Методическая статья

Быстрое Фракционирование и выделение целых компонентов крови в образцах, полученных из Окружение сообщества, основанного

16.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52227

⸱

30 ноября 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Carl R. Woese Institute for Genomic Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Epidemiology, Gillings School of Global Public Health, University of North Carolina, 4Department of Psychology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 5Department of Epidemiology, Mailman School of Public Health, Columbia University, 6Department of Epidemiology, University of Michigan School of Public Health, 7Center for Molecular Medicine and Genetics, Wayne State University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем методологию обработки цельной крови для получения различных компонентов для дальнейшего анализа. Мы оптимизировали оптимизированный протокол, который обеспечивает быструю и высокопроизводительную одновременную обработку образцов цельной крови в неклинических условиях.

Аннотация

Сбор и обработка образцов цельной крови в не-клинической предлагает уникальную возможность оценить общинных жилых лиц, так и без существовавшие ранее условиях. Быстрая обработка этих образцов необходимо избежать деградации ключевых клеточных компонентов. Сюда относятся методы для одновременного периферической крови мононуклеаров клетки (РВМС), ДНК, РНК и изоляция сыворотки от одного взятия крови выполняется в домах по обоюдному согласию участников по столичной области, с обработкой начато в течение 2 ч сбора. Мы использовали эти методы, чтобы обработать более 1600 образцов крови уступая последовательным, высокое качество материалов, которые впоследствии были использованы в успешной метилирования ДНК, генотипирование, экспрессия генов и проточной цитометрии анализа. Некоторые из методов, используемых стандартные; Однако при сочетании описанным способом, они позволяют эффективную обработку образцов из участников общей направленности и / или от сообществаИсследования, проведенные в которые обычно не быть оценены в клинических условиях. Таким образом, этот протокол имеет потенциал, чтобы получить образцы (и впоследствии данных), которые более представительным населения в целом.

Введение

Многочисленные исследования характеризуется различия в экспрессии генов, метилирование ДНК и клеточного подмножества в крови среди лиц с и без умственной (или другой) болезни 1-4. Эти исследования, однако, были получены из клинических условий, в которых различия связанных с заболеванием может быть увеличено за счет общем более тяжелым характером заболеваний, для которых пациенты, нуждающихся в лечении. Благодаря достижениям в области "omics" подходов, в последнее десятилетие наблюдается взрыв интереса в получении биологических образцов из сообщества и / или эпидемиологических параметров 5-7, для того, чтобы обеспечить население на основе оценки распространенности заболевания и широкую картину из экологические детерминанты этих психических и / или соматических заболеваний.

Основной проблемой в этой связи является требование для быстрой обработки собранных образцов. Деградация мононуклеарных клеток, ключевых компонентов иммунной системы, которые frequentlу используется для оценки здоровья индивида, начинается сразу же после взятия крови со значительным снижением в восстановлении после 2 часов сбора 8-10. Для решения этой проблемы, мы представляем оптимизированный протокол, в котором несколько компонентов цельной крови человека одновременно изолирован от образцов, полученных в домах субъектов, живущих в большом столичном районе. Протокол основан на нашей компиляции и модификации современных методов, в том числе хранения всех «лишних» фракций в случае будущих методы позволяют для дальнейшей изоляции / анализов. В то время как альтернативные методы или комплекты могут быть использованы вместо отдельных методов, описанных здесь, которые изложены оказались надежным и эффективным средством для обработки образцов в высокой пропускной образом. Высококачественные фракции (МНПК, ДНК, сыворотки, и РНК) свежей крови может быть произведено в течение 2 ч сбора и анализа всех готовых образцов могут быть доступны в течение 2 дней (рис 1).

Этот протокол был разработан для того, чтобы эффективно обрабатывать образцов, взятых из сообщества-жилище, взрослых жителей города Детройта для тестирования в Детройте соседства изучения здравоохранения (DNHS; DA022720, RC1MH088283, DA022720-05-S1), А на основе популяционных Изучение социальных и биологических детерминант посттравматического стрессового расстройства (ПТСР) и других психических заболеваний. Распространенность ПТСР в Детройте более чем в два раза в среднем по стране 11,12. Определение биологических детерминант ПТСР в этой группе населения может помочь разработать соответствующие фармакологические и / или когнитивно-поведенческие вмешательства, чтобы помочь тем, кто страдает от расстройства, как в этом городское население, и в других популяциях высокого риска (например, возвращение военных ветеранов). Наша лаборатория, ранее расположенный в Wayne State University в Детройте, штат Мичиган, был выбран для обработки на основе нашего опыта в работе с образцами тканей, полученных свежие из различныхисточников, необходимость начать обработку образцов в 2 ч сбора, и наша близость к местам сбора. С этой уникальной возможностью в стороны, наша цель в том, чтобы оптимизировать обработку для наибольшей урожайности ДНК, РНК, сыворотки и мононуклеарных клеток периферической крови (МНПК) из каждого образца (в общей сложности N = 1639 образцов в течение 5 волн сбора образца). Процедуры, описанные здесь, могут быть выполнены одновременно в не-клинической, таким образом производя исходного материала (см таблицу 1 для средней урожайности) для множества последующих применений, включая микрочипов, эпигенетические, в режиме реального времени RT-PCR, и проточной цитометрии анализа.

