Методическая статья

Питательные Регулирование непрерывной подачи для крупномасштабного Расширение клеток млекопитающих в сфероидов

DOI:

10.3791/52224

⸱

25 сентября 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Radiology, University of Minnesota, 2Medicine, University of Minnesota, 3School of Public Health, University of Minnesota, 4Surgery, University of Arizona

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Регуляция питательных веществ с помощью непрерывного кормления с поправкой на рост улучшает темпы роста сфероидов клеток млекопитающих по сравнению с прерывистым периодическим кормлением культур в биореакторах с перемешиванием суспензий. В этом исследовании демонстрируются методы, необходимые для создания простых культур с скорректированной нормой.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой демонстрации сфероиды, образованные из клеточной линии инсулиномы β-TC6, были культивированы в качестве модели производства продукта островковых клеток млекопитающих, чтобы продемонстрировать, как регулирование уровня питательных веществ может улучшить выход клеток. В предыдущих исследованиях биореакторы способствовали увеличению объемов культивирования по сравнению со статическими культурами, но увеличения выхода клеток не наблюдалось. Ограничение основных питательных веществ, таких как глюкоза, которые потреблялись между порциями кормления, может привести к ограничению роста клеток. Наблюдались большие колебания уровня глюкозы, несмотря на увеличение концентраций глюкозы в средах. Использование систем непрерывного кормления устранило колебания уровня глюкозы и улучшило темпы роста клеток по сравнению со статическими методами и методами культивирования SSB. Дополнительное увеличение темпов роста наблюдалось за счет корректировки нормы кормления на основе расчетного расхода питательных веществ, что позволяло поддерживать физиологический уровень глюкозы в культуре в течение трех недель. Этот метод также может быть адаптирован для других типов клеток.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для генерирования большого количества жизнеспособных и функциональных клеток человека для трансплантации, регулирование условий культивирования является обязательным условием. Истощение питательных веществ, наряду с накоплением отходов метаболизма являются основными факторами , способствующими стареющих и метаболические изменения , которые снижают качество клеточного продукта 1 - 3. Эта процедура демонстрирует способ к культуре клеток млекопитающих в сфероидов с применением перемешиваемой биореактора в сочетании с отрегулированной системой подачи скорость перфузии , чтобы регулировать уровень глюкозы в физиологическом диапазоне 4 в течение всего периода культивирования. Для целей этих исследований, физиологический диапазон был определен как от 100 до 200 мг / дл. Те же методы могут быть использованы для регулирования других питательных веществ и метаболические отходы, такие как лактат.

Статические культуры в небольших объемах (1 - 30 мл), как правило, используются в лабораторных условиях для поддержания и дифференциации клеточных линий для experimental целей. Cell пассажи выполняется с полными изменениями среды по мере необходимости через регулярные промежутки времени. Большинство "обычных" питательная среда имеет высокую концентрацию глюкозы (450 мг / дл для DMEM, используемого в этих исследованиях), чтобы позволить менее частых изменений средних без риска питательных ограничений. Тем не менее, эта партия вскармливания метод все еще требует частых манипуляций, вносит вариабельность в среде клеток, а также увеличивает риск загрязнения 5 - 9. Перемешанной суспензии биореакторы (SSB) обеспечивают лучшее перемешивание и снижение обработки 3,10 - 20, но как статические культуры, требуют ручного изменения средних , которые способствуют потенциально опасных колебаний в питательных веществах и отходов уровней продукции. Перфузия кормление ОБП культур уменьшает эти проблемы путем непрерывной инфузии и удаления среды, но большие изменения уровней питательных веществ из-за роста клеток остаются проблемой. Использование скорректированной ра подачит.е из расчета питательного использования на основе оценки потребностей клеток может обеспечить стабильную среду для клеток , необходимых для оптимизации жизнеспособности клеток и функции 21 - 24.

Существует большое количество литературы , описания методов для масштабируемых ОБП культур клеток млекопитающих , специально для культуры и расширения плюрипотентных клеток 25 - 32, с другими сосредоточены на островке (бета) клеток 17,33,34, или производство биологических продуктов 24, 35 - 38. Многие из этих исследованных типах клеток, могут быть выращены в культурах сфероидов, и специфические процедуры типа клеток, используемой должна быть оптимизирована до внедрения непрерывной системы подачи. В этой демонстрации, метод перфузии кормления был использован для расширения линии бета - клеток , выращенного в качестве сфероидов в перемешанной биореактора 39 - 43. Описанный в настоящем документе способ обеспечиваетпростая реализация кормления корректировки курса на основе определения уровня глюкозы в офф-лайн для достижения целевых условий культивирования. Регулировка скорости подачи с помощью этого метода для поддержания физиологического уровня глюкозы показано, что урожайность увеличивается клеток. Клетки млекопитающих , зависят от основным питательным веществом, глюкозу, для выработки энергии, так что использование этой линии клеток представляет собой модель для многих культивируемых клетках млекопитающих 44. Кроме того, эта линия иллюстрирует дальнейшую сложность бета - клеток, которые чувствительны к хроническим высоким уровнем глюкозы 45. Для этого исследования, бета-ТС6 клетки оставляли для формирования сфероидов в культуре , чтобы приблизить средний размер островков Лангерганса в естественных условиях. Система биореактора перфузию 17 - 19,21,46 со скоростью подачи , скорректированной на глюкозу потребления, привело к поддержанию физиологических условий , и более высокие урожаи клеток без изменений в жизнеспособности.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Клеточная линия и техническое обслуживание

  1. Получить бета-ТС6 клетки (или другой требуемый приверженцем линии клеток млекопитающих). В ходе подготовки к исследованию, культуры, прохождение, и криоконсервируют клетки в соответствии с инструкциями поставщика.

2. Собрать Непрерывная система кормления

Примечание: Непрерывная конструкция системы подачи ниже метод был основан на аналогичных системах , описанных в литературе 17 - 19,21,47 - 49. Сборка системы , используемой здесь , подробно описана в предыдущей публикации 3.

