Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Summary

We present a protocol to generate primary cultures of murine and human esophageal stromal cells with a myofibroblast phenotype. Cultured cells have spindle shaped morphology, express α-SMA and vimentin, and lack epithelial, hematopoietic and endothelial cell surface markers. Characterized stromal cells can be used in functional studies of epithelial-stromal interactions.

Abstract

Мышиные и человеческие пищевода миофибробласты генерируются с помощью ферментативного расщепления. Новорожденных (8-12 день назад) мышиного пищевода собирают, измельчают, промывают и подвергают ферментативным расщеплением коллагеназой и диспаза в течение 25 мин. Человека резекции пищевода образцы лишены мышечной слизистой и адвентиции и остальные слизистой оболочки измельчают и подвергают ферментативному расщеплению коллагеназой и диспазу на срок до 6 часов. Культивируемые клетки выразить α-SMA и виментин и ускоренная десмин слабо или не на всех. Условия культивирования не способствуют росту эпителиальных, кроветворной, или эндотелиальных клетках. Чистота культуры дополнительно подтверждается оценки цитометрии потока клеточной поверхности маркера экспрессии потенциального загрязняющего кроветворной и эндотелиальных клеток. Описанная методика проста и приводит к последовательной генерации без hematopoieitc, без эндотелиальных клеток стромы. Ограничения этого метода присущи использованиемпервичные культуры в молекулярных исследованиях биологии, т.е. неизбежно изменчивость встречается у культур, созданных в разных мышей и человека. Первичные культуры, однако являются более представительным отражением состояния в естественных условиях по сравнению с клеточными линиями. Эти методы также обеспечить следователям возможность выделить и культивировать стромальных клеток из различных клинических и экспериментальных условиях, что позволяет провести сравнение между группами. Характеризуется пищевода стромальные клетки могут быть также использованы в функциональных исследований следственных эпителиальные-стромальных взаимодействий в пищевода расстройств.

Introduction

Эпителиальные-стромальных взаимодействий участвуют в регуляции различных функций желудочно-кишечного тракта, включая регенерацию слизистой оболочки, ремонта, фиброз и канцерогенеза ^1,2. Эти взаимодействия были наиболее изученным в тонкой и толстой кишки, и может также играть роль в слизистой расстройств пищевода ^3. Субпопуляции кишечные и стромальные клетки толстой называемых миофибробластами было продемонстрировано участие в опосредовании повреждение тканей, воспаление и ремонт ^4,5. В дистальной желудочно-кишечного тракта, эти клетки в форме веретена расположены рядом с базальной мембраны на границе раздела между эпителием и собственной пластинки и определяется как α-SMA и виментина положительным, пан-цитокератин отрицательным, и слабо положительной, так и отрицательной десмин ^5.

Пищевода стромы не были тщательно характеризуется на клеточном или молекулярном уровне. Наша работа в мышиной пищевода была деmonstrated α-SMA и Виментин клетки в пищеводе стромы, иногда нижележащих для плоского эпителия ^6. Эпителиальные-стромальных взаимодействий были вовлечены в слизистой пищевода расстройств, таких как желудочно-пищеводного опосредованной травмы ⁶ и эозинофильный эзофагит ^3. Фиброзные стриктуры также известен осложнение пищевода травмы и стромальных клеток были вовлечены в патогенез желудочно фиброза. Выделение этих клеток поможет выполнить необходимые исследования для изучения ненормальных сигнальных путей.

Это представление предоставляет методы, необходимые для установления первичных культур α-SMA положительных, виментина положительных миофибробластов таким образом, что существующие пробелы в знаниях о сигнальных путей, опосредующих эти взаимодействия могут быть решены. Техника, описанная успешно используется авторами для создания первичных мышиных толстой миофибробласты ⁷ и furtheR приспособлен для создания мышиных ⁶ и миофибробластного, как пищевода стромальных клеток человека.