figure-introduction-1
Рисунок 1. Общая поток работы. В целом, процесс изображен здесь включает в себя логистику получения образцов крови от идентификации попустительство учаipants в крови обратить себя. Высокое качество, фракции (одноядерные клетки периферической крови; МНПК, ДНК, сыворотки, и РНК) свежего цельной крови может быть произведено в течение 2 ч сбора и анализа всех готовых образцов могут быть доступны в течение 2 дней. Кроме того, фракции, полученные с помощью этого метода пригодны для длительного хранения, если образцы не должны быть проверены немедленно. Вся шкала изложил здесь может быть завершена в течение одного дня (~ 5 ч) общего. Тем не менее, в такой день было бы крайне трудоемким, особенно для одного специалиста с большим опытом с методами. Таким образом, мы рекомендуем деления процедуры на 1 день по меньшей мере между двумя техниками и завершения обработки РНК в День 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Здоровье Исследование Детройт Район был рассмотрен и утвержден в университете Institutional Review Board Мичигана. Все участники представили информированное согласие до их участия в исследовании.

1. Обзор

  1. Правильно документировать все этапы от набора с помощью анализа данных конечной точки. Выполните протоколы на 1 день одновременно, переключение ступеней и перекрытия, как позволит время. Последовательность этапов написано для оптимизации эффективности работы. Рисунок 1 дает обзор всего процесса.
    Примечание: Термин "участник" используется на протяжении, чтобы показать образец крови де-определены обращается с них согласия человека. Время в скобках ниже, показывают, руки-на время. Примеры отслеживания листа и журнал образца можно найти в дополнительных таблицах S1 и S2 соответственно. Образцы собирают в домах Phlebotomistsлиц, определенных в качестве согласию участников координатором исследования и транспортируется в лабораторию курьером (см дополнительную информацию (SI) 1 для более подробной информации предварительной обработки).

2. День 1 Настройка

  1. Подготовьте 1x фосфатно-солевом буфере (PBS).
  2. Разогреть нагревательный блок до 56 ° C.
  3. Подготовка протеазы (см SI 2) аликвоты по 20 мкл в соответствующее число микропробирок для поставок этого дня (2 на каждого участника).
  4. Убедитесь, буферы AW1 и AW2 (буферы мыть, предусмотренные в комплекте изоляции ДНК, которые увеличивают чистоту ДНК) готовы к использованию, добавив 100% этанола, как указано на этикетке, если это необходимо.
  5. Охладить охлаждаемой центрифуге до 4 ° С.
  6. Заменить крышку на бутылке 1x PBS с указанной каучуковой перегородкой крышкой и проколет резиновую перегородку с передачей шипа, сохраняя винтовую крышку на верхней части передачи SPIке, чтобы предотвратить испарение. Повторите с бутылкой решения стабилизации РНК.
  7. После подготовки буферов, центрифуги и тепловой блок, документировать время доставки Vacutainer на отслеживая образец листа (см таблицу SI).

3. День 1: Обработка образца цельной крови для ДНК, МНПК и лейкоцитов РНК (2 ч)