  1. Соберите компоненты, необходимые для системы питания, которая состоит из пяти основных компонентов: среда коллектора, перистальтический насос, перемешивают биореакторов, отходы резервуара, и специально разработанные набор трубок / выборки.
    1. Установите средний резервуар с помощью стеклянной бутылке объемом 1 л, резервуар отходов, используя стеклянную бутылку с 2 л, а stirred биореактор с использованием объема стеклянный реактор объемом 250 мл (от версии полке).
    2. Используйте цифровой перистальтический насос или аналогичный насос с головкой 8 канала насоса для контроля среды обмена.
    3. Производство резервуара и модифицированные крышки биореакторе из жесткого и автоклавируемый пластика с трубой из нержавеющей стали сквозная портов, чтобы обеспечить вентиляцию через стерильные фильтры, а также позволяют среды передачи между резервуарами и биореакторах. В качестве альтернативы, приобрести специализированные крышки с портами потока от различных поставщиков.
      Примечание: Крышка биореактор может содержать дополнительные порты сквозная для опционального измерительных приборов и датчиков мониторинга (например, кислород монитор).
    4. Приложить оттоку трубку (OT), изготовленную из пористого стекла аэрационных труб со средним размером пор от 40 мкм до 60 мкм, и плотность пор 40% до модифицированной крышкой ОБП. В качестве альтернативы, выберите другой отток трубки на основе конкретных требований культуры.
      Примечание: ВыберитеOT размер пор для удаления только средних и остатков клеток, в результате чего клеточных агрегатов в культуре (как описано в разделе 6 и публикации 3 для более подробной информации).
  2. Собрать автоклавируемые наборы перфузия трубок из поливинилиденфторида (PVDF) насосно-компрессорных труб и соединителей прочный перистальтический насос. Длина секции зависит от расстояния между различными компонентами.
    Примечание: Соблюдайте особую осторожность при выборе разнообразных труб для обеспечения долговечности и надежности для длительных экспериментов.
  3. Соберите трубки набор из трех частей: питающую линию, линию отходов и образец линии.
    1. Собрать линию подачи с помощью двух трубок диаметра (L / S 14 и L / S 13). С помощью L / S 14 для первичной трубки, которая будет осуществляться расстояние от биореактора средневол- резервуара, и вставить короткую длину L / S 13 в середине длины трубопровода для секции насоса, используя соответствующие PVDF адаптеров.
    2. Используйте стандартный PVDF шланг-колючую TUBIнг адаптеры, чтобы соединить две части L / S 14 трубки с обеих сторон короткой секции насоса (л / с 13) насосно-компрессорных труб.
      Примечание: В качестве альтернативы, вся длина трубки может быть меньше диаметра L / S 13 трубки, а по всей длине трубки могут быть заменены, если целостность насоса сечение находится под вопросом.
  4. Соберите вторую секцию трубопровода для удаления отходов, используя больший диаметр (L / S 16) трубки и вставить короткий отрезок L / S 14 трубки в середине для насосной секции. Это делается таким же образом, как линия подачи в сборе с использованием PVDF шланга колючую адаптеров, или в качестве альтернативы с использованием непрерывной длины требуемого размера насоса насосно-компрессорных труб, и замена при необходимости.
    Примечание: Если тот же насос и напор насоса используются для цепи питания и цепи отходов, секция насоса насосно-компрессорной колонны линий удаления отходов должны быть большего диаметра, чем секции насоса линии подачи. Это гарантирует, что скорость удаления насоса происходит быстрее, чем скорость подачи, и позволит избежать сильнодействующегоIAL для больших изменений объема культуры, а также снизить риск переполнения.
  5. Соберите последний компонент комплекта трубок: узел сбора образца.
    1. Эта процедура описывает пользовательские собранное выборки системы портов; В качестве альтернативы, стерильный порт отбора проб может быть приобретен у различных поставщиков.
    2. Построить набор из трех коротких (~ 6 см) L / S 14 длин труб, соединенных вместе с разъемом PVDF Т-типа, а также два небольших хомутов на двух длин труб.
    3. Приложить стерильный фильтр газа для газовой продувки к одному из зажатого длины, а другая используется для подключения к стерильным шприцем для отбора проб (стерильные газовые фильтры, возможно, должны быть добавлены в шкафу биологической безопасности после стерилизации, как многие стерильные фильтры не являются автоклавируемый).
    4. Подключите третий конец нержавеющей стали соединителем образца, прикрепленной к крышке биореактора.
    5. Автоклава узел отбора проб при подключении к биореакторе до началаэксперимент (обратитесь к шагу 3 ниже).
    6. Используйте эту сборку для сбора стерильных проб из биореактора по мере необходимости, не нарушая процесса непрерывной подачи.

