исследовательскими группами.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. направленной дифференцировки стволовых клеток, полученных НПП

Примечание: Все стадии инкубации проводили при 37 ° С в 5% СО 2

  1. Поддержание линии HES или бедер (подача в день) на техническое обслуживание средств массовой информации (мм Таблица 1). После того, как линии достигли достаточных стандарты контроля качества, поддерживать их на слой мышиных эмбриональных клеток-фидеров (MEFs) высевали при плотности 250000 / лунку пластины шесть. Xeno свободной культуры также могут быть получены в соответствии с протоколом, установленном Tucker и соавт. 40.
  2. Разрешить стволовых клеток колонии, чтобы достичь слияния.
  3. Переключитесь на дифференциации средств массовой информации с никотинамид (DM / NIC; Таблица 1); кормить ежедневно.
  4. После трех недель в культуре, переключитесь на дифференциации средств массовой информации с никотинамида и либо активин-А или IDE-1 (DM / NIC / AA или DM / NIC / IDE1, в таблице 1) для увеличения НПП дифференциации.
  5. После пяти недель в культуре, вернуться к DM / NIC. не Ежедневные кормления больше не надо раз индикаторов рН в СМИ остановки желтеют день после кормления.
  6. Подождите островков пигментных клеток казаться, что достаточно велики, чтобы быть вырезано и не удалено (рисунки 2D-F и 3А).

2. Разделительные Пигментные Островки

  1. Шерсть лунки 24-луночного планшета с матрицей, которая имитирует естественное окружающей среды клеток (ксено свободной предпочтительно).
    ПРИМЕЧАНИЕ: роговица ножи и острые, остроконечный пинцет являются очень полезными для сбора. Весь лист дифференцированных клеток может снять во время уборки. Избежать этого можно, работая тщательно и первоначально собирание колонии в центре блюда.
  2. Заполните столько лунки 24-луночного планшета с дифференциацией средств массовой информации (DM, в таблице 1) по мере необходимости. Это решение будет зависеть от количества пигментных колонийсобраны.
  3. В капот культуре клеток с рассекает сферу, вручную вырезать пигментные островки. Крошить каждый островок в нижней части исходной пластины с использованием скальпель примерно 2-6 частей и захватить пигментные части с острыми щипцами.
  4. Трансфер 1-2 пигментные части в каждом 24-а.
  5. Не изменяйте СМИ в течение 3-5 дней, пока клетки придерживаться, а затем начать сменить носитель три раза в неделю. (Если они не придерживаются после этого времени, вероятность того, хорошо, что они никогда не будут).
  6. Развернуть клеток в течение 3-4 недель в среде для дифференцировки (DM, в таблице 1) - образ типичного культуры, показанных на рисунке 3B. Клетки могут еще не полностью заполнять хорошо, но ждать больше не похоже, чтобы помочь. Поток ячеек три раза в неделю.
  7. Примерно через 3 недели, вручную удалить скопления лейкоцитов в случае необходимости с острыми щипцами сгустки. Не сделать этот шаг, если это не является необходимым - это легко ввести загрязняющих веществ. Это идеально подходит дляпопытаться получить чистые популяции ПЭС от оригинальных пигментных колоний в шаге 1.6.