  1. Обзор
    1. Выделит достаточное время, чтобы свести к минимуму задержку между ничьей крови и начала обработки времени. Начало обработку Ficoll содержащих vacutainers течение 2 ч розыгрыша крови, чтобы избежать увеличения загрязнения эритроцитов и уменьшение мононуклеарных клеток восстановления.
    2. Предположим, коллекцию 2 vacutainers, содержащих гель градиента Ficoll, 2 К 2 этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) vacutainers, и 1 в сыворотке крови Vacutainer на взрослого участника. При сдаче vacutainers в лабораторию, есть техник подписать отслеживания лист означающий принятие образцов. Очень прошув обработке сразу с временем начала документально на основе на Vacutainer на журнал образца.
  2. Сыворотка Выделение Стадия 1 (1 мин)
    1. Документ время начала на журнал образца (см таблицу SI 2). Центрифуга (с тормозом и ускорения OFF) 7,0 мл сыворотки (красный) Vacutainer (1 на каждого участника), используя ротор Бакет с аэрозольными колпачками (уровень биобезопасности 2; BSL2 сертифицированной) в течение 20 мин, 1300 XG, 4 ºC.
  3. Выделение ДНК Стадия 1 (15 мин)
    Примечание: Для получения дополнительной информации об этой процедуре изоляции, см протокол производителя 13.
    1. Документ время начала. В капотом BSL2 клеточной культуре, инвертировать vacutainers содержащего гель Ficoll 5 раз затем добавить 200 мкл цельной крови из верхней части одной из vacutainers в каждую из двух 20 мкл аликвоты протеазы (400 мкл общего объема каждого участника). Оставив протеазы + микроцентрифужных трубки крови в капюшоне, по-прежнему в Centrifugation из фиколлом содержащей vacutainers в шаге 3.4.1.
      Примечание: Используйте Vacutainer с наибольшим объемом сбора, имея в виду необходимость балансирования центрифуги (т.е., это может быть необходимо, чтобы удалить 200 мкл каждой из двух vacutainers), когда спиннинг vacutainers в шаге 3.4.1. Кроме того, чтобы обеспечить надлежащее разделение в процессе обработки голубых vacutainers, уровень крови, оставшейся в Vacutainer не должно быть меньше, чем 2,5 дюйма над слоем Ficoll.
  4. РВМС изоляции Стадия 1 (1 мин)
    1. Документ время начала (должен быть в пределах 2 ч розыгрыша крови, чтобы избежать увеличения загрязнения эритроцитов в крови и снижение в мононуклеарных клеток) восстановления .Invert в фиколлом содержащий vacutainers 8-10 раз. Центрифуга (с тормозом и ускорения Выкл) vacutainers (2 на каждого участника), используя ротор Бакет с аэрозольными колпачками (BSL2 сертифицирована) в течение 30 мин, 1600 мкг, 22 ° C.
    5. Изоляция ДНК Этап 2 (20 мин)
    1. Возврат к капоту и добавить 200 мкл буфера AL каждому из протеазы + в крови микропробирок (этап 3.3.1). Крышка, удалить из капотом, вихревой 15 сек и флэш-спин.
    2. Выдержите 56 ºC в тепловой блок, 10 мин.
    3. Удалить труб от теплового блока. Вспышка спин. Вернуться к BSL2 капотом. Добавить 200 мкл 100% этанола. Крышка, удалить из капотом, вихревой 15 сек и флэш-спин. Остальные шаги могут быть завершены за пределами капотом.
    4. Применение лизата (в течение 30 мин на этапе 3.5.3) с меченым ротационную колонку (в 2 мл пробирку). Закройте крышку, чтобы избежать перекрестного загрязнения с помощью аэрозолей. Центрифуга 6000 мкг, 1 мин.
    5. Откажитесь от сбора трубки, содержащей фильтрата и поставить колонки отжима в новом 2 мл пробирку.
    6. Добавить 500 мкл буфера AW1 к колонке без увлажнения обод, закройте крышку, и центрифуга 6000 мкг, 1 мин.
    7. Откажитесь от сбора пробирку Filtraте и поместите колонку отжима в новом 2 мл пробирку.
    8. Добавить 500 мкл буфера AW2 к колонке без увлажнения обод, закройте крышку, и центрифуга 20000 мкг, 3 мин.
    9. Откажитесь от сбора трубки, содержащей фильтрата и поставить колонки отжима в новом 1,5 мл пробирку (не входит в комплект), и центрифуга 20000 мкг, 1 мин.
    10. Откажитесь от сбора трубки, содержащей фильтрата и поставить колонки отжима в новом 1,5 мл пробирку (не входит в комплект).
    11. Добавить 200 мкл буфера AE или воды к каждому столбцу и инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин. Центрифуга 6000 мкг, 1 мин.
    12. Повторите шаг 3.5.11 элюирование в то же пробирку.