3. автоклавов Все материалы

  1. Подготовьте все компоненты биореактора для стерилизации в автоклаве.
  2. Собрать отдельные компоненты для стерилизации. Средние и отходов резервуары (собранные из стадии 2.1.1), 250 мл вращающаяся колба (собранный из 2.1.1), необходимые модифицированные крышки (собранные из 2.1.3), отток трубки (описанный в 2.1.4), три комплекта трубок ( собраны в разделах 2.2 through2.5), выпускную трубу (по мере необходимости для непрерывной подачи).
    1. Соберите вращающуюся колбу со всеми компонентами и убедитесь, что отток трубки надежно закреплен внутри вращающейся колбе (описано в разделе 2.1.4), и приложите пользовательские собранный порт выборки (раздел 2.5) или другой порт отбора проб в верхней части крышки ,
    2. Оберните всю вращающуюся колбу в сборе с автоклаве обертка материал, и автоклав с указанием ленты. Убедитесь, что упаковка герметична. Примечание: Алюминиевая фольга или подобный материал может быть использован для покрытия отдельных концов каждого порта доступа в крышке биореактора, чтобы сохранить стерильность разъема / заканчивается, когда разворачивание и когда не связанных с наборами трубок внутри инкубатора.
    3. Соберите модифицированные крышки среды и сточных коллекторов, а затем прикрепить к соответствующим стеклянные бутылки. Покройте их с помощью алюминиевой фольги и автоклава с указанием ленты.
    4. Индивидуально обернуть наборы трубок (раздел 2.2 - 2.5) с автоклавной обручем и лентой, чтобы помочь в окончательной сборке. Алюминиевая фольга или подобный материал может быть использован, чтобы обернуть отдельные концы каждой трубки, установленной для сохранения стерильности разъема / заканчивается, когда разворачивание.
    5. Автоклав все обернутые предметы , используя стандартный сухой автоклавный цикл (например, "Гравитация" установка с ~ 15 фунтов на квадратный дюйм при 121 ° С в течение 30 мин или более).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не крепите стерильнаяфильтры перед автоклавированием, если они не будут подтверждены, чтобы быть в автоклаве безопасными.

4. Формирование Сфероид

Примечание: Этот метод аналогичен тем , которые описаны в литературе 17 - 19,21,50 - 52 для других культур клеток млекопитающих. Все процедуры после стерилизации должно быть сделано в колпаке с ламинарным потоком и с применением стерильных перчаток для поддержания стерильных условий для культивирования клеток.

  1. Для всех условий, культуры и расширения β-TC6 клеток в стандартных культурах адгезивных (характеризующегося поставщика) до достаточных количеств клеток получают семян требуемого количества биореакторов.
    1. Соберите непрерывную подачу биореактор с оттоком трубки , как показано на Рисунке 1 и описано в разделе 2, и подключить порт дискретизации к крышке выборки. Примечание: Отток трубка и отбор проб в сборе порт должен быть добавлен к bioreactили для непрерывной подачи до начала сфероида формации, и должен быть исторгаемы из культуральной среды до тех пор, пока не начнется непрерывной подачи.
    2. Стерилизовать модифицированный узел ОБП в автоклаве (описано в разделе 3).
    3. Приложить стерильные отверстия (0,22 мкм или менее стерильные фильтры) в соответствующих местах на крышках вращающуюся колбу и средних и отходов судов.
      Примечание: Это важно для предотвращения паровых пробок, и чтобы позволить газообмен между инкубаторе (2 5% CO) окружающей среды и биореактора. Газообмен необходимо поддерживать правильный рН при использовании бикарбонат-буферные среды.
  2. Собирают клетки путем осторожного трипсином с использованием 0,25% (вес / объем) раствора трипсино 0,53 мМ ЭДТА, при комнатной температуре в помогший механическом перемешивании в течение 2 - 3 мин, и семя в биореакторах при плотности приблизительно 1,3 × 10 6 клеток / мл в 200 мл культуральной среды.
    1. Перемещение назначенных колб из инкубатора ив шкаф биологической безопасности.
      Примечание: Все культуры и манипуляции клеток должно быть сделано в шкафу биологической безопасности с использованием надлежащей стерильной техники.
    2. Удалить из культуральной среды колбах аспирацией.
    3. Промыть клеток с помощью пипетки 5 мл фосфатно - буферного раствора (без Ca ++ или Mg ++), в колбу, и полоскание через клетки на поверхности, а затем отсасывает PBS.
    4. Добавьте 3 мл раствора Трипсин-EDTA в каждую колбу , которая будет собрана ( как правило , примерно в 10 раз 175 см 2 Т-склянки).
    5. Разрешить заготовленные клетки инкубировать при комнатной температуре в течение 2 - 3 мин в шкафу биологической безопасности.
    6. Перемешивайте осторожно вручную, чтобы ослабить клетки с поверхности колбы, и клетки собирают путем добавления 6 мл культуральной среды (с сывороткой) в колбу, и переносят клетки в 50 мл пробирку. Когда один 50 мл трубки заполнена, используют другую порцию 50 мл трубку, пока все необходимые клетки не были собраны (примерно 50 мл трубки будет необходима для каждых 5 Т-175 колбсобраны).
    7. Аккуратно центрифуге (приблизительно 50 х тяжести) собранные клеточные суспензии для осаждения клеток.
    8. Аспирируйте оставшуюся среду, оставляя осадок нетронутыми.
    9. Собирают все клетки в одной пробирке путем ресуспендирования гранул в культуральной среде (содержащей сыворотку крови) с помощью пипетки, и перенос всех гранул в той же трубе.
    10. Подсчитайте плотность клеток с использованием стандартного гемоцитометра с окрашивания трипановым синим , как описано в литературе 53.
    11. Добавьте необходимое количество общего числа клеток в стерильную SSB для каждого условия (1.3 × 10 6 клеток / мл была целевые плотности начальной ячейки для этой демонстрации).
    12. Добавить среду (с желаемой концентрацией глюкозы, в данном случае мы использовали средние уровни глюкозы в пределах физиологического диапазона) для ОБП, с помощью пипетки, чтобы достичь желаемого полный объем культуры (200 мл объема культуры использовали для этих исследований).
      Примечание: Для этих непрерывных сытый ССБ изучает куб ltures были посеяны с использованием модифицированного "с низким содержанием глюкозы" версию культуральной среды (100 мг / дл). Это позволило начать культуры в нужной концентрации глюкозы мишени, а не начинать с "высоким содержанием глюкозы" среды и ждет потребление глюкозы, чтобы довести уровень глюкозы вниз в физиологическом диапазоне, чтобы начать кормление. Все другие носители для кормления в этих исследованиях использовали стандарт "высокого уровня глюкозы" средний (500 мг / дл).
    13. Перемещение ОБП с клетками на мешалке внутри клеточной культуры инкубатора.
  3. Клетки культуры в биореакторах без кормления в течение 3 -х дней при 37 ° C, 5% CO 2, 100% относительной влажности и скорости ротационной 70 оборотов в минуту , чтобы сфероиды в форме.
    Примечание: Никакого значительного распространения не должно наблюдаться в течение трех дней периода формирования сфероида.
  4. После формирования сфероида, делят сфероидов среди биореакторах с заданными условиями культивирования.
ле "> 5. Непрерывная подача Культура и Скорректированный Скорость подачи