3. пассажи стволовых клеток, полученных НПП

  1. Отделить клетки с 200 мкл раствора с клеточной диссоциации (предпочтительно не трипсином-реагент, который может быть инактивирован путем разбавления предпочтительно) в течение 5-8 мин при температуре 37 ° С, и инактивировать его разбавлением DM. Использование 200 мкл пипетки, чтобы смыть все клетки и ресуспендируют их (Если выбранный также содержит только несколько клеток, считают объединения клеток из двух 24-луночных).
  2. Центрифуга (800 мкг в течение 5 мин), отбросить супернатант, и ресуспендируют в 3 мл DM сред.
  3. Re-пластинчатые клетки от одного (или двух) 24-колодцы в одной матрице покрытием 6-а в 3 мл DM на лунку (1: 5 расширения).
  4. Развернуть течение 1-2 недель, пока клетки не являются ~ 90% сливной; Изображение полностью дифференцированных чистой культуры показано на фиг.3С.
  5. Отделить клетки с 1 мл клеточной DДиссоциация раствор в течение приблизительно 5-8 мин при 37 ° С, его инактивации путем разбавления DM, использовать 1000 мкл пипетки, чтобы смыть все клетки, и ресуспендируют их.
  6. Спин вниз (800 мкг в течение 5 мин), отбросить супернатант, и ресуспендируют в 18 мл DM СМИ.
  7. Повторное пластины клетки один 6-а каждый из шести матрицы с покрытием 6-скважин в 3 мл на лунку DM (1: 6 расширения) или один с покрытием 75см 2 колбу (1: 7,5 расширение).
  8. Повторите шаги 3.4-3.8 мере необходимости, пока достаточное количество клеток не получают.
    Примечание: старайтесь, чтобы собрать как можно больше колоний, как это возможно для расширения, а не планирует усиливать культур с помощью пассирования, так как каждый проход вызывает НПП дедифференцировку.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Шаги, описанные в этой рукописи, как показано на рисунке 1, может быть использован для генерации легко RPE из стволовых клеток, как сообщалось ранее 10,12. После сохранения линии плюрипотентных в течение нескольких недель, пигментные колонии начинают появляться в колониях после 5-7 недель (7 недельных культуры, показанных на рисунке 2А-С). Эти колонии могут продолжать расти в течение нескольких недель, как Культуры поддерживали. После достижения достаточных размеров, как пока...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой рукописи мы опишем шаги, чтобы эффективно генерировать большое количество чистых культур IPS-РПЭ. Ранее нами было показано с помощью указанного направленного протокол дифференцирование активин А что мы можем генерировать IPS-РПЭ, которые сильно напоминают hRPE на основе транскриптомика, протеомики, метаболомике и функциональности, и что они замедляют дегенерацию сетчатки при имплантации в RCS крыс 12,31,32 , Процесс формирования IPS-РПЭ является трудоемким, но не трудоемкий (Рисунок 1).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ни у одного из авторов нет никаких коммерческих разоблачений, которые можно было бы декларировать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить следующих людей: доктора Тима Кроне и Эяля Банина (вместе с доктором Мэнди Леманн и Дэвидом Фридлендером) за щедрую помощь в разработке протоколов дифференцировки. Доктор Фелиситас Бухер оказал помощь в дифференцировке клеток RPE, использованных в этом исследовании. Мы также выражаем признательность Национальному институту глаза (гранты NEI EY11254 и EY021416), Калифорнийскому институту регенеративной медицины (грант CIRM TR1-01219) и Медицинскому исследовательскому институту Лоуи (LMRI) за очень щедрое финансирование этого проекта.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Роговичный нож Нож SurgiproSPOI-070x 1
DMEM/F-12, HEPESLife Technologies11330-032500 мл x 4 
Фосфатно-солевой буфер Dulbecco, 1X без Ca или MgVWR45000-434500 мл x 6
Фетальная бычья сыворотка, обычная (инактивированная при нагревании)VWR45000-736500 мл x 1
FGF-Basic (AA 10-155) Рекомбинантный человеческий белокLife TechnologiesPHG0021100 &; g x 1
IDE-1Stemgent04-00262 мг x 1
Knockout DMEMLife Technologies10829-018500 мл x 1 
KnockOut Serum Replacement LifeTechnologies10828-028500 мл x 1
L-глютамин 200 mM Life Technologies25030-081100 мл x 1
MEM Раствор заменимых аминокислот 100X Life Technologies11140-050100 мл x 1
никотинамидSigma-AldrichN0636-100G100 г x 1
пенициллин-стрептомицин (10 000 ЕД/мл)Life Technologies15140-14820 мл x 1
рекомбинантный активин человека/мыши/крысы A PeproTech120-14E10 & g x 2
Synthemax-T Surface 6-луночные планшетыCorning3877Case(12) x 1
фермент TrypLE-Express (1X), без фенола красного Life Technologies12604-021500 мл x 1 
Вакуумный фильтр / система хранения бутылок, 0,1&микро; m pore, 500мл Чехол для 431475 Corning(12) x 1 