    13. Бассейн элюированную ДНК из 2 столбцов каждого участника. Общий выход ~ 800 мкл каждого участника.
    14. Количественно образцы с помощью спектрофотометра, когда время позволяет.
    15. Алиготе ДНК по желанию в 2 мл криопробирки, документирование концентрацию каждого на specimeп журнала. Передача криопробирки к cryobox и место в -80 ° С в течение длительного хранения. Документ время начала морозильник.
  5. Выделение РНК лейкоцитов Этап 1 (30 мин)
    Примечание: Выполните в Уровень биобезопасности 2 сертифицированных капот культуре клеток. Для получения более подробной информации по этому изоляции смотрите инструкции производителя 15.
    1. Пирс резиновую перегородку ЭДТА Vacutainer К 2 с передачи шип. Сохраните оболочку и винтовой крышкой для использования на стадии 3.6.11. После стандартной практикой BSL2, заботиться, чтобы избежать контакта с кровью патогенных микроорганизмов.
    2. Подключите разъем белого скольжения в верхней части передачи шип.
    3. Этикетка фильтр с соответствующей участника ID затем подключите вход (вспыхнул конец) фильтра к разъему белого скольжения.
    4. Приложите оболочкой 25⅝ G иглу в выходной (коническим концом) фильтра. Подготовка фильтрующий узел перед поставкой ускоряет процесс и, следовательно, значительно,есть белый скольжения разъем для передачи всплеска, добавив фильтр, затем ножны иглу и не устанавливая сборку в стойке пробирку до использования, рекомендуется.
    5. После сборки системы труб К 2 ЭДТА, безопасно обнажить иглы (используйте конец металлического шпателя). Stab иглу в пустую 10 мл пробирку эвакуированы крови (приемник трубки в сыворотке) и инвертировать сборку труб K 2 ЭДТА Vacutainer / фильтр / приемник. После стандартной практикой BSL2, заботиться, чтобы избежать контакта с кровью патогенных микроорганизмов.
    6. Дайте крови через фильтр до тех пор, клиновидные участки фильтра не очищены от крови. Фильтрация занимает около 2 мин и может быть размещен в стойке пробирки в процессе фильтрации.
    7. Удалить фильтр из сборки. Оставьте иглу в пробирку, содержащую фильтрат и отбросить всю сборку в контейнер с острыми инструментами в.
    8. Прикрепите 5 мл шприц с передачей шип на бутылке 1x PBS, вVert бутылку, и вывести 3 мл.
    9. Приложить шприц с PBS с впускным отверстием фильтра и очистить фильтр (3-5 капли в секунду). Сбор проточные в контейнере биологических отходов. Снять шприц с фильтром без втягивания поршень.
    10. После фильтрации и промывки PBS, отозвать 3 мл стабилизации РНК агента с использованием нового шприца 5 мл и метода, описанного в пункте 3.6.8. Промойте фильтр, как в шаге 3.6.9. Стабилизация агент РНК должна оставаться на фильтре. Снять шприц с фильтром без втягивания поршень.
    11. Печать входного фильтра и выход с оболочкой и винтовой крышкой сохраняется от передачи шип, оставляя фильтр, насыщенный стабилизации РНК агента. Фильтр может храниться в этой точке. Храните фильтр при -80 ° С до разрешений время (~ 2 ч), чтобы завершить шаги 5,3 до 5.4.7.
      Примечание: Фильтры, хранящиеся при температуре -80 ° С в течение одного года после сбора были обработаны без decreaSE качества РНК.
  6. РВМС изоляции Стадия 2 (30 мин)
    1. Снимите фиколл содержащие vacutainers из центрифуги (шаг 3.4.1) и продолжают в BSL2 капотом. Vacutainers должен отображать разделение как показано на рисунке 2. Если нет, см таблицу 2.
    2. После того, как Vacutainer возвращается к BSL2 капотом, снимите пробку и снять 1,5 мл верхней, желтоватый, плазменного слоя (рис 2), используя серологические пипетки с без приближается к одноядерных (прозрачный / белый) слоя. Перевести плазму 5 мл криопробирку - (бассейн с 2 vacutainers - 1 участника). Войти объем собранной. См шаг 3.7.6 Инструкции хранения.
      Примечание: лучшее разделение и большие урожаи РВМС приходят из участников, кто постился, по крайней мере 12 ч до сбора крови.
    3. Перенести оставшиеся плазмы и беловатый, мононуклеарную слой (все, что выше слоя геля - Рисунок 2) ипеть серологическое пипетки на 15 мл коническую трубку, объединения мононуклеарной слой от каждого из двух фиколлом содержащей vacutainers за участника в один конической трубе.
