Макрофаги являются ключевыми клетками, участвующими в патогенности хозяина. Макрофаги демонстрируют фенотипическое и функциональное разнообразие, которое может быть проанализировано и обнаружено с помощью протеомного анализа. В данной статье описано, как провести 2D электрофорез первичных культур макрофагов человека, дифференцированных в фенотип М1 или М2.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Протеомный профилирования макрофагов 2D электрофореза
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Цель описанного здесь протокола двумерного (2D) электрофореза - показать, как анализировать фенотип культивируемых макрофагов человека. Показана ключевая роль макрофагов при различных патологических расстройствах, таких как воспалительные, иммунологические и инфекционные заболевания. В этом протоколе мы используем первичные культуры макрофагов, полученных из моноцитов человека, которые могут быть дифференцированы в фенотип М1 (провоспалительный) или М2 (противовоспалительный). Данная модель in vitro является надежной для изучения биологической активности макрофагов М1 и М2, а также для протеомного подхода. Протеомные методы полезны для сравнения фенотипа и поведения макрофагов М1 и М2 во время патогенности хозяина. 2D гель-электрофорез является мощным протеомным методом для одновременного картирования большого количества белков или полипептидов. Мы описываем протокол 2D электрофореза с использованием флуоресцентных красителей, называемый 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). Белки макрофагов M1 и M2 перед разделением с помощью изоэлектрической фокусировки помечаются цианиновыми красителями в соответствии с их изоэлектрической точкой в первом измерении и молекулярной массой во втором измерении. Затем разделенные белковые или полипептидные пятна используются для обнаружения различий в уровнях экспрессии белка или полипептида. Описанные здесь протеомные подходы позволяют исследовать изменения белков макрофагов, связанные с различными нарушениями, такими как патогенность хозяина или микробные токсины.
Введение
Макрофаги являются гетерогенными и пластмассовые клетки, которые способны приобретать различные функциональные фенотипы. В естественных условиях, эти клетки отвечают на большое разнообразие микро окружающей signalssuch как микробных продуктов, цитокины, и т.д.. 1. В пробирке, про-воспалительных фенотип (М1) из макрофагов может быть индуцирована липополисахарида (LPS) и противовоспалительного фенотипа (M2) с помощью некоторых цитокинов, таких как интерлейкин-4 (IL-4). Кроме того, макрофаги могут переключаться с активированным M1 M2 к фенотипу, и, наоборот, при определенных сигналов 2.
В зависимости от фенотипа, макрофаги будут иметь различные функции. M1 макрофаги являются клетки, которые продуцируют провоспалительные цитокины, такие как фактор некроза опухоли α (TNF-α), чтобы убить микроорганизмы или опухолевые клетки 3. В отличие от этого, М2 макрофаги предотвратить эти воспалительную реакцию, как в заживлении ран и фиброза производя анти-inflammatorY факторы, такие как TGF-β 3,4.
Человеческие мононуклеарные клетки периферической крови от здоровых доноров были выделены с помощью Ficoll центрифугированием в градиенте плотности, как описано выше 5 с помощью метода, приспособленный от 6 Boyum. Макрофаги в культуре могут быть дифференцированы в фенотипе М1 или М2 через 6 дней после первичной культуры 7.
Анализ экспрессии белка или белка изменений между двумя подтипами макрофагов при различных величинах стимулами, такими как принимающей патогенности или микробные токсины, будет полезно, чтобы расшифровать функциональные возможности про- и противовоспалительных макрофагов.
Протеомика уникальные инструменты для прямого мониторинга белков, которые специфически вверх или вниз регулируется в культивируемых макрофагов человека при различных раздражителей. Флуоресцентные красители были решены некоторые из ограничений электрофореза гель 2D, таких как низкой чувствительности и анализа изображений 8 < / SUP>. Красители, реагирующие с остатками цистеина увеличили чувствительность обнаружения по сравнению с теми в реакцию с остатками лизина 9. В предыдущем исследовании, мы доказали полезность ПГЛП маркировки насыщения для анализа скудных образцов 10 по сравнению с классической серебряной окрашенных 2D электрофореза 11. Эта технология является полезным в быстро анализа белковых модификаций между двумя подтипами макрофагов или между необработанных и обработанных макрофагов из того же подтипа.