Здесь мы описываем условия, необходимые для создания и охарактеризовать этих культур, установленные с помощью мыши или человека пищевода до использования в будущих функциональных исследований. Культуры можно выращивать и использовать в течение по 15 проходов. Выделение и установление первичных культур с помощью методов, описанных ниже генерирует стромальных клеток с фенотипом миофибробластного; α-SMA, Виментин положительных и слабо положительным или отрицательным для десмина и цитокератин отрицательным. Этот фенотип отличается от фенотипа фибробластов пищевода, который в основном положительным виментин, α-SMA отрицательной ³ или α-SMA положительным, виментина отрицательного фенотипа мышечной слизистой оболочки ^6.

Protocol

Протокол проведения экспериментов на животных, обоснование и задачи исследования, были представлены и одобрены в Университете Южной Калифорнии Уходу за животными и использованию комитета. Протокол для установления первичных культур из обезличенной Esophagectomy образцов человека была одобрена в Университете Южной Калифорнии Экспертный совет. 1. Получить Мышь или человеческой пищевод Получить Mouse пищевод: Эвтаназии 8-12 день старый мышь с 2% изофлуран ингаляционной передозировки с последующим смещением шейных позвонков. Pin животное вниз животом вверх и влажный вентральной поверхности с 70% этанола. С пинцетом, возьмите и поднимите переднюю кожи к отверстие мочеиспускательного канала щипцами. Используйте стандартные прямые хирургические ножницы, чтобы разрезать вдоль вентральной срединной линии от отверстия уретры до подбородка. Будьте осторожны, чтобы сократить только на кожу. </ Li> Сделать надрез от уретры отверстия вниз к колену на обеих сторонах животного, образуя вверх ногами "Y". Сделать другой разрез на обеих сторонах животного вдоль грудной клетки. Тщательно очистить кожу с обеих сторон, от Базового брюшины и грудной клетки, а лежал в стороны. Осмотрите грудную клетку, покрывающий грудную полость и брюшины, покрывающий брюшной полости. Поднимите брюшины щипцами и вырезать через него до диафрагмы и грудной клетки, указывая ножницы вверх, чтобы предотвратить повреждение содержимого брюшной полости. Аккуратно поднимите левую долю печени, подвергать основной желудка, пищевода, желудка переход и брюшной части пищевода. Используйте автоклавного хирургические ножницы, чтобы разрезать грудину и грудную клетку вдоль средней линии до шейного пояса. Ножницы направлены вверх, чтобы предотвратить повреждение грудной содержание. Полностью раскрыть содержаниегрудной полости, потянув за грудную клетку в стороны. Аккуратно снимите сердце и обеих долей легких. Поглощенный избыток крови с Q-советы. Грудной пищевода узкая, гибкая трубка лежала позади трахеи и передней к грудного позвонка. ПРИМЕЧАНИЕ: пищевод может быть трудно определить в мышиных новорожденных. Локализация пищеводно-желудочного перехода делает пищевода идентификация проста. Внимательно следуйте пищевод вверх от желудка, анализируя окружающий сосудистой, жир и брыжейку весь путь до пищевода происхождения в шейном полости. Хирургические ножницы с тупым кончиком лучше всего подходит для этой цели. Резекцию по всей длине пищевода и место в сбалансированном солевом растворе Хэнкса (HBSS) для дальнейшей обработки, описанной ниже. Удаление части желудка для целей ориентации, если это необходимо. ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за небольшого размера ткани, разделение мышечной слизистой от мышечнойявляется слизистая оболочка не достижимо в мышиной новорожденных пищевода и весь пищевод подвергается обработке описано ниже. Получить Human пищевод: Вымойте резекции пищевода образцов (обычно 5 см или меньше) с HBSS и удалить все установленные соединительной ткани, жира или сосудов. Резекцию часть образца и поместить в формалине для дальнейшего гистологического исследования, если это необходимо. Разделите оставшиеся слизистую оболочку от основной мышечной слизистой резким вскрытия. Вырезать слизистую оболочку на подразделы фрагменты сантиметровых и предмет методике, описанной ниже. Примечание: Human пищевода резекции могут быть сохранены в PBS в течение до 6 ч до обработки, описанной ниже. Источник Esophagectomy образцов будет диктовать размер образца и будет зависеть лаборатория. 