    4. Добавить 1X PBS, чтобы довести общий объем в конической трубе 15 мл. Крышка трубки и инвертировать в 5 раз. Центрифуга (с тормозом и ускорения OFF) 15 мин, 300 XG, 22 ° C.
    5. Вернуться к фиколл содержащих vacutainers в капюшоне и собирать красные кровяные клетки (эритроциты) с помощью 5¾ "Пастера пипетки вертеться вокруг и ослабить снаружи слоя геля фиколла и удалить его, если это возможно. Использование серологических пипетки для сбора и передачи БС (~ 4,5 мл) до 5 мл криопробирку. Войти объем собранной.
    6. Перевести оба 5 мл криопробирки (плазму в шаге 3.7.2 и БС в шаге 3.7.5) для регулируемой скоростью замораживания контейнер и поставить в -80 ° С в течение не менее 24 часов, после чего они могут быть переданы в cryobox и вернулся в -80 ° С для длительного хранения.
    7. Вернуться СОское трубки капотом, когда центрифугирования в шаге 3.7.4 является полной и аспирации все, но ~ 500 мкл PBS, не нарушая гранул. Выход РВМС больше, если ~ 200 мкл PBS остается выше гранул на данном этапе.
    8. Добавить свежие 1x PBS, чтобы довести объем до 10 мл. Ресуспендируют осадок осторожно. Крышка трубки и инвертировать в 5 раз. Центрифуга (с тормозом и ускорения OFF) 10 мин, 300 XG, 22 ° C.
  7. Сыворотка Выделение Стадия 2 (10 мин)
    Примечание: Выполните в BSL2 капотом.
    1. Алиготе верхний слой сыворотки из сыворотки Vacutainer, после центрифугирования (этап 3.2.1), в 2 мл криопробирки по желанию. Типичный выход 2,5 мл (таблица 1). Войти громкости. Например, можно использовать 4 криопробирки аликвоты 200 мкл в криопробирку 1, 1000 мкл в криопробирку 2, а затем разделить оставшийся в криопробирки 3 и 4.
    2. Передача криопробирки в в cryobox и место при температуре -80 ° С для длительного хранения. Документ о начале морозильниквремя.
  8. РВМС изоляции Этап 3 (15 мин)
    1. Вернуться к капоту, после центрифугирования (этап 3.7.8), и аспирата как много надосадочной / PBS, как это возможно, не нарушая гранул. Ресуспендируют осадок с помощью пипетки в 2,5 мл РВМС Замораживание среда 1 (см SI 2).
    2. Добавить 2,5 мл РВМС Замораживание среда 2 (см Si 2) в клеточной / среднего раствора на стадии 3.9.1. Вихревой нежно.
    3. Аликвоты 10 мкл раствора клетки в 0,65 мл микроцентрифужных трубки (дальнейшего разбавления может быть необходимо). Добавьте 10 мкл 0,4% трипанового синевы в 0,65 мл трубки микроцентрифужных и перемешать с помощью пипетки несколько раз. Для более подробной информации см руководство изготовителя 16.
    4. Пипеткой 10 мкл смеси в камеру счетной камере слайд и место скольжение в клеточную счетчика в течение 3 мин перемешивания. Увеличение и сосредоточиться клетки. Нажимать кнопку "Граф клеток", чтобы получить рассчитывать РВМС.
    5. Аликвоты, если жизнеспособностьКоличество РВМС выше 3 млн клеток на миллилитр (MC / мл), по желанию в криопробирки и перейти к шагу 3.9.9. Храните МНПК в срок до 5 криопробирки в концентрации не менее 3 тс / мл каждого.
    6. Если количество жизнеспособных РВМС ниже 3 MC / мл, рассчитать общее количество клеток путем умножения жизнеспособным MC / мл по 5 мл. Разделите это число на 4, 3, 2 или 1 мл, так что будет по крайней мере одна трубка с 3 тс / мл.
    7. Центрифуга коническую трубку, содержащую клетки / замерзания среды раствор в течение 5 мин при 300 х г (тормоза и ускорение OFF). После центрифугирования аспирата соответствующий объем морозильной среды (супернатанта), оставляя объем, рассчитанный выше (4, 3, 2 или 1 мл).
    8. Ресуспендируют осадок в оставшейся надосадочной жидкости и аликвоту по крайней мере, 3 MC / мл в соответствующее число криопробирки (1-4) со скоростью 1 мл / криопробирку. Заключительный замораживания среднего 10% диметилсульфоксида (ДМСО) / 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS) / 70% Roswell Park Memorial институт (RPMI) 1 640.
    9. DocumЛОР число клеток на криопробирку. Передача криопробирки с контролируемой скоростью замораживания контейнер и поместить при -80 ° С в течение не менее 24 ч, после чего в криопробирки может быть передано cryobox и поставить в жидкостном резервуаре азота (парофазного) для длительного хранения. Морозильник Документ время начала.