Преимущества этого протеомного техники будут иметь доступ к информации о размерах белка и пост-трансляционных модификаций, анализируя 2D гель 12. Следует принимать во внимание, что это не техника с высокой пропускной способностью, ограничение количества образцов, которые могут быть проанализированы. Развитие высоких анализов пропускной основе масс-спектрометрии, рассмотренный недавно 13 может улучшить это.
_content "> Здесь мы представляем, как выполнить 2D Dige анализ от извлечения белка из культивируемых макрофагов через процессы электрофореза, Изоэлектрофокусирование, и SDS-PAGE, а также информация о полезности адекватной 2D программного обеспечения.Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Протокол соответствии с руководящими принципами нашей учреждений комитета по этике человека. Баффи пальто от здоровых доноров были получены из областного центра переливания крови (Лилль, Франция). Образцы, полученные от лейкоцитарных пленок объявлены как коллекции Inserm (п ° DC2010-1209).
1. Материал и Культура Медиа Подготовка
- Развести 10x фосфатный буфер солевом растворе (PBS) в стерильной дистиллированной воде, чтобы получить 1X PBS.
- Сделать RPMI 1640, дополненной гентамицин (40 мкг / мл) и L-глутамин (2 мМ), с и без 10% объединенной человеческой сыворотке.
2. Первичные культуры моноцитов макрофагов (MDM)
- Развести buffycoat (25 мл) с 1х PBS. Тщательно загрузить на Ficoll / leucosep трубки и центрифуге при 1600 х г в течение 20 мин, при комнатной температуре.
- Сбор моноциты на границе раздела в новую пробирку. Промыть 3 раза с 10 мл 1X PBS, содержащим 0,1% этилендиаминтетрауксуснаяуксусной кислоты (ЭДТА) путем последовательных центрифугирования при 1000 х г, 370 мкг и 160 мкг в течение 10 мин соответственно, а затем один раз в 1х PBS в покое при 160 х г в течение 10 мин.
- Ресуспендируют осадок клеток в 5 мл среды RPMI-1640 без сыворотки и семян клеток в 35 мм чашках при плотности 1 × 10 6 клеток на чашку.
- После оседания в течение 90 мин в инкубаторе, отбросить супернатант, содержащий неадгезированных клетки. Вымойте прилипшие клетки, состоящие из моноцитов, 3x с 1 мл PBS; Затем добавляют 1 мл свежей среды, содержащей 10% (об / об) сыворотки крови человека с ранее сыворотки свободных клеток.
- После 6 дней культивирования, с получением альтернативных дифференцированные макрофаги (м2), добавить рекомбинантный человеческий IL-4 (15 нг / мл) и поддерживать в течение 6 дней. Затем лечения дифференцированные макрофаги с липополисахаридом (100 нг / мл) на 12-й день в течение 4 ч, чтобы получить M1 макрофаги.
3. Добыча М1 и М2 макрофагов белков для 2D-электрофореза
- Вымойте macrophвозраст три раза с 25 мМ Трис, рН 7,4, и лома в буфере, содержащем 30 мМ Трис рН 8, 4% 3 - [(3-холамидопропил) диметиламмонио] -1-пропансульфонат (CHAPS), 2 М тиомочевины и 7 М мочевины.
- Лизировать клетки с помощью смесителя, подходящую для 1,5 мл микроцентрифужных пробирках в течение 5 минут в лед и хранить при -20 ° С.
- Определить концентрацию белка с использованием коммерческого реагента Брэдфорда. Хранить 100 мкл аликвоты белков при температуре -20 ° С до использования.
4. Изоэлектрофокусирование
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все процедуры маркировки в темноте.
- Уменьшить 5 мкг каждого образца (M1 и M2 макрофаги) доводили до 9 мкл буфера для лизиса с 2 мМ Трис (2-карбоксиэтил) фосфин (ТСЕР) в течение 1 ч при 37 ° С.
- Добавить цианиновыми 3 (Cy3) для извлечения M1 и M2 экстракта красителя сульфгидрильной-реактивного при концентрации 0,8 нМ / мкг белка. Добавить цианиновыми 5 (Су5) до M1 и M2 извлекает при концентрации 0,8 нМ / мкг белка и инкубироватьв течение 30 мин при 37 ° С.
- Остановка реакции с добавлением равного объема образца буфере, содержащем 7 М мочевины, 2 М тиомочевины, 4% CHAPS, 130 мМ дитиотреитола (ДТТ) и 2% pharmalytes.
- Mix Cy3 меченных образцов М1 с Cy5 меченных образцов М2 в одной руке и Cy3 меченных образцов M2 с Cy5 меченных образцов М1 в другой руке.
- Увлажняет иммобилизованным градиентом рН (IPG) полоса (240 мм, рН 3-10 линейный градиент) с 450 мкл меченых смешанных образцов в буфере, содержащем 7 М мочевину, 2 М тиомочевины и 4% ХАПС на изоэлектрофокусирование (МЭФ) система клеток в течение 24 часов без применения каких-либо ток.
- Выполнение фокусировки на 300 вольт (В) в течение 3 ч, а затем при градиенте до 1000 В в течение 6 ч, при градиенте до 8000 В в течение 3 ч и, наконец, в 8000 V в течение 3 часов.
5. Второе измерение
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все процедуры электрофореза в темноте.
- Выдержите полоски IPG в уравновешивающего буфера содержатчисле 0,1 мМ Трис-HCl (рН 8), 6 М мочевины, 2% (вес / объем) додецилсульфата натрия (SDS) и 30% (об / об) глицерина в течение 10 мин.
- Перенесите уравновешивают IPG полоски для второго измерения (электрофорез SDS-полиакриламидном геле (PAGE)) на 12,5% -ном ПААГ и печать с низкой температурой плавления агарозы.
- Провести электрофорез при 20 ° С с использованием системы Ettan-Daltsix при постоянном напряжении 70 В в течение ночи с последующим 300 V, пока бромфеноловый синий фронт не достигнет дна геля.
6. Получение изображения и Биоинформационный Анализ
- Проверять гели, поданные между двумя стеклянными пластинами с низким уровнем флуоресценции с помощью сканера ПГЛП Imager на длинах волн возбуждения / излучения 532/580 нм для Cy3 и 633/670 нм для Cy5 для получения изображений с размером пикселя 100 мкм.
- Выполнить анализ изображения с коммерческим программным обеспечением, как ранее описано 12.
- Рассчитать и нормализовать объемы спот в каждом изображении. Связать нормированный объем спот как опоруortion от общей стоимости каждого пятна обнаружены в геле.
- Анализ различий в объемах спот белка для каждого типа макрофагов путем сравнения нормированное значение громкости место между двумя группами (M1 и M2). Рассмотрим разницу между объемами спотовых быть значительным, если это изменение в 1,5 раза (р <0,05, односторонний ANOVA анализ).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Для выполнения соответствующего дифференциального протеомного анализа, обработки анализируемых образцов должно быть проверено.
В примере, представленном, качество культуры клеток макрофагов требуется для морфологических и молекулярных аспектов, как опубликовано ранее 5. Дифференцировка моноцитов в макрофаги и однородность культуры последовало фазовой микроскопии. Рисунок 1 показал пример первичных культурах М1 и М2 макрофагов. Как показано, мы проверяется однородн...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Протокол описано здесь подробно метод для анализа влияния различных раздражителей двух подтипов макрофагов, М1 (провоспалительного) и М2 (противовоспалительное). Первичные культуры из М1 и М2 макрофагов были получены от дифференциации моноцитов, опубликованной ранее 7.
Процедура гелевого электрофореза 2D ПГЛП требует специализированных материалов и оборудования, таких как РИФ клетки для Изоэлектрофокусирование, с низким уровнем флуоресценции пластин для SDS-PAGE для сканирования в...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Декларируемый конфликт интересов отсутствует.