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
  2. Congdon, N. Causes and prevalence of visual impairment among adults in the United States. Arch Ophthalmol. 122 (4), 477-485 (2004).
  3. Friedman, D. S. Prevalence of age-related macular degeneration in the United States. Arch Ophthalmol. 122 (4), 564-572 (2004).
  4. Resnikoff, S. Global data on visual impairment in the year. Bull World Health Organ. 82 (11), 844-851 (2002).
  5. Bird, A. C. Therapeutic targets in age-related macular disease. The Journal of Clinical Investigation. 120 (9), 3033-3041 (2010).
  6. Jong, P. T. Age-related macular degeneration. N Engl J Med. 355 (14), 1474-1485 (2006).
  7. Binder, S., Stanzel, B. V., Krebs, I., Glittenberg, C. Progress In Retinal And Eye Research. Transplantation of the RPE in AMD. 26 (5), 516-554 (2007).
  8. Cruz, L., Chen, F. K., Ahmado, A., Greenwood, J., Coffey, P. RPE transplantation and its role in retinal disease. Progress In Retinal And Eye Research. 26 (6), 598-635 (2007).
  9. Carr, A. J. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4 (12), e8152(2009).
  10. Idelson, M. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional retinal pigment epithelium cells. Cell Stem Cell. 5 (4), 396-408 (2009).
  11. Klimanskaya, I. Derivation and comparative assessment of retinal pigment epithelium from human embryonic stem cells using transcriptomics. Cloning Stem Cells. 6 (3), 217-245 (2004).
  12. Krohne, T. Generation of retinal pigment epithelial cells from small molecules and OCT4-reprogrammed human induced pluripotent stem cells. Stem Cells Translational Medicine. 1 (2), 96-109 (2012).
  13. Lund, R. D. Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats. Cloning Stem Cells. 8, 189-199 (2006).
  14. Vugler, A. Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE: anatomy of cell genesis, expansion and retinal transplantation. Exp Neurol. 214 (2), 347-361 (2008).
  15. Algvere, P. V., Berglin, L., Gouras, P., Sheng, Y. Transplantation of fetal retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration with subfoveal neovascularization. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 232 (12 ), 707-716 (1994).
  16. Binder, S. Outcome of transplantation of autologous retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: a prospective trial. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (11), 4151-4160 (2004).
  17. Binder, S. Transplantation of autologous retinal pigment epithelium in eyes with foveal neovascularization resulting from age-related macular degeneration: a pilot study. Am J Ophthalmol. 133 (2), 215-225 (2002).
  18. Falkner-Radler, C. I. Human retinal pigment epithelium (RPE) transplantation: outcome after autologous RPE-choroid sheet and RPE cell-suspension in a randomised clinical study. British Journal of Ophthalmology. 95 (3), 370-375 (2011).
  19. Li, Y. Long-term safety and efficacy of human-induced pluripotent stem cell (iPS) grafts in a preclinical model of retinitis pigmentosa. Molecular Medicine (Cambridge, Mass). 18, 1312-1319 (2012).
  20. Lu, B. Long-Term Safety and Function of RPE from Human Embryonic Stem Cells in Preclinical Models of Macular Degeneration). Stem Cells. 27 (9), 2126-2135 (2009).
  21. Peyman, G. A. A technique for retinal pigment epithelium transplantation for age-related macular degeneration secondary to extensive subfoveal scarring. Ophthalmic Surgery. 22 (2), 102-108 (1991).
  22. Schwartz, S. D. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. The Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