4. День 2 Настройка

  1. Тепло аликвоту (220 мкл на фильтре) нуклеазы свободной 0,1 мМ ЭДТА в нуклеазы без трубки до 80 ° С в нагревательный блок.
  2. Приготовьтесь промывные растворы 1 и 2 (см SI 2).

5. День 2: Долговременное хранение образцов и лейкоцитов Фильтр обработка (3 ч)

  1. Обзор.
    1. Выполните эту процедуру в течение 6 месяцев применения лейкоцитов в фильтре.
      Примечание: В целом, день 2 обработки занимает около 3 ч и в то время он помечен "День 2", ключевым требованием является то, что часть обработки фильтра должна быть выполнена в день, когданет день 1 обработки происходит в лаборатории.
  2. Длительное хранение образца (15 мин)
    1. Выполните эту процедуру каждый день, до поставки новых vacutainers в лабораторию для обработки 1 день. Передача криопробирки, которые были сохранены O / N в контролируемых контейнеров ставка замораживания на 1 день в надлежащим образом маркированных cryoboxes и вернуть их в -80 ° С или жидким азотом (паровой фазы) для длительного хранения. Организуйте криопробирки в зависимости от типа образца (например, ДНК, эритроцитов, РВМС и т.д.), чтобы ускорить образец расположение слежения за конечных анализов.
  3. Лейкоцитов РНК Фильтры Обработка (45 мин).
    Примечание: Для получения дополнительной информации по данной процедуре смотрите инструкцию 17 производителя.
    1. Принесите фильтр для РТ (оттаивания около 5 мин).
    2. Снимите оболочку и винтовой крышкой из фильтра. Уберите поршень 5 мл шприц и подключите его к входу (вспыхнул конец) фильтра, нажмите на поршеньвысылать стабилизации РНК агента из фильтра портов в контейнер биологических отходов.
    3. Загружает новый шприц 5 мл с 4 мл фенола и гуанидинизотиоцианата раствора для выделения РНК и прикрепить ее к входу фильтра, нажмите на поршень, чтобы смыть раствор через фильтр, собирая лизата в меченого 15 мл коническую пробирку (2 на каждого участника).
    4. Отключите шприц из фильтра, убрать поршень, повторно прикрепить его к фильтру, и нажмите на поршень, чтобы изгнать остаточного образца попадает в фильтр диска в те же 15 мл коническую трубку. Откажитесь фильтр и шприц.
    5. Добавить 800 мкл BCP в конической трубе, закрыть трубу плотно и интенсивно встряхнуть преп течение 30 сек.
    6. Инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин. Центрифуга в течение 10 мин при 2000 х г в.
    7. Передача водный (вверху) фазы в свеже меченого 15 мл коническую пробирку (~ 2,5 мл).
    8. Добавить 0,5 раза объем водной фазы нуклеазы свободной воды апD хорошо перемешать. Затем добавить 1.25 водной объема 100% этанола, и снова перемешать.
      Примечание: Для 2,5 мл водного объема, добавить 1,25 мл нуклеазы свободной воды, перемешать, а затем добавить 4,7 мл 100% этанола (2,5 мл х 0,5 = 1,25 мл нуклеазы свободной воды ТОГДА 2,5 мл + 1,25 мл = 3,75 мл новый водный объем ТОГДА 3,75 мл х 1,25 = 4,7 мл 100% этанола). Этот шаг позволяет изолировать общей РНК, который включает небольшое РНК фракции. Метод, чтобы опустить малые РНК из изоляции можно найти в руководстве 17.
    9. Снимите поршень от 5 мл шприц и вставить картридж в спин на месте. Прикрепите картриджа / шприца с вакуумным коллектором. Для более безопасного подключения к вакуумным коллектором, поместите картридж / шприца внутри 1,5 мл микроцентрифужных трубка с нижней отрезать.
    10. Нанесите образец с шага 5.3.8 к спиновой картриджа медленно с вакуумом, внимательно добавляя больше образца, как это тянут через картридж.
      Примечание: Если вакуум не являетсяНастоящий см методом центрифугирования на http://www.ambion.com/techlib/misc/leuko_iso.pdf.
    11. Перенести спин-картридж на 1,5 мл микроцентрифужных пробирку и добавляют 750 мкл промывочного 1. Центрифуга спин картридж / сборки трубка 5 - 10 сек при 12000 х г.
    12. Отменить фильтрата из трубки и возврата спин картридж с аналогичным микроцентрифужных трубки.
    13. Добавить 750 мкл промывочного 2 и центрифугой спин картриджа / трубки для 5 - 10 сек при 12000 х г. Откажитесь фильтрата, как в шаге 5.3.12. Вернуться спин картридж в той же трубки микроцентрифужных.
    14. Повторите с другой 750 мкл промывочного 2 и центрифугирования, как в шаге 5.3.13. Отменить фильтрат. Вернуться спин картридж в той же трубки микроцентрифужных. Центрифуга спин картриджа / трубки на максимальной скорости в течение 1 мин, чтобы высушить фильтр.
    15. Перенести спин картридж свежий, помечены 1,5 мкл микроцентрифужную трубку.
    16. Добавить 200 мкл нуклеазы 0,1 мМ ЭДТА (предварительно нагретый до 80 & #176; С) до центра фильтра спин картриджа (2 на каждого участника). Выдержите при комнатной температуре в течение 1 мин.
    17. Центрифуга в течение 1 мин при 12000 х г, чтобы элюировать РНК. Сохраните фильтрат. Откажитесь отжима картриджа.
    18. Сплит каждый 200 мкл фильтрата на два, 100 мкл аликвоты в 1,5 мл свежей микропробирок, этикетки и держать на льду. В этот момент, начиная с 2 фильтрами каждого участника будет давать четыре 100 мкл аликвоты РНК одного участника.
  4. ДНКазы лечение (1 час)
    Примечание: Для получения более подробно о данном лечении см протокол производителя 18.
    1. Создать мастер микс, комбинируя 10 мкл ДНКазы I буфера и 2 мкл rDNase я за аликвоты + 1 (для учета пипетки ошибку).
      Примечание: Для четырех образцов, 100 мкл аликвоты использовать 50 мкл ДНКазы I буфера + 10 мкл rDNase I.
    2. Алиготе 12 мкл мастер смеси на стадии 5.4.1 в каждом из РНК аликвот от стадии 5.3.18 и аккуратно перемешать. Выдержите в 37° C в течение 30 мин в нагревательный блок.
    3. Vortex ДНКазы Инактивация реагент и добавить 11,2 мкл в каждую аликвоту, хорошо перемешать. Инкубируют при комнатной температуре в течение 2 мин вортексе 2-3 раза во время инкубации.
    4. Центрифуга при 10000 мкг в течение 1,5 мин.
    5. Передача супернатант (РНК) в чистую пробирку 1,5 мл. Помещенные в одного участника может быть объединены здесь.
    6. Запуск каждого образца на спектрофотометре, чтобы получить концентрацию. Качество анализ РНК рекомендуется пользоваться Bioanalyzer (см шаг 5,5).