  1. Автоклаве или газа стерилизовать все компоненты, и собрать в кабинете биологической безопасности с использованием стерильной техники (шаги 2 - 4).
  2. После формирования сфероида, удалите ОБП из инкубатора и собрать компоненты для системы непрерывной подачи в кабинете биологической безопасности.
    1. Во-первых заполнить резервуар свежую среду с желаемой культуральной среды, а затем подключить к одной стороне питающей линии. Кроме того, убедитесь, что резервуар свежей среды вентилируется со стерильным фильтром.
    2. Подключение одной стороне линии подачи к впускному отверстию подачи на биореакторе в стерильных условиях. Стерильный фильтр должен быть установлен между линией подачи и входной порт биореактор для фильтрации среды перед поступлением в биореактор.
    3. Подключите линию отходов к выпускному биореактор трубки и резервуар среды отходов, а также обеспечить, чтобы резервуар отходов вентилируется с Sterilе фильтра.
  3. Переместить сборку из биологической безопасности кабинета (это, вероятно, потребуется два человека, чтобы нести все сосуды и трубки), и поместить все компоненты за долгосрочной культуры.
    1. Поместите ОБП на мешалке внутри инкубатора с использованием тех же самых параметров культуры для формирования сфероида (37 ° C, 5% CO 2, влажность 100% и 70 оборотов в минуту). Примечание: Может возникнуть необходимость временного отключения сегментов трубок, из биореактора, если линии должны проходить через отверстия в боковой стороне инкубатора, а не через прокладку в двери. Это может быть сделано в асептическом способом, окружив концы комплектов труб с алюминиевой фольгой перед автоклавированием (этап 3), и ждет, чтобы прикрепить биореактора сторону секций подачи и отходов труб до тех пор, биореактор не находится внутри инкубатора. Линии трубку можно поставить на место, а алюминиевая фольга может быть удалена внутри инкубатора и быстро крепится к биореакторе.
    2. Выполнить оставшиеся концы трубок наборов (те, которые не подключены к крышке биореактора) через порт доступа инкубатор (сквозная), либо через прорезь в инкубаторе уплотнителя дверцы.
    3. Вне инкубатора (в соседнем кабинете биологической безопасности, если это возможно), быстро подключить линию подачи к свежей среде резервуара, а линия отходов в резервуар среды отходов, а также обеспечить, чтобы резервуар отходов вентилируется со стерильным фильтром. Примечание: Для того, чтобы сделать это в асептической образом, удалить алюминиевую фольгу из насосно-компрессорных труб и соединителей судов и подключить к соответствующим судам как можно быстрее (особенно, если это соединение должно быть сделано за пределами кабинета биологической безопасности).
    4. Положите свежую среду резервуар (заполненный желаемой средой подачи) внутри соседнего мини-холодильник. Проверьте, чтобы убедиться, что корма и отходы линии способны выйти из инкубатора и войти в холодильник, не мешая двери на каждом из закрытия. Также важно, чтобы подача лИнес не были зажаты закрыты двери либо холодильника или в инкубаторе.
      Примечание: Среда, используемая для этих исследований был стандартным с высоким содержанием глюкозы (500 мг / дл), культуральная среда рекомендованные производителем для этого типа клеток. Любая высокая средняя глюкоза может быть использована на основе конкретных потребностей типа клеток культивируются. Концентрация глюкозы в питательной среде, должна быть достаточно выше (2x или более), чем желаемая концентрация в культуре, как система подачи опирается на повышение скорости подачи высокой среде глюкозы для поддержания необходимого уровня глюкозы в культурах, сохраняя при этом приемлемые скорости подачи ,
    5. Затем среда отходов резервуар можно поставить на скамье вне инкубатора в удобном месте.
    6. Затем поместите "секция насоса" подающих и отходов линий в головку насоса, обеспечивающего надлежащую ориентацию так, чтобы питающие линии будут перекачивать среды из свежей среды резервуара в SSB, а линии отходовбудет качать среду из SSB и к среде отходов резервуара.
  4. Включите насос на требуемой скорости подачи.
    1. Вычислить скорость подачи с помощью уравнения скорректированной скорости подачи , описанных в литературе 3 и в соответствующем разделе репрезентативные результаты ниже.
    2. Используйте самую последнюю информацию подсчета клеток (процедура описана в пункте 5), наряду с прогнозом роста, а также измерения глюкозы средних для оценки скорости подачи, необходимой для поддержания нужной концентрации глюкозы в культуре.
      Примечание: Темпы роста клеток и глюкозы нормы потребления должны быть получены до выполнения этих процедур.
    3. Установить скорость насоса на основе расчетной скорости подачи.
  5. Повторите вычисление скорости подачи и регулировки скорости насоса для каждой точки отбора проб (каждые три дня описанного метода).