2. Изолировать мышиных и человеческих пищевода стромальных клеток Изолировать пищевода стромальных клеток FROM мышиных и человеческих тканей с помощью комбинации механического и ферментативного расщепления. Механически переварить путем измельчения ткани с помощью ножниц и многочисленных стирок с HBSS. Ферментативно переварить путем инкубации ткани с 300 U / мл коллагеназы XI и 0,1 мг / мл диспазу в течение 25 мин (мышиный ткани) или на срок до 6 ч (тканей человека). Убедитесь, что инструменты, используемые для измельчения были в автоклаве и стерилизации. ПРИМЕЧАНИЕ: коллагеназы являются ферменты, которые расщепляют коллаген, внеклеточного матрикса белок, ответственный за проведение животной ткани вместе. Коллагеназа XI имеет высокую активность коллагеназы и видел успех в этом протоколе изоляции. Диспаза является бактериальный фермент с легкой протеолитической активности диссоциации, что сохраняет активность клеточной мембраны и используется в комбинации с коллагеназы в качестве вторичного фермента. Поместите слизистой оболочки фрагменты, полученные из мыши или тканей человека в 1,7 мл микро-центрифуги или 5 мл пробирки соответственно, содержащие HBSS. Фарш ткани далеена 2-3 мм части, используя ножницы с открытой ширины совет, который впишется в соответствующих труб. Достаточно времени, чтобы учесть пищевода фрагменты слизистой оболочки для осаждения на дно пробирки. Медленно перелить HBSS, будьте осторожны, чтобы случайно не выбросить ткани. Замените свежие HBSS последующим осторожном встряхивании. С другой стороны, удалить HBSS с 1 мл пипетки. Промыть ткань таким образом, в общей сложности восемь раз при осторожном встряхивании между промывками, позволяющих время для пищевода фрагменты, чтобы осадить между каждой промывки. ПРИМЕЧАНИЕ: Человеческие ткани требуют более мясорубки, что новорожденный мыши ткани. Инкубируйте мышиный ткани с 300 Ед / мл коллагеназы XI и 0,1 мг / мл диспаза в течение 25 мин на ротационном шейкере, настроенном на медленной скорости при комнатной температуре. Выдержите ткани человека с 300 U / мл XI коллагеназы и 0,1 мг / мл диспазу на срок до 6 ч, на ротационном шейкере, установленного на медленной скорости при комнатной температуре. ПРИМЕЧАНИЕ: Наличие человеческого esophaГус переменная. Слизистой оболочки пищевода человек инкубировали с ферментами до 6 результатов час в успешной генерации первичных культур. После ферментативного расщепления, фарш ткани дополнительно ножницами и центрифуге при 200 мкг в течение 10 мин. Удалите супернатант. Передача осадок, состоящий из смешанной клеточной суспензии в 5 мл пробирку и промыть в 5 раз Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM) с добавлением 2% сорбита, чтобы устранить нежизнеспособных клеток и мусора. Семенной клеток в 6-луночных планшетах и ​​культуры в среде DMEM с 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 10 мг / мл инсулина, 10 мкг / мл трансферрина, 10 мкг / мл гентамицина и 2 нг / мл эпидермального фактора роста (ЭФР) , Вакуумный фильтр (0,22 мкм) все компоненты, за исключением EGF, которые могут быть добавлены после фильтрации. Распределить клеток, полученных из образцов резекции человека между несколькими пластинами 6-луночные, в зависимости от размера резекции. После того, как скважины 80% сливной, прохождение прилипшие клетки в колбы Т25 насчисле 0,05% трипсина / этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Нейтрализовать со средствами массовой информации и спина при 400 х г. Для 6 а проход к Т25 колбу, прохождение клетки в соотношении 1: 1. Сливной T25 колбы может быть пассировать на соотношении 1: 3: 2 или 1. Для перехода от Т25 колбы к колбе T75, используют в соотношении 1: 1. Изменить среды каждые 2-3 дня, независимо от судна. Рост клеток при 37 ° С в увлажненной 5% CO 2 инкубаторе и культуры в миофибробластного сред, описанных выше. ПРИМЕЧАНИЕ: Эпителиальные клетки не выживают в этих культуры или проход условиях. Клетки, используемые для определения