    7. Алиготе РНК в криопробирки по желанию. Если анализ Bioanalyzer не будет выполнено немедленно, аликвоту 1,5 мкл образца в пробирку микроцентрифужных для последующего анализа. Документ концентрации и время начала морозильник. Храните образцы при -80 ° C.
  5. Bioanalyzer анализ (1 час)
    1. Следуйте протокол производителя 19. Когда пробег завершена, данные автоматически сохраняются, но сохранить его еще раз шIth меньшие, более узнаваемым именем файла. Ожидаемые результаты (рисунок 3): лестница должна иметь 6 пики, образцы должны иметь 3 пики (2 рибосомных пики при 44 сек и 50 сек, соответственно и 1 в начале пика маркера на 25 сек).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Важно, чтобы общая процедура получения высококачественного материала для анализа в разнообразных последующих применений, включая генной экспрессии через микрочипов и анализа RT-PCR, определение эпигенетических модификаций и вариаций клеток подмножества. Таблица 1 показывает средний выход и качество материалов от каждого из процессов. Рисунок 3 представляет собой пример качества продукции из изоляции лейкоцитов РНК и фильтров методов обработки. Изображение на верхнем левом рисунк...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мы описали обтекаемый протокол, который был успешно применен для обработки более 1600 образцов цельной крови в Health Study Детройт соседства. Хотя многие из этих методов имеются в существующей литературе, наш шаг за шагом компиляции, в том числе именно приуроченных изменений между каждым шагом, отражает оптимизированная эффективный протокол, успешно производит различные биологические образцы с широким диапазоном вниз по течению приложений, в том числе метилирования ДНК, мРНК и выражения иммунологической анализа. Эти об...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие интересы.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Генриетту Мэйр-Мейерс за неоценимое внимание к деталям и часы, потраченные на обработку взятых образцов крови. Мы благодарны Натали Джеймсон Кислинг за опыт графического дизайна. Мы также признательны производителям (Qiagen (Валенсия, Калифорния), BD Biosciences (Сан-Хосе, Калифорния), Life Technologies (Гранд-Айленд, Нью-Йорк)), упомянутым в настоящем документе, на публикацию информации об использовании их продукции в соответствии с описанием. Финансирование этой работы было щедро предоставлено премиями Национальных институтов здравоохранения под номерами DA022720, RC1MH088283 и DA022720-05-S1.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
QIAamp DNA Blood Mini KitQiagen51104День 1: Выделение ДНК
Фосфатно-солевой буфер (PBS)SigmaP5493-1LДень 1: Выделение PBMC
5 ¾ ” Пастеровская пипеткаFisher13-678-6AДень 1: Выделение PBMC
Фетальная бычья сыворотка (FBS), термоинактивированнаяLife Technologies10082147День 1: Выделение PBMC
Диметилсульфоксид (ДМСО)SigmaD8418-500mlДень 1: Выделение PBMC
RPMI Medium 1640, жидкийInvitrogen11875119День 1: Выделение PBMC
0,4% трипановый синий краситель  InvitrogenT10282День 1: Камера для подсчета клеток PBMC
CountessInvitrogenC10283День 1: Автоматический счетчик клеток PBMC
или устройство для подсчета клеток, такое как микроскоп и гемоцитометрInvitrogenC10281День 1: Изоляция PBMC
LeukoLOCK Fractionation & Стабилизационный комплект Ambion1933День 1: выделение РНК лейкоцитов
25  Г x 5/8 дюйма иглыБектон Дикинсон305122день 1: выделение лейкоцитарной РНК
Шприцы (5  ml)Бектон Дикинсон309646дни 1 и 2: раствор для лизиса денатурирующей РНК лейкоцитов
 Ambion8540GДень 2: выделение РНК лейкоцитов
5  M NaClLife Technologies24740011День 2: Выделение лейкоцитарной РНК
TRI РеагентAmbion9738День 2: Выделение лейкоцитарной РНК
Bromo-3-хлор-пропан (BCP)SigmaB-9673День 2: Выделение лейкоцитарной РНК
спин-картриджи Ambion10051GДень 2: выделение РНК лейкоцитов
0,1  mM EDTAAmbion9912День 2: Выделение лейкоцитарной РНК
без ДНК НаборAmbionAM1960День 2: ДНКаза треаментная
РНК 6000 Ladder Agilent5067-1529День 2: Биоанализатор
анализа РНК 6000 Nano Series II Kit Agilent5067-1511День 2: Анализ биоанализатора
РНКазеZAPAmbionAM8782День 2: Анализ биоанализатора
Этанол >99%SigmaE7023-500мл
Изопропанол >99% SigmaI9516-500мл
ультрачистая вода без нуклеазы Invitrogen9938
Наконечники для пипеток (без нуклеаз)Eppendorf22491253
Pipetter (серологические)Eppendorf2223020-4
Пипетки (для объемов менее 1  ml)Eppendorf3120000-054
Пипетки (серологические)Fisher13-678-27E Контейнеры
для заморозки с контролируемой скоростьюNalgene5100-0001
Криобоксы (для хранения 2  мл и 5  мл криовиалов и 1,5  мл микроцентрифужные пробирки)Fisher03-395-464
Штатив для пробирокThermo Scientific14-804-134
15  мл полипропиленовые тубыФишера14-959-49Д
1,5  мл и 0,65 микроцентрифуги пробиркиFisher07-200-534 и 07-200-185
2  мл и 5  мл криовалиалыФишер10-500-26 и 10-269-88F 
8  мл CPT vacutainerBD Biosciences3627612 пробирки
6  мл K2 EDTA vacutainerBD Biosciences3678632 пробирки
8,5  мл SST vacutainerBD Biosciences3679881 пробирка
Vortexer Fisher2215365
Инкубатор сухой ванны с нагревательным блоком для микроцентрифужных пробирокFisher11-715-1250
Фильтрация/вакуумная система для использования в колпаке для клеточных культурFisher01-257-87
Ротор с фиксированным углом наклона для микроцентрифужных пробирок с аэрозоленепроницаемой крышкойEppendorf22637002
Центрифуга-холодильник с ротором с поворотным ведром и аэрозоленепроницаемыми крышками на 16 x 125  мм вакутайнеры и 15  мл полипропиленовые тубыEppendorf226281572, не нужно хранить в холодильнике
Nanodrop 2000 (рекомендуется для точности малых объемов) или другой спектрофотометрический приборFisher13-400-411
Agilent БиоанализаторAgilent TechnologiesG2940CA
Резервуар для жидкого азотаThermo Scientific11-676-56
Контейнер для острых предметовFisher22-037-970
Контейнер для биологических отходовThermo Scientific1223P52
Уровень биобезопасности 2  сертифицированный колпак для клеточных культурThermo Scientific13-261-315