6. Количество клеток, Жизнеспособность и глюкозы измерений концентрации

<ол>
  • Сбор образцов из каждой биореактор каждые три дня, или по желанию.
  • Отбирают образцы культуры из непрерывно подают культур SSB с использованием специализированного порта выборки, описанной выше.
    1. Оставив непрерывно подают SSB внутри биореактора, приложите стерильный шприц (5 мл объема шприц использовался для этих исследований), чтобы отменить его фильтрованное соединения порта выборки.
    2. Переместить пробоотборную трубку вниз в культуральную среду.
    3. Освободить раздел трубку, идущую к шприцу, и вывести требуемый общий объем выборки.
    4. Передвигайте выборки трубки таким образом, чтобы он больше не погружен в культуру, и продолжают снимать шприц, пока воздух не будет удален.
    5. Зажмите трубку, которая питает шприц, и отсоединить шприц, содержащий образец, и отложить в сторону.
    6. Предзагрузить второй свежий стерильный шприц с воздухом, и прикрепить к стерильную фильтровальную стороне порта для отбора проб.
    7. Освободить в трубку, идущую в сторону шприц-фильтрапорт отбора проб, а затем продуть отверстие для взятия проб, осторожно вытесняя воздух в шприц через стерильный фильтр. Это гарантирует, что порт выборки будет ясно из любой остаточной среды.
    8. Повторно зажать трубку, идущую к фильтру, отсоедините стерильный шприц и выбросьте его.
  • Возьмите шприц, содержащий образец клеток из культуры, и выталкивать его в 10 мл пробирку. Подвыборках известных объемов могут быть взяты непосредственно из этой трубки.
  • Для подсчета клеток, удалить известный объем клеток и переносят в микро-центрифужную пробирку и осторожно центрифугировать в течение 1 - 2 мин (приблизительно 50 х гравитации).
  • Передача супернатант в отдельную пробирку для определения уровня глюкозы в, и повторно приостанавливать осадок с таким же объемом трипсин-ЭДТА раствором (0,25% (вес / об) трипсин, 0,53 мМ ЭДТА), и рассчитывать в трех экземплярах с использованием стандартного гемоцитометра с окрашивания трипановым синим , как описано в литературе 53.
    1. Добавить среду (с сывороткой) вобразец для разбавления по мере необходимости.
    2. Граф клеток, и рассчитать жизнеспособность клеток путем записи в реальном времени (неокрашенных) клеток, и мертвые (тонированный) клетки независимо друг от друга (жизнеспособность% = живые клетки / общее количество клеток).
  • Измерение среднего уровня глюкозы в трех экземплярах с помощью глюкометра и для однократного применения тест-полосок.
    1. Возьмите глюкозы измерения, как описано в инструкции глюкозы метр, замещающих культуральной среды для крови.
    2. Опустите тест-полоску в среде тестируемой (собранной из образцов количества выше), и повторить для требуемого количества повторов (рекомендуется три повторности).
    3. Проверьте как свежую среду и среду для отходов концентрации глюкозы.
      Примечание: Для некоторых метров, измерения ниже, чем 20 мг / дл (обнаруживаемый порог счетчика), можно наблюдать, как ошибка в выходном сигнале счетчика.

    • 7. сфероида Измерения Скорость отстаивания

    1. Для того, чтобы гарантировать, что CELл кластеры не удаляются с помощью системы непрерывной подачи, измеряют скорость осаждения бета-ТС6 сфероидов путем наблюдения за их оседание в большом пластиковом диаметра пипетки.
    2. Культура бета-TC6 клетки в ОБП биореакторах с образованием сфероидов, как описано выше.
    3. После 3-х дней культивирования, принимать по 30 мл пробы сфероида суспензии, и место в 50 мл трубки.
    4. Аккуратно пипеткой вверх и вниз , используя широкий диаметр 25 мл пипетки равномерно распределить в виде суспензии, а затем прекратить пипетирования с подвеской на известном уровне в пипетку (например, 20 мл марка), а затем записать время для всех сфероидов в оседать на 5 см.
    5. Повторите эту процедуру достаточное количество раз, чтобы достичь статистической достоверности (обычно п> 3).
      Примечание: Для биологических исследований, значение ар меньше, чем 0,05 считается статистически значимым при сравнении результатов измерений. Стандартная ошибка среднего значения использовали для сообщения об ошибках, а также два хвостами не-тест в паре студент-тиспользовали для сравнения условий для представленных данных.

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Результаты

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Средние уровни глюкозы и Флуктуации Ограничить клеток Расширение в стандартных ОБП культур

    Уровни глюкозы колеблются в статических культурах и ОБП культур в течение всего периода культивирования 3. Эти колебания усиливаются с увеличением числа клеток в течение периода культивирования 21-дневного и были почти идентичны в обоих статических и ОБП культур. Эти наблюдения представлены в нашей предыдущей публикации 3. Уровни глюкозы могут быть супер-физиологи...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Обсуждение

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Генерирующее клеток млекопитающих для производства биологических агентов и для клеточной терапии требует культуры и мониторинга клеток млекопитающих в больших масштабах 55 - 58. Кроме того, эти приложения требуют определенных и обоснованных условий культивирования. Простое увеличение объема клеток с использованием научно-исследовательских технологий не будет отвечать всем этим требованиям. Ручные изменения средних вызывающие колебания питательных веществ и накоплению продуктов жизнедеяте...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Раскрытие информации

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Авторам нечего раскрывать.

    Благодарности

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Авторы благодарят Майкла Гарвуда и Сэма Стейна за их полезные комментарии, а также Кристен М. Мейнард за помощь в подготовке рукописи.