характеристик и исследований, описанных ниже, между проходами 5 и 15. Крио-сохранение клеток в жидком N 2 добавлением 10% диметилсульфоксида в миофибробластного сред. 3. Охарактеризуйте мышиных и человеческих пищевода стромальных клеток Изучить морфологию клеток с помощью инвертированного микроскопа. Обратите внимание на веретенообразнуюМорфология прикрепленных клеток (рисунок 1). Охарактеризовать культивируемых клеток путем оценки следующих цитоскелета маркеров: α-SMA, виментина, десмина и цитокератина. Стромальных клеток с фенотипом миофибробластного, как выразить цитоскелета миофибробластного маркеры α-SMA и виментина (рис 2). Для того чтобы отличать культурные стромальных клеток из мышечных клеток, immunostain для десмина. Чтобы выполнить иммунного окрашивания на культивируемых клетках, пластины 1,5 х 10 4 клеток в 4-луночных слайдов камеры и расти в миофибробластного сред в течение 24 ч. Стромальных клеток с фенотипом миофибробластного, как будет слабый или отсутствующий взгляд Desmin. Стромальные клетки не имеют экспрессии маркера эпителиальных пан-цитокератином (данные не показаны). Примечание: Оценка культур включает оценку цитоскелета маркеров иммуноцитохимически и маркеров клеточной поверхности с помощью проточной цитометрии. Иммуноцитохимическая используется в качестве основного способа определения характеристик, как эксприжимное профиль белков цитоскелета является уникальным для фибробластов, миофибробластного или мышечной клетки. Проточная цитометрия устанавливает чистоту культуры путем оценки экспрессии клеточной поверхности эпителиальных, эндотелиальных и гемопоэтических клеток маркеров. CD90 является полезным в качестве дополнительной способу идентификации стромальных клеток человека, как она выражена на обоих человеческих фибробластов и миофибробластами. CD90 не полезно в характеристике мышиных стромальных клеток, он также выразил мышиных Т-клеток. После клетки достигают 60% слияния, промыть слайды с фосфатно-солевом буфере (PBS) и зафиксировать с помощью метанола. Инкубируйте клетки в метаноле в течение 10 мин при -20 ° С, а затем хранить в PBS при 4 ° С до использования. Следуйте стандартный протокол иммунной окраски. Если коротко, то перед нанесением первичных антител, блок фиксированных клеток с 5% goatserum в PBS. Развести первичных и вторичных антител в 5% козьей сыворотки, а также. Для обнаружения α-SMA и виментина, используйтеСледующие антитела и концентрации: мышиное моноклональное антитело к α-SMA на 1: 250 разбавления и Кролик личной адресной книги на виментина на 1: 500 разбавления. Инкубируйте с первичным антителом при комнатной температуре в течение ночи при 4 ° С, промыть 3 раза PBS и добавляют вторичные антитела, конъюгированного родамин Козы против мыши в разведении 1: 200 и су2 конъюгированный козы против кролика в разведении 1: 1000 в течение 1 часа при комнатной температуре. Контрастное ядра с 4 ', 6-диамидино-2Phenylindole (DAPI) в концентрации 1 мкг / мл в течение 1 мин и затем промыть ЗФР. Анализ слайды с помощью инвертированного микроскопа. Создание чистоты культур путем исследования мышиных и человеческих пищевода клеток для кроветворной (CD45) и эндотелиальных (CD31) на поверхности клеток маркеры с помощью проточной цитометрии (рис 3). Определение характеристик клетки человека далее экспрессии стромальных клеток поверхностного маркера CD90. Примечание: CD90, не может быть использован для идентификации мышиных стромальных клеток, как мышиный Т CELLs также выразить CD90. Отделить культивируемых мыши пищевода стромальных клеток из культуральной колбы посредством обработки неферментативного клеточной диссоциации раствора при 37 ° С в течение 10 мин, промывали FACS буфером два раза, считали и окрашивали FITC-CD45 и CD31-APC с соответствующими управления изотипа, в соответствии со стандартными процедурами окрашивания. Сбор клеток с использованием FACS Calibur и анализировать данные с помощью программного обеспечения FlowJo. До окрашивания клеток, оптимизировать антитела и титруют концентрации с помощью элементов управления изотипа нормальной селезенки мыши, и клетки костного мозга.