  23. Wang, N. K. Transplantation of reprogrammed embryonic stem cells improves visual function in a mouse model for retinitis pigmentosa. Transplantation. 89 (8), 911-919 (2010).
  24. Cruz, P. M. Mutation of the receptor tyrosine kinase gene Mertk in the retinal dystrophic RCS rat. Human Molecular Genetics. 9 (4), 645-651 (2000).
  25. Buchholz, D. E. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (10), 2427-2434 (2009).
  26. Hirami, Y. Generation of retinal cells from mouse and human induced pluripotent stem cells. Neurosci Lett. 458 (3), 126-131 (2009).
  27. Meyer, J. S. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (39), 16698-16703 (2009).
  28. Osakada, F. In vitro differentiation of retinal cells from human pluripotent stem cells by small-molecule induction. J Cell Sci. 122 (17), 3169-3179 (2009).
  29. Carr, A. J. Molecular characterization and functional analysis of phagocytosis by human embryonic stem cell-derived RPE cells using a novel human retinal assay. Mol Vis. 15, 283-295 (2009).
  30. Kokkinaki, M., Sahibzada, N., Golestaneh, N. Human Induced Pluripotent Stem-Derived Retinal Pigment Epithelium (RPE) Cells Exhibit Ion Transport, Membrane Potential, Polarized Vascular Endothelial Growth Factor Secretion, and Gene Expression Pattern Similar to Native RPE. Stem Cells. 29 (5), 825-835 (2011).
  31. Westenskow, P., Friedlander, M. Ch. 111. The New Visual Neurosciences. Werne, J. S., Chalupa, L. M. , The MIT Press. Cambridge, MA. 1611-1626 (2013).
  32. Westenskow, P. D. Using flow cytometry to compare the dynamics of photoreceptor outer segment phagocytosis in iPS-derived RPE cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (10), 6282-6290 (2012).
  33. Algvere, P. V., Gouras, P., Dafgard Kopp,, E, Long-term outcome of RPE allografts in non-immunosuppressed patients with AMD. Eur J Ophthalmol. 9 (3), 217-230 (1999).
  34. Zhang, X., Bok, D. Transplantation of retinal pigment epithelial cells and immune response in the subretinal space. Invest Ophthalmol Vis Sci. 39 (6), 1021-1027 (1998).
  35. Gamm, D. M., Phillips, M. J., Singh, R. Modeling retinal degenerative diseases with human iPS-derived cells: current status and future implications. Expert Review Of Ophthalmology. 8, 213-216 (2013).
  36. Singh, R. iPS cell modeling of Best disease: insights into the pathophysiology of an inherited macular degeneration. Hum Mol Genet. 22 (3), 593-607 (2013).
  37. Buchholz, D. E. Rapid and efficient directed differentiation of human pluripotent stem cells into retinal pigmented epithelium. Stem Cells Transl Med. 2 (5), 384-393 (2013).
  38. Fuhrmann, S., Levine, E. M., Reh, T. A. Extraocular mesenchyme patterns the optic vesicle during early eye development in the embryonic chick. Development (Cambridge, England). 127 (21), 4599-4609 (2000).
  39. Borowiak, M. Small molecules efficiently direct endodermal differentiation of mouse and human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 4 (4), 348-358 (2009).
  40. Tucker, B. A., Anfinson, K. R., Mullins, R. F., Stone, E. M., Young, M. J. Use of a synthetic xeno-free culture substrate for induced pluripotent stem cell induction and retinal differentiation. Stem Cells Transl Med. 2 (1), 16-24 (2013).
  41. Ramsden, C. M. Stem cells in retinal regeneration: past, present and future. Development (Cambridge, England). 140 (12), 2576-2585 (2013).
  42. Zhao, T., Zhang, Z. -N., Rong, Z., Xu, Y. Immunogenicity of induced pluripotent stem cells. Nature. 474 (7350), 212-215 (2011).
  43. Zhang, K. Direct conversion of human fibroblasts into retinal pigment epithelium-like cells by defined factors. Protei., & Cell. 5 (1), 48-58 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

IDE 1

Похожие статьи