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Материалы

    Список материалов, использованных в этой статье
    ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
    β TC-6 CellsATCC, Manassas, VACRL-11506Линия клеток инсулиномы мыши (тип адгезивных клеток)
    DPBS No Ca, No MgInvitrogen, Carlsbad, CA14190-144https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144? ICID=search-14190144
    Dulbecco's Modified Eagles MediumInvitrogen, Карлсбад, КалифорнияСмотрите ниже номера продуктов 
    DMEM High Glucose (500 mM)Invitrogen, Carlsbad, CA11965-092http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092
    DMEM Low Glucose (100 mM)Invitrogen, Carlsbad, CA11885-084http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084 (обратите внимание, что эта среда уже содержит пируват)
    L-glutamineInvitrogen, Carlsbad, CA25030081http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081? ICID=search-product
    Sodium PyruvateInvitrogen, Carlsbad, CA11360070https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070? ICID=search-product
    Термоинактивированная сыворотка свинейGibco - Life Technologies10082147http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147
    Trypsin-EDTAInvitrogen, Carlsbad, CA25200056https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056? ICID=search-product
    T-150 Колбы, обработанные культурой тканейCorning, Corning, NY430825 http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=430825(Lifesciences)
    & categoryname=
    Инкубатор клеточных культур NuAireПринстон, МиннесотаСША Autoflow. Можно использовать любой инкубатор с водяной рубашкой CO2 регулирующий клеточные культуры.
    ЦентрифугаSorvall RT 7 (можно использовать любую аналогичную настольную центрифугу
    ХолодильникМожно использовать любой лабораторный холодильник (для этих исследований использовалась небольшая настольная версия)
    1 л Стеклянная бутылкаCorning, Corning, NY1395-1LМожно использовать любого поставщика. http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=1395-1L(Медико-биологические науки)
    и categoryname=
    2 л Стеклянная бутылкаCorning, Corning, NY1395-2LЛюбой поставщик может использовать
    биореакторы с перемешиванием 250 мл Corning, Corning, Нью-Йорк4500-250http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=4500-250(Медико-биологические науки)
    & categoryname=
    Тарелка для перемешиванияFisher Scientific11-496-104AМожно использовать любую безопасную тарелку для перемешивания в инкубаторе, любого поставщика
    Чашки для культуры тканей диаметром 100 мм, Рочестер, Нью-Йорк (Fisher Scientific)1256598 Можно использовать любого продавца (заказывать через Fisher Sci)
    FALCON 50 мл Конические трубкиFalcon, Сан-Хосе, Калифорния1256598Любой поставщик может быть использован
    Пластик Delran Используется для изготовления нестандартных деталейMcMaster CarrРазличныеМожно использовать любой материал по выбору, но Deran выбран, потому что он безопасен для автоклавов, не реагирует и легко поддается обработке. http://www.mcmaster.com/#acetal-homopolymer-sheets/=rjrcac
    Труба из нержавеющей стали для нестандартных крышекMcMasterCarr РазличныеМожно использовать любого поставщика. http://www.mcmaster.com/#standard-stainless-steel-tubing/=rjrd91
    Изготовленные на заказ модифицированные крышки биореактора Delran для непрерывного кормлениязаказНе известно о каких-либо поставщиках, производящих аналогичный продукт
    Изготовленные на заказ стеклянные крышки от бутылок для непрерывного кормленияна заказ Некоторыепоставщики (например, , Fischer Sci, Corning) производят аналогичные продукты по ссылкам ниже.
    Цифровой перистальтический насос MasterflexCole Parmer, Vernon Hills, ILEW-77919-25Можно использовать любой прецизионный перистальтический насос. http://www.coleparmer.com/Product/L_S_Eight_Channel_Four_Roller_
    Cartridge_Pump_System_115_230
    _VAC/EW-77919-25
    Соединительные трубки PVDF (разные)Cole Parmer, Вернон Хиллз, Иллинойссм. ссылкуМожно использовать любого поставщика. http://www.coleparmer.com/Category/Cole_Parmer_PVDF_Premium
    _Luer_Fittings/55889
    Фармированная трубка BPT L/S 16Cole Parmer, Вернон Хиллз, ILWU-06508-16Можно использовать любого поставщика. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing<чел/> _L_S_13_25/WU-06508-16
    Фармированная трубка BPT L/S 14Cole Parmer, Vernon Hills, ILWU-06508-14Можно использовать любого поставщика. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
    _L_S_13_25/WU-06508-14
    Фармированная трубка BPT L/S 13Cole Parmer, Vernon Hills, ILWU-06508-13Можно использовать любого поставщика. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
    _L_S_13_25/ WU-06508-13
    Миллипор Millex GP PES мембрана 0.22 µ l стерильный шприцевой фильтр (используется для вентиляции и фильтрации среды)Fisher ScientificSLGP033RSЛюбой поставщик может быть использован
    25 мл Градуированная пипеткаFisher Scientific13-678-11Может быть использован любой поставщик, и могут быть использованы различные размеры
    PipetterFisher Scientific13-681-15EЛюбой поставщик или аналогичный продукт может быть использован
    ГемоцитометрFisher Scientific02-671-6Любой поставщик или аналогичный продукт может быть использован
    Trypan BlueGibco - Life Technologies15250-061Может быть использован любой поставщик или аналогичный продукт. https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15250061
    Микроскоп с инвертированным светомLeicaЛюбой поставщик или аналогичный продукт может быть использован
    Глюкометр One Touch UltraFisher Scientific22-029-293Может быть использован любой поставщик или аналогичный продукт (<>например, Bayer)
    One Touch Ultra-StripsFisher Scientific22-029-292 Может быть использован любой поставщик или аналогичный продукт (<например>например, Bayer)
    , ) Изготовлено на

    Ссылки

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Reuveny, S., Velez, D., Macmillan, J. D., Miller, L. Factors affecting cell growth and monoclonal antibody production in stirred reactors. J. Immunol. Methods. 86 (1), 53-59 (1986).
    2. Tarleton, R. L., Beyer, A. M. Medium-scale production and purification of monoclonal antibodies in protein-free medium. Biotechniques. 11 (5), 590-593 (1991).
    3. Weegman, B. P., et al. Nutrient regulation by continuous feeding removes limitations on cell yield in the large-scale expansion of Mammalian cell spheroids. PLoS One. 8 (10), e76611(2013).
    4. Klueh, U., et al. Continuous glucose monitoring in normal mice and mice with prediabetes and diabetes. Diabetes Technol. Ther. 8 (3), 402-412 (2006).
    5. Hay, R. J. Operator-induced contamination in cell culture systems. Dev. Biol. Stand. 75, 193-204 (1991).
    6. Dazey, B., Duchez, P., Letellier, C., Vezon, G., Ivanovic, Z. Cord blood processing by using a standard manual technique and automated closed system "Sepax" (Kit CS-530). Stem Cells Dev. 14 (1), 6-10 (2005).
    7. Gastens, M. H., et al. Good manufacturing practice-compliant expansion of marrow-derived stem and progenitor cells for cell therapy. Cell Transplant. 16 (7), 685-696 (2007).
    8. Naing, M. W., Williams, D. J. Three-dimensional culture and bioreactors for cellular therapies. Cytotherapy. 13 (4), 391-399 (2011).
    9. Stacey, G. N. Cell culture contamination. Cancer Cell Culture. , Methods Mol Biol; 731. Humana Press. Totowa, NJ. 79-91 (2011).
    10. Zur Nieden, I. N., Cormier, J. T., Rancourt, D. E., Kallos, M. S. Embryonic stem cells remain highly pluripotent following long term expansion as aggregates in suspension bioreactors. J. Biotechnol. 129 (3), 421-432 (2007).
    11. Kehoe, D. E., Jing, D., Lock, L. T., Tzanakakis, E. S. Scalable stirred-suspension bioreactor culture of human pluripotent stem cells. Tissue Eng. Part A. 16 (2), 405-421 (2010).
    12. Krawetz, R., et al. Large-scale expansion of pluripotent human embryonic stem cells in stirred-suspension bioreactors. Tissue Eng. Part C. Methods. 16 (4), 573-582 (2010).
    13. Shafa, M., et al. Expansion and long-term maintenance of induced pluripotent stem cells in stirred suspension bioreactors. J. Tissue Eng. Regen. Med. 6 (6), 462-472 (2012).
    14. Oh, S. K. W., et al. Long-term microcarrier suspension cultures of human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 2 (3), 219-230 (2009).
    15. Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors. Tissue Eng. Part C. Methods. 18 (10), 772-784 (2012).
    16. Baptista, R. P., Da Fluri,, Zandstra, P. W. High density continuous production of murine pluripotent cells in an acoustic perfused bioreactor at different oxygen concentrations. Biotechnol. Bioeng. 110 (2), 648-655 (2013).
    17. Papas, K. K. Characterization of the metabolic and secretory behavior of suspended free and entrapped ART-20 spheroids in fed-batch and perfusion cultures [dissertation]. , Georgia Institute of Technology. Atlanta, GA. (1992).
    18. Papas, K. K., Constantinidis, I., Sambanis, A. Cultivation of recombinant, insulin-secreting AtT-20 cells as free and entrapped spheroids. Cytotechnology. 13 (1), 1-12 (1993).
    19. Sambanis, A., Papas, K. K., Flanders, P. C., Long, R. C., Kang, H., Constantinidis, I. Towards the development of a bioartificial pancreas: immunoisolation and NMR monitoring of mouse insulinomas. Cytotechnology. 15 (1-3), 351-363 (1994).
    20. Sharma, S., Raju, R., Sui, S., Hu, W. -S. Stem cell culture engineering - process scale up and beyond. Biotechnol. J. 6 (11), 1317-1329 (2011).
    21. Papas, K. K., Long, R. C., Constantinidis, I., Sambanis, A. Role of ATP and Pi in the mechanism of insulin secretion in the mouse insulinoma betaTC3 cell line. Biochem. J. 326 (Pt 3), 807-814 (1997).
    22. Papas, K. K., Long, R. C., Sambanis, A., Constantinidis, I. Development of a bioartificial pancreas: I. long-term propagation and basal and induced secretion from entrapped betaTC3 cell cultures. Biotechnol. Bioeng. 66 (4), 219-230 (1999).
    23. Papas, K. K., Long, R. C., Sambanis, A., Constantinidis, I. Development of a bioartificial pancreas: II. Effects of oxygen on long-term entrapped betaTC3 cell cultures. Biotechnol. Bioeng. 66 (4), 231-237 (1999).
    24. Hu, W. S. Cell culture process monitoring and control-a key to process optimization. Cytotechnology. 14 (3), 155-156 (1994).
    25. Alfred, R., et al. Efficient suspension bioreactor expansion of murine embryonic stem cells on microcarriers in serum-free medium. Biotechnol. Prog. 27 (3), 811-823 (2011).
    26. Cormier, J. T., zur Nieden, N. I., Rancourt, D. E., Kallos, M. S. Expansion of undifferentiated murine embryonic stem cells as aggregates in suspension culture bioreactors. Tissue Eng. 12 (11), 3233-3245 (2006).
    27. Dang, S. M., Zandstra, P. W. Scalable production of embryonic stem cell-derived cells. Methods Mol. Biol. 290 (1), 353-364 (2005).
    28. Elseberg, C. L., et al. Microcarrier-based expansion process for hMSCs with high vitality and undifferentiated characteristics. Int. J. Artif. Organs. 35 (2), 93-107 (2012).
    29. Kallos, M. S., Behie, L. A. Inoculation and growth conditions for high-cell-density expansion of mammalian neural stem cells in suspension bioreactors. Biotechnol. Bioeng. 63 (4), 473-483 (1999).
    30. Kehoe, D. E., Lock, L. T., Parikh, A., Tzanakakis, E. S. Propagation of embryonic stem cells in stirred suspension without serum. Biotechnol. Prog. 24 (6), 1342-1352 (2008).
    31. Kirouac, D. C., Zandstra, P. W. The systematic production of cells for cell therapies. Cell Stem Cell. 3 (4), 369-381 (2008).
    32. Serra, M., et al. Stirred bioreactors for the expansion of adult pancreatic stem cells. Ann. Anat. 191 (1), 104-115 (2009).
    33. Chawla, M., Bodnar, C. A., Sen, A., Kallos, M. S., Behie, L. A. Production of islet-like structures from neonatal porcine pancreatic tissue in suspension bioreactors. Biotechnol. Prog. 22 (2), 561-567 (2006).
    34. Weegman, B. P., et al. Temperature profiles of different cooling methods in porcine pancreas procurement. Xenotransplantation. , (2014).
    35. Cruz, H. J., Moreira, J. L., Carrondo, M. J. Metabolic shifts by nutrient manipulation in continuous cultures of BHK cells. Biotechnol. Bioeng. 66 (2), 104-113 (1999).
    36. Dowd, J. E., Jubb, A., Kwok, K. E., Piret, J. M. Optimization and control of perfusion cultures using a viable cell probe and cell specific perfusion rates. Cytotechnology. 42 (1), 35-45 (2003).
    37. Goudar, C., Biener, R., Zhang, C., Michaels, J., Piret, J., Konstantinov, K. Towards industrial application of quasi real-time metabolic flux analysis for mammalian cell culture. Cell Culture Engineering. 101, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol; 101. Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. 99-118 (2006).
    38. Hu, W. S., Piret, J. M. Mammalian cell culture processes. Curr. Opin. Biotechnol. 3 (2), 110-114 (1992).
    39. Knaack, D., et al. Clonal insulinoma cell line that stably maintains correct glucose responsiveness. Diabetes. 43 (12), 1413-1417 (1994).
    40. Poitout, V., Stout, L. E., Armstrong, M. B., Walseth, T. F., Sorenson, R. L., Robertson, R. P. Morphological and functional characterization of beta TC-6 cells--an insulin-secreting cell line derived from transgenic mice. Diabetes. 44 (3), 306-313 (1995).
    41. Poitout, V., Olson, L. K., Robertson, R. P. Insulin-secreting cell lines: classification, characteristics and potential applications. Diabetes Metab. 22 (1), 7-14 (1996).
    42. Suzuki, R., et al. Cyotomedical therapy for insulinopenic diabetes using microencapsulated pancreatic beta cell lines. Life Sci. 71 (15), 1717-1729 (2002).
    43. Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research. ALTEX. 27 (2), 105-113 (2010).
    44. Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nat. Protoc. 2 (9), 2276-2284 (2007).
    45. Murdoch, T. B., McGhee-Wilson, D., Shapiro, A. M. J., Lakey, J. R. T. Methods of human islet culture for transplantation. Cell Transplant. 13 (6), 605-617 (2004).
    46. Woodside, S. M., Bowen, B. D., Piret, J. M. Mammalian cell retention devices for stirred perfusion bioreactors. Cytotechnology. 28 (1-3), 163-175 (1998).
    47. Serra, M., et al. Improving expansion of pluripotent human embryonic stem cells in perfused bioreactors through oxygen control. J. Biotechnol. 148 (4), 208-215 (2010).
    48. Gálvez, J., Lecina, M., Solà, C., Cairó, J., Gòdia, F. Optimization of HEK-293S cell cultures for the production of adenoviral vectors in bioreactors using on-line OUR measurements. J. Biotechnol. 157 (1), 214-222 (2012).
    49. Trabelsi, K., Majoul, S., Rourou, S., Kallel, H. Development of a measles vaccine production process in MRC-5 cells grown on Cytodex1 microcarriers and in a stirred bioreactor. Appl. Microbiol. Biotechnol. 93 (3), 1031-1040 (2012).
    50. Liu, H., et al. A high-yield and scaleable adenovirus vector production process based on high density perfusion culture of HEK 293 cells as suspended aggregates. J. Biosci. Bioeng. 107 (5), 524-529 (2009).
    51. Zhi, Z., Liu, B., Jones, P. M., Pickup, J. C. Polysaccharide multilayer nanoencapsulation of insulin-producing beta-cells grown as pseudoislets for potential cellular delivery of insulin. Biomacromolecules. 11 (3), 610-616 (2010).
    52. Lock, L. T., Laychock, S. G., Tzanakakis, E. S. Pseudoislets in stirred-suspension culture exhibit enhanced cell survival, propagation and insulin secretion. J. Biotechnol. 151 (3), 278-286 (2011).
    53. Marchenko, S., Flanagan, L. Counting human neural stem cells. J. Vis. Exp. (7), e262(2007).
    54. Campos, C. Chronic hyperglycemia and glucose toxicity: pathology and clinical sequelae. Postgrad. Med. 124 (6), 90-97 (2012).
    55. Eve, D. J., Fillmore, R., Borlongan, C. V., Sanberg, P. R. Stem cells have the potential to rejuvenate regenerative medicine research. Med. Sci. Monit. 16 (10), RA197-RA217 (2010).
    56. Hsiao, L. -C., Carr, C., Chang, K. -C., Lin, S. -Z., Clarke, K. Review Article: Stem Cell-based Therapy for Ischemic Heart Disease. Cell Transplant. , (2012).
    57. Oldershaw, R. A. Cell sources for the regeneration of articular cartilage: the past, the horizon and the future. Int. J. Exp. Pathol. 93 (6), 389-400 (2012).
    58. De Coppi, P. Regenerative medicine for congenital malformations. J. Pediatr. Surg. 48 (2), 273-280 (2013).
    59. Tziampazis, E., Sambanis, A. Modeling of cell culture processes. Cytotechnology. 14 (3), 191-204 (1994).
    60. Sidoli, F. R., Mantalaris, A., Asprey, S. P. Modelling of Mammalian cells and cell culture processes. Cytotechnology. 44 (1-2), 27-46 (2004).
    61. Yim, R. Administrative and research policies required to bring cellular therapies from the research laboratory to the patient’s bedside. Transfusion. 45, Suppl 4. 144S-158S (2005).
    62. Fink, D. W. FDA regulation of stem cell-based products. Science. 324 (5935), 1662-1663 (2009).
    63. Moos, M. Stem-cell-derived products: an FDA update. Trends Pharmacol. Sci. 29 (12), 591-593 (2008).

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Перепечатки и разрешения

    Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

    Запросить разрешение

    Теги

    Похожие статьи