Representative Results

Пищевода стромальные клетки, выделенные с помощью механического и ферментативного расщепления первоначально покрытием и культивировали в 6-луночных планшетах. Исследование клеток с помощью инвертированного микроскопа в течение нескольких часов металлизации демонстрирует смешанну…

Discussion

Методы генерации первичной культуре в целом схожи при использовании мыши или тканей человека с мясорубки и пищеварения времена, адаптированных для размера ткани. Наш опыт работы с мышиной ткани предполагает, что с помощью описанных выше методов последовательно привести к успешного у?…

Materials

Name
Tissue culture reagents
HBSS	Sigma Aldrich	H6648
dispase	GIBCO, Invitrogen	17105-041
collagenase XI	Sigma-Aldrich	C9407
DMEM	GIBCO, Invitrogen	11965-092
sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876
FBS	Sigma)	F42442
transferrin	Roche	10-652-202-001
trypsin/EDTA	Corning	25-052-Cl
epidermal growth factor	Sigma-Aldrich	E9644
trypsin/EDTA	Corning	25-052-Cl
Reagents for immunostaining
goat serum	Sigma Aldrich	G9023
Mouse mAB to α-SMA	abcam	ab7817
Rabbit pAB to vimentin	abcam	ab45939
Cy2 conjugated Goat anti Rabbit	Jackson ImmunoResearch	111-225-144
DAPI	sigma-aldrich	D8417
CD31 conjugated to eFluor 450	ebiosciences	48-0319-410
CD90 conjugated to APC	ebiosciences	17-0909-41
Annexin V and 7AAD	BD Pharmigen	559763
mouse Fc block for CD16/CD32	BD Pharmigen	2136662
Equipment
5 ml tube	eppendorf	30108310
Motic AE31 inverted microscope	Motic AE31 inverted microscope	Motic AE31 inverted microscope
Nuaire Biosafety Cabinet and Incubators	Nuaire Biosafety Cabinet and Incubators	Nuaire Biosafety Cabinet and Incubators
4-well chamber slides	Thermo Scientific	177437
Eppendorf Centrifuge 5810R	Eppendorf Centrifuge 5810R	Eppendorf Centrifuge 5810R
Olympus Vacuum-Driven Filter System	Genesee Scientific	25-227
Nikon Eclipse TE300 Fluorescent Microscope	Nikon Eclipse TE300 Fluorescent Microscope (Tokyo, Japan)
6 well plates	Corning	3516
T25 Flasks	TRP	90026
T75 Flasks	Corning	43064
Dissection Scissors	Dissection Scissors	Dissection Scissors
Dissection Forceps	Dissection Forceps	Dissection Forceps
Single Tipped Q-Tips	Kendall	540500
T75 Flasks	Corning	43064
Software
Metamorph software (Molecular Devices)	Molecular Devices
FACSCAlibur	BD Bioscience
FACSVerse	BD Bioscience