Ссылки

  1. Hernandez, M. E., Martinez-Fong, D., Perez-Tapia, M., Estrada-Garcia, I., Estrada-Parra, S., Pavon, L. Evaluation of the effect of selective serotonin-reuptake inhibitors on lymphocyte subsets in patients with a major depressive disorder. Eur Neuropsychopharmacol. 20, 88-95 (2010).
  2. Weigelt, K., et al. TREM-1 and DAP12 expression in monocytes of patients with severe psychiatric disorders EGR3, ATF3 and PU.1 as important transcription factors. Brain Behav Immun. 25, 1162-1169 (2011).
  3. Robertson, M. J., et al. Lymphocyte subset differences in patients with chronic fatigue syndrome, multiple sclerosis and major depression. Clin Exp Immunol. 141, 326-332 (2005).
  4. Rotter, A., Asemann, R., Decker, A., Kornhuber, J., Biermann, T. Orexin expression and promoter-methylation in peripheral blood of patients suffering from major depressive disorder. J Affect Disord. 131, 186-192 (2011).
  5. Klengel, T., et al. Allele-specific FKBP5 DNA demethylation mediates gene-childhood trauma interactions. Nat Neurosci. 16, 33-41 (2013).
  6. Segman, R. H., Shefi, N., Goltser-Dubner, T., Friedman, N., Kaminski, N., Shalev, A. Y. Peripheral blood mononuclear cell gene expression profiles identify emergent post-traumatic stress disorder among trauma survivors. Mol Psychiatry. 10, 500-513 (2005).
  7. Smith, B. H., et al. Cohort Profile: Generation Scotland: Scottish Family Health Study (GS:SFHS). The study, its participants and their potential for genetic research on health and illness. Int J Epidemiol. 42, 689-700 (2013).
  8. Mallone, R., et al. Isolation and preservation of peripheral blood mononuclear cells for analysis of islet antigen-reactive T cell responses: position statement of the T-Cell Workshop Committee of the Immunology of Diabetes Society. Clin Exp Immunol. 163, 33-49 (2011).
  9. Duvigneau, J. C., Hartl, R. T., Teinfalt, M., Gemeiner, M. Delay in processing porcine whole blood affects cytokine expression. J Immunol Methods. 272, 11-21 (2003).
  10. Debey, S., et al. Comparison of different isolation techniques prior gene expression profiling of blood derived cells: impact on physiological responses, on overall expression and the role of different cell types. Pharmacogenomics J. 4, 193-207 (2004).
  11. Uddin, M., et al. Epigenetic and immune function profiles associated with posttraumatic stress disorder. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 9470-9475 (2010).
  12. Kessler, R. C., Wang, P. S. The descriptive epidemiology of commonly occurring mental disorders in the United States. Annu Rev Public Health. 29, 115-129 (2008).
  13. Qiagen. QIAamp® DNA Mini and Blood Mini Handbook. , Valencia, California, USA. Available from: https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=67893a91-946f-49b5-8033-394fa5d752ea (2010).
  14. Thermo Scientific. NanoDrop 1000 Spectrophotometer. , Waltham, Massachusetts, USA. Available from: http://www.nanodrop.com/Library/nd-1000-v3.8-users-manual-8 (2010).
  15. Life Technologies. LeukoLOCK™ Total RNA Isolation System. , Grand Island, New York, USA. Available from: http://www.ambion.com/techlib/misc/leuko_iso.pdf (2011).
  16. Life Technologies. Countess™ Automated Cell Counter. , Grand Island, New York, USA. Available from: http://www.lifetechnologies.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-analysis/pdfs.par.5257.file.dat/mp10227-countess (2009).
  17. Life Technologies. Alternative Protocol for Extraction of RNA from Cells Captured on LeukoLOCK™ Filters Using TRI Reagent®. , Grand Island, New York, USA. Available from: http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/rna-protocol/alternative-protocol-extraction-of-rna-from-cells-captured-on-leukolock-filters-using-tri-reagent.html (2011).
  18. Life Technologies. DNA-free™ Kit. , Grand Island, New York, USA. Available from: http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/cms_055739.pdf (2012).
  19. Agilent Technologies. Agilent RNA 6000 Nano Kit Guide. , Santa Clara, California, USA. Available from: http://www.genomics.agilent.com/files/Manual/G2938-90034_KitRNA6000Nano_ebook.pdf (2006).
  20. Koenen, K. C., et al. SLC6A4 methylation modifies the effect of the number of traumatic events on risk for posttraumatic stress disorder. Depress Anxiety. 28, 639-647 (2011).
  21. Walsh, K., Uddin, M., Soliven, R., Wildman, D. E., Bradley, B. Associations between the SS variant of 5-HTTLPR and PTSD among adults with histories of childhood emotional abuse: Results from two African American independent samples. J Affect Disord. 161, 91-96 (2014).
  22. Bustamante, A. C., et al. Childhood maltreatment is associated with epigenetic differences in hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis genes in the Detroit Neighborhood Health Study. American Association of Physical Anthropologists 82nd Annual Meeting, Knoxville, TN, , Comprehensive Psychiatry. (2013).
  23. Sipahi, L., et al. Longitudinal epigenetic variation of DNA methyltransferase genes is associated with vulnerability to post-traumatic stress disorder. Psychol Med. 44, 3165-3179 (2014).
  24. Uddin, M., Koenen, K. C., Aiello, A. E., Wildman, D., de los Santos, R., Galea, S. Epigenetic and inflammatory marker profiles associated with depression in a community-based epidemiologic sample. Psychol Med. 41, 997-1007 (2011).
  25. Uddin, M., et al. Post-traumatic stress disorder is associated with immunosenescent T cell phenotypes in the Detroit Neighborhood Health Study. 3rd North American Congress of Epidemiology, Montreal, QC, , (2011).
  26. Uddin, M., et al. Post-traumatic stress disorder is associated with immunosenescent T cell phenotypes in the Detroit Neighborhood Health Study. 101st Annual Conference of the American Psychopathological Association, New York, NY, , (2011).
  27. Uddin, M. Biological signatures of post-traumatic stress disorder in the Detroit Neighborhood Health Study. 9th International Conference on Urban Health, New York Academy of Medicine, , (2010).
  28. Aiello, A. E. Cytomegalovirus antibodies as a marker of immunosenescence in the Detroit Neighborhood Health Study. 9th International Conference on Urban Health, New York Academy of Medicine, , (2010).
  29. Bustamante, A. C., et al. Distinct gene expression profiles characterize lifetime PTSD and childhood maltreatment in the Detroit Neighborhood Health Study. , International Society for Traumatic Stress Studies. Philadelphia, PA. (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи