Некогерентный ксеноновый свет пропускали через узкополосные интерференционные фильтры и фильтры нейтральной плотности, чтобы доставить свет различной длины волны и интенсивности к культивируемым клеткам. Этот протокол был использован для оценки влияния терапии красным/ближним инфракрасным светом на продукцию реактивных веществ in vitro: никаких эффектов при использовании тестируемых параметров не наблюдалось.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Метод оценки воздействия диапазоне длин волн и интенсивностей красный / ближней инфракрасной световой терапии на окислительного стресса In Vitro
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Красный / около инфракрасный свет терапия (R / NIR-LT), с которым выступил лазерном или светоизлучающий диод (LED), улучшает функциональные и морфологические результаты в диапазоне центральная система повреждений нервной в естественных условиях, возможно, за счет снижения окислительного стресса. Тем не менее, влияние R / NIR-LT на окислительный стресс, как было показано варьироваться в зависимости от длины волны и интенсивности облучения. Исследования, сравнивающие параметры лечения не хватает, из-за отсутствия коммерчески доступных устройств, которые обеспечивают несколько длин волн или интенсивности, подходящие для высокой пропускной положить в пробирке исследования оптимизации. Этот протокол описан способ доставки света в диапазоне длин волн и интенсивности для оптимизации терапевтических доз, необходимых для данной модели травмы. Мы предположили, что метод доставки света, в которых могут быть легко изменены длины волны и интенсивности параметры, может облегчить определение оптимального дозы R / NIR-LT для снижения реактивных форм кислорода(ROS) в пробирке.
Некогерентное ксеноновые фары фильтруют через узкополосных интерференционных фильтров, чтобы доставить различные длины волн (в центре длины волн 440, 550, 670 и 810nm) и флюенсы (8,5 × 10 -3 до 3,8 × 10 -1 Дж / см 2) света в культивируемых клетках. Светоотдача из устройства калибруют, чтобы излучать соответствующие терапевтически, равные квантовых дозы света на каждой длине волны. Активные формы были обнаружены в глутамат подчеркнул клетки, обработанные с учетом, используя DCFH-DA и H 2 O 2 чувствительных флуоресцентных красителей.
Мы успешно доставлено свет в диапазоне физиологически и терапевтически соответствующих длин волн и интенсивностей, в культивируемых клетках, подвергшихся воздействию глутамата в качестве модели повреждения ЦНС. В то время как флюенсами R / NIR-LT, используемых в данном исследовании не оказывают влияния на ROS, генерируемого культивируемых клеток, способ доставки света применимо к другим систEMS включая изолированные митохондрии или более физиологически соответствующие органотипической модели ломтик культура, и может быть использован для оценки воздействия на целый ряд критериев исхода окислительного метаболизма.
Введение
Активные формы кислорода (АФК) требуется для ряда сигнальных путей трансдукции и нормальных реакций клеточного метаболизма, в том числе нейропротекции 1. Однако, когда эндогенный антиоксидант механизм не в состоянии контролировать производство АФК, клетки могут поддаваться окислительным стрессом 2,3. После травмы ЦНС, что приводит к повышению в присутствии АФК и окислительного стресса, как полагают, играют существенную роль в прогрессировании повреждения 4,5. Несмотря на широкое ряда стратегий для ослабления окислительного стресса, которые были оценены, не существует в настоящее время нет полностью эффективных, клинически значимые стр....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Оптический Калибровка: Измерение светового выхода
- Чтобы подготовить световой аппаратурой доставки, подключения широкополосного источника света (например, ксенон или вольфрамовая лампа) к соответствующему источнику питания. Установите коллимирующей линзы перед источником света для получения коллимированного пучка света. Пропускают свет через фильтр жидкого тепла, чтобы удалить большую часть тепла от светового луча. В зависимости от применения, сфокусировать коллимированный пучок на входной апертуре жидкой световода, который обеспечивает более гибкое доставки света (например., В инкубаторе).
- На другом конце световода жидкости, ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Выход света доставлен на длине волны 670 нм была откалибрована с помощью фильтры нейтральной плотности, чтобы облучать клетки с диапазоном плотности энергии, охватывающих дозу 670 нм света было показано ранее, полезными в естественных условиях (0,3 Дж / см 2) 20. По мере увеличения числа нейтральных фильтров плотности перед источником света увеличивается, интенсивность (Вт / м 2) уменьшается, следовательно, меньше света проходит в целевую область. В таблице 1 представлены данные калибров.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Мы успешно приспособлены точное и калиброванного системы доставки света, чтобы обеспечить механизм для изучения оптимизации R / NIR-LT в пробирке. Длина волны и интенсивность параметры R / NIR-LT могут манипулировать точно и эффективно использовать эту систему. Мы установили, что светолечение клеток не приводит к гибели клеток, хотя ROS не были сокращены на длинах волн и дозировках, поставляемых в клеточных типов испытания. Максимальные интенсивности, достигнутые нынешней системы на 670 нм (20.11W / м 2),<.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Эта работа была поддержана Программой исследования нейротравмы (Западная Австралия). Этот проект финансируется через Трастовый счет дорожных травм, но не отражает мнения или рекомендации Совета по безопасности дорожного движения.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| OxiSelect Набор для внутриклеточных анализов АФК (зеленая флуоресценция) | Cell Biolabs | STA-342 | |
| Amplex UltraRed Реагент | Молекулярные зонды | A36006 | |
| 300 Вт ксеноновая дуговая лампа | Newport Corporation | 6258 | Очень интенсивный источник света, не смотрите прямо в лампу. Обеспечьте достаточное охлаждение лампы при ее включении |
| USB4000-FL Флуоресцентный спектрометр | Ocean Optics | ||
| CC-3-UV Корректор косинуса для сбора излучений | Ocean Optics | ||
| 200μ m диаметр кварцевая волоконно-оптическая | Ocean Optics | ||
| SpectraSuite Spectroscopy Platform | Ocean Optics | ||
| 2300 EnSpire Multimode Plate Reader | Perkin Elmer | ||
| Pierce BCA Protein Analysis Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | Острая токсичность, при работе надевайте перчатки. |
| L-глутаминовая кислота Гидрат соли | натрия Sigma-Aldrich | 142-47-2 (безводный) | |
| Феохромоцитома крысы мозговое вещество надпочечников (PC12) | Американская коллекция типовых культур | CRL-2522 | |
| Мемориальный институт Розуэлл Парк (RPMI1640) Media | Gibco | 11875-119 | |
| Фетальная сыворотка крупного рогатого скота, сертифицированная, термоинактивация, происхождение | США Gibco | 10082-147 | Теплый до 37 градусов; C на водяной бане перед применением |
| Лошадиная сыворотка, новозеландского происхождения | Gibco | 16050-122 | Теплая до 37 °°; C на водяной бане перед применением |
| GlutaMAX Добавка | Gibco | 35050-061 | Подогреть до 37 градусов; C на водяной бане перед применением |
| 100 мМ Пируват натрия | Gibco | 11360-070 | Подогреть до 37 °°; С на водяной бане перед применением |
| Пенициллин-стрептомицин (10 000 Ед/мл) | Gibco | 15140-122 | Теплый до 37 °С; C на водяной бане перед применением |
| 100X MEM Раствор заменимых аминокислот | Gibco | 11140-050 | Подогреть до 37 °°; C на водяной бане перед применением |
| Retinal Muller (rMC1) клетки | Калифорнийского университета, Сан-Диего | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-118 | Warm to 37 ° C на водяной бане перед применением |
| 75 см2 Flasks | BD Biosciences | B4-BE-353136 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | 25988-63-0 | Aliquot и хранить при -20 °°; C |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-134 | Warm to 37 ° C на водяной бане перед использованием |
| Фосфатно-солевой буфер (PBS) | Gibco | 10010-049 | Нагреть до 37 °°; C на водяной бане перед применением |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017-015 | Aliquot и хранить при -20°С; C |
| 1X Нейробазальная среда | Gibco | 21103-049 | Теплая до 37 °°; C на водяной бане перед применением |
| Trypan Blue Solution, 0,4% | Gibco | 15250-061 | |
| 165U | Papain Worthington | ||
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | W326305 | |
| луночные пластины, прозрачное дно, черный | Corning | CLS3603-48EA | |
| Costar Clear Polystyrene 96-луночные пластины необработанные; Форма колодца: Круглая; Стерильный. | Costar | 07-200-103 | |
| Качели | Стандартная лабораторная центрифуга | ||
| Стандартная лабораторная | |||
| фильтрующая бумага нейтральной плотности (0.3) | Полосовой фильтр THORLABS | ||
| 442 нм Полосовой фильтр | THORLABS | FL441.6-10 | |
| 550 нм Полосовой фильтр | THORLABS | FB550-10 | |
| Полосовой фильтр 670 нм | THORLABS | FB670-10 | |
| 810 нм Полосовой фильтр | THORLABS | FB810-10e | |
| Размонтированный ø Абсорбционные фильтры нейтральной плотности 25 мм (0.1) | THORLABS | NE01B | |
| Unmounted ø Абсорбционные фильтры нейтральной плотности 25 мм (0.2) | THORLABS | NE02B | |
| Unmounted ø Абсорбционные фильтры нейтральной плотности 25 мм (0.3) | THORLABS | NE03B | |
| в размонтированном виде ø Абсорбционные фильтры нейтральной плотности 25 мм (0,5) | THORLABS | NE05B | |
| в размонтированном виде ø Абсорбционные фильтры нейтральной плотности 25 мм (0.6) | THORLABS | NE06B | |
| Unmounted ø Абсорбционные фильтры нейтральной плотности 25 мм (1.0) | THORLABS | NE10B |
Ссылки
- Gutterman, D. D. Mitochondria and reactive oxygen species an evolution in function. Circulation research. 97, 302-304 (2005).
- Camello-Almaraz, C., Gomez-Pinilla, P. J., Pozo, M. J., Camello, P. J. Mitochondrial reactive oxygen species and Ca2+ signalin....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
Оценка окислительного стрессаманипулирование интенсивностью длины волнысистема подачи ксенонового светаузкополосные интерференционные фильтрынейтральные светофильтрыдетектирование активных форм кислородафлуоресцентный краситель DCFH-DAанализ чувствительности к H2O2клетки в состоянии глутаматного стресса
