Электрофоретической подвижности сдвига анализа (EMSA) по изучению РНК-белковых взаимодействий: ИРЭ / IRP примера

EMSA был первоначально разработан для изучения связи ДНК-связывающих белков с последовательностями ДНК-мишени ^1,2. Принцип одинаков для РНК / белковые взаимодействия ^3, которая является предметом данной статьи. Вкратце, РНК отрицательно заряженные и будет мигрировать к аноду при не-денатурирующих электрофореза в полиакриламидном (или агарозных гелей). Миграция в геле зависит от размера РНК, которая пропорциональна его заряда. Специфическое связывание белка с РНК изменяет свою подвижность, и комплекс мигрирует медленнее по сравнению со свободной РНК. Это, главным образом, за счет увеличения молекулярной массы, но также к изменениям в ведении и, возможно, конформации. Используя меченой РНК в качестве зонда позволяет легко мониторинг "задержки в геле" или "bandshift". Использование ³² P-меченой РНК зондов является очень распространенным явлением и обладает высокой чувствительностью. Миграция РНК / белковые комплексы и свободной РНК обнаруженыавторадиографией. Недостатки являются короткий период полувыведения из ³² P (14,29 дней), постепенное ухудшение качества зонда из-за радиолиза, требование лицензии радиоактивности и инфраструктуры на предмет радиоактивности работы, и потенциальных проблем биобезопасности. Таким образом, альтернативные-изотопные методы мечения РНК-зонда были разработаны, например, с флуорофорами или биотин, которые позволяют обнаружение флуоресцентной или хемилюминесцентной изображений ^4,5. Ограничения этих методов более высокую стоимость и часто пониженная чувствительность по сравнению с изотопной метки, и потенциал неизотопных этикеток вмешиваться взаимодействия РНК / белок. Неденатурирующем гели полиакриламида подходят для большинства применений EMSA и обычно используются. В отдельных случаях, гели агарозы могут представлять собой альтернативу для анализа больших комплексов.

Основным преимуществом EMSA является то, что он сочетает в себе простоту, чувствительность и надежность ^{4 <}/ SUP>. Анализ может быть завершена в течение нескольких часов и не требует сложного инструментария. РНК / белковые взаимодействия могут быть обнаружены с помощью EMSA в таких низких концентрациях, как 0,1 нМ или менее, и в широком диапазоне условий связывания (рН 4,0 - 9,5, концентрация соли одновалентного 1 - 300 мм, а температура 0 - 60 ° С).

РНК / белок образование комплекса также может быть изучена с фильтром анализа связывания. Это просто, быстро и недорого процедура, основанная на сохранении РНК / белковых комплексов в нитроцеллюлозный фильтр, в то время как свободной РНК зонд проходит через ^6. По сравнению с EMSA, оно ограничено в случаях, когда РНК-зонда содержит несколько сайтов связывания, или неочищенный экстракт содержит более одного РНК-связывающие белки, которые связываются с зондом в том же месте. В то время как несколько РНК / белковые взаимодействия будет избежать обнаружения фильтра-анализе связывания, они могут быть легко визуализированы с помощью EMSA. В некоторых случаях, визуализация наканунеп возможно, когда два РНК / белковые комплексы со мигрируют (например, человек IRP1 / IRE и IRP2 / IRE комплексы), добавляя антитела против одного из РНК-связывающих белков в реакции EMSA, уступая дальнейшее замедление на геле ( "supershift") ^7.

EMSA широко используется для изучения IRP1 и IRP2, которые являются пост-транскрипционные регуляторы метаболизма железа ^8-10. Они работают путем связывания с ИРЭС филогенетически консервативных шпилька структур в UTRs нескольких мРНК ^11. Ires были впервые обнаружены в мРНК, кодирующих ферритина ¹² и рецептора трансферрина 1 (TfR1) ^13, белки хранения железа и поглощения, соответственно. Позже, Ires были найдены в эритроидных конкретных аминолевулинат синтазы (ALAS2) ^14, митохондриальная аконитазы ^15, Ferroportin ^16, двухвалентный металл транспортера 1 (DMT1) ^17, индуцируемого гипоксией фактора 2 18, и других генов ^19-21. Н прототип и L-ферритина мРНК содержат один IRE в их 5 'UTR, а TfR1 мРНК содержит несколько Ires в своей 3' UTR. IRE / ПИВТ взаимодействия специфически ингибируют ферритина перевод мРНК пространственно блокируя его ассоциацию 43S субъединицы рибосомы; Кроме того, они стабилизируют TfR1 мРНК против эндонуклеолитическим расщепления. IRP1 и IRP2 доля сходство обширная последовательности и обладают высокой ИРЭ-связывающей активности железосодержащих голодали клеток. В железо-изобилует клеток, IRP1 собирает кубан Fe-S кластер, который преобразует его в цитозоле аконитазы за счет его ИРЭ-связывающей активности, в то время как IRP2 деградирует протеасомной. Таким образом, IRE / ПИВТ взаимодействия зависит от состояния клеточного железа, но также регулируются другими сигналами, такими как H ₂ O _2, окись азота (NO) или гипоксии. Здесь мы опишем протокол для оценки ИРЭ-связывающей активности от неочищенных клеточных и тканевых экстрактов EMSA. Мы использовали ³² P-меченого Н-ферритина IRE зонд, который был создан путем транскрипции в пробирке из шаблона плазмидной ДНК (I-12.CAT), где последовательность ИРЭ был первоначально введенного в смысле ориентации ниже по потоку от полимеразы Т7 РНК-сайта путем Клонирование отожженных синтетических олигонуклеотидов ^22.

Экспериментальные процедуры с мышами были утверждены Care комитета животных Университета МакГилл (протокол 4966) мимо.

1. Получение белковых экстрактов из культивируемых клеток

1. Промыть культивируемые клетки дважды 10 мл охлажденного на льду забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS).
2. Собрать прилипшие клетки или с резиновой полицейского или пластмассовым скребком клеток в 1 мл охлажденного льдом PBS, передачи суспензии в 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
3. Спина в микроцентрифужных в течение 5 мин при 700 мкг, при 4 ° С. Отберите PBS.
4. Добавить 100 мкл ледяной цитоплазматической буфера для лизиса (Таблица 1) в 10 ⁷ клеток, и пипеткой вверх и вниз.
5. Инкубируют на льду в течение 20 мин.
6. Спин течение 10 мин при полной скорости в микроцентрифуге при 4 ° С.
7. Отменить осадок. Трансфер супернатант в новую 1,5 мл трубки микроцентрифужных и держать на льду.
8. Detгорностай концентрацию белка (обычно 1 - 10 мкг / мкл) с помощью ²³ Бредфорда.
9. Кратные и хранить клеточные экстракты при -80 ° С до использования.

2. Подготовка белковые экстракты из мышиной печени и селезенки

1. Эвтаназии мышь с CO ₂ ингаляции.
2. Положите эвтаназии животных на чистую площадку над вскрытии борту. Откройте живота с ножницами.
3. Проанализируйте печени и селезенки с помощью ножниц и щипцов и промойте каждой ткани примерно в 50 мл ледяной PBS.
4. Сразу сократить ткани на мелкие кусочки скальпелем (например: примерно 1 - 2 мм ^3).
5. Без задержек, положить куски ткани в свежем криоскопической пробирки, а затем оснастки заморозить их в жидком азоте. Магазин оснастки замороженных аликвот ткани при температуре -80 ° С до использования.
6. Перемешать один кусок замороженной ткани (примерно 1 - 2 мм ³⁾ в 0,25 - 0,5 млледяной цитоплазматический буфера для лизиса (Таблица 1) с тканевом гомогенизаторе в течение 10 сек.
7. Передача гомогената в 1,5 мл микроцентрифужных трубки и охладить на льду в течение 20 мин.
8. Спин течение 10 мин при полной скорости в микроцентрифуге при 4 ° С.
9. Отменить гранул и передачи супернатант в новую 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Держите на льду.
10. Определить концентрацию белка (обычно 1 - 10 мкг / мкл), используя Бредфорда ^23.
11. Кратные и хранить клеточные экстракты при -80 ° С до использования.

3. Получение радиоактивно меченного зонда ИРЭ-

1. Линеаризации ИРЭ-содержащей плазмиды I-12.CAT ²² путем инкубации при 37 ° С в течение 1 ч с рестриктазой XbaI (1 U на мкг плазмиды), которая расщепляет ниже последовательности IRE. Линеаризованной плазмидной будет использоваться в качестве шаблона для транскрипции в пробирке.
2. Настройкап ин витро транскрипции реакцию в общем объеме 20 мкл. С помощью растворы, приведенные в таблице 2, и добавить: 1 мкл линеаризованной плазмидной шаблона, 4 мкл буфера транскрипции; 1 мкл смеси АТФ / CTP / GTP смеси 10 мкл [α- ³² P] -UTP, 2 мкл дитиотреитола, РНКазы ингибитор 1 мкл и 1 мкл РНК-полимеразы Т7. Смешайте с помощью пипетки вверх и вниз.
3. Инкубируют при 40 ° С в течение 1 ч ^24.

4. Очистка радиоактивной ИРЭ-зонда

1. Завершить в пробирке реакция транскрипции путем добавления 1 мкл 0,5 М ЭДТА, рН 8. перемешать с помощью пипетки вверх и вниз.
2. Добавить 10 мкл 10 мг / мл тРНК, в качестве носителя для лучшего осаждения. Смешайте с помощью пипетки вверх и вниз.
3. Добавить 82,5 мкл 3 М ацетата аммония. Смешайте встряхиванием.
4. Добавить 273 мкл этанола. Смешайте встряхиванием.
5. Пусть стоять при комнатной температуре в течение 5 мин.
6. Спин течение 10 мин при полной скорости в микроцентрифуге при комнатной температуре. Удалите супернатант.
7. Вымойте гранул с 100 мкл 70% этанола.
8. Спин течение 10 мин при полной скорости в микроцентрифуге при комнатной температуре. Удалите супернатант.
9. Воздух сухой осадок в течение 10 мин.
10. Ресуспендируют осадок в 100 мкл бидистиллированной, ранее в автоклаве H ₂ O.
11. Количественная радиоактивность в жидкостном сцинтилляционном счетчике, аликвоту радиоактивно меченного зонда IRE и хранят при -80 ° С до использования. Замороженные аликвоты могут быть использованы на срок до 3 недель.

5. Получение нативного полиакриламидном геле в EMSA

1. Соберите гель (16 х 16 см) с помощью 1,5 мм проставки и гребень.
2. Чтобы приготовить 6% полиакриламидном геле родным, использовать растворы, приведенные в таблице 3 Смешайте 7,5 мл 40% акриламид:. Бис-акриламида, 5 мл 5-кратным КЭ и 37,5 млдвойную дистилляцию H ₂ O.
3. Добавить 0,5 мл 10% свежеприготовленного персульфата