Благодарности
Эта работа была поддержана Inserm. Марион Буве является научным сотрудником Министерства исследований и технологий Франции. Энни Турки является стипендиатом Европейского Союза FP7 HOMAGE (305507).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Invitrogen | 31870-074 | |
| PBX 10 X | Invitrogen | 14200-083 | |
| L-глутамин-200 mM-100X | Invitrogen | 25030-024 | |
| гентамицин 10 мг/мл | Invitrogen | 15710-049 | |
| сыворотка крови человека | Invitrogen | 34005100 | |
| Ficoll d = 1,077 | ATGC | L6115 | |
| Leucosep | Dutscher | 16760 | |
| 6-луночная плита PRIMARIA | Becton Dickinson | 353846 | |
| IL-4 | Promocell | B-61410 | |
| липополисахарид | Sigma-Aldrich | L-2654 | |
| Giemsa | Fluka | 48900 | |
| EDTA MM372,2 | Research Organics | 3.00E+01 | |
| Фильтр 0.22 & микро; m | Millipore | SCGPTORE | |
| 100 мл цилиндр | Corning | 430182 | |
| TCEP | Interchim | UP242214 | |
| реактив Bradford | Bio-Rad | 5000006 | |
| Cy3+Cy5-реактивный краситель | GE Healthcare | 25-8009-83 | |
| IPG strip 3-10 24cm | GE Healthcare | 17-6002-44 | |
| Protean IEF cell | Bio-Rad | 165-4000 | |
| Легкоплавкая агароза | Invitrogen | 15517-014 | |
| Система Ettan-Daltsix GE | Healthcare | 80-6485-08 | |
| Ettan DIGE Imager сканер | GE Healthcare | ||
| Progenesis Samespot | Нелинейная динамика | ||
| 50 мл пробирки | любого поставщика | н/д | |
| Пробирки 15 мл | любого поставщика | н/д | |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C5070 | |
| вашé e | Merk | 108484-500 | |
| Thiouré e | Sigma-Aldrich | T7875 | |
| DTT | Bio-Rad | 1610611 | |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Pharmalytes 3-10 | GE Healthcare | 17-0456-01 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3773 | |
| Бромофеноловый синий | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| глицерин | Sigma-Aldrich | G6279 | |
| Акриламид 40% | Bio-Rad | 161-0148 | |
| 2D Clean Up GE | Healthcare | 80-6454-51 | |
| Глицин | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Тусклый; тилформамид | Sigma-Aldrich | 22705-6 | |
| электродные фитили | Bio-Rad | 165-4071 |
Ссылки
- van Ginderachter, J. A., et al. Classical and alternative activation of mononuclear phagocytes: picking the best of both worlds for tumor promotion. Immunobiology. 211, (2006).
- Porcheray, F., et al. Macrophage activation switching: an asset for the resolution of inflammation. Clin. Exp. Immunol. 142, 481-489 (2005).
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
- Mantovani, A., Locati, M., Vecchi, A., Sozzani, S., Allavena, P. Decoy receptors: a strategy to regulate inflammatory cytokines and chemokines. Trends Immunol. 22, 328-336 (2001).
- Pinet, F., et al. Morphology, homogeneity and functionality of human monocytes-derived macrophages. Cell. Mol. Biol. 49, 899-905 (2003).
- Boyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1. 97, 77-89 (1968).
- Chinetti-Gbaguidi, G., et al. Human atherosclerotic plaque alternative macrophages display low cholesterol handling but high phagocytosis because of distinct activities of the PPARγ and LXRα pathways. Circ. Res. 108, 985-995 (2011).
- Tonge, R., et al. Validation and development of fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis proteomics technology. Proteomics. 1, 377-396 (2001).
- Shaw, J., et al. Evaluation of saturation labelling two-dimensional difference gel electrophoresis fluorescent dyes. Proteomics. 3, 1181-1195 (2003).
- Dupont, A., et al. Application of saturation dye 2D DIGE proteomics to characterize proteins modulated by oxidized low density lipoprotein treatment of human macrophages. J. Proteome Res. 7, 3572-3582 (2008).
- Dupont, A., et al. Two-dimensional maps and databases of the human macrophage proteome and secretome. Proteomics. 4, 1761-1778 (2004).
- Acosta-Martin, A. E., et al. Impact of incomplete DNase I treatment on human macrophage analysis. Proteomics Clin. Appl. 3, 1236-1246 (2009).
- Acosta-Martin, A. E., Lane, L. Combining bioinformatics and MS-based proteomics: clinical implications. Expert Rev Proteomics. , (2014).
- Boytard, L., et al. Role of proinflammatory CD68+MR- macrophages in peroxiredoxin-1 expression and in abdominal aortic aneurysms in humans. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 33, 431-438 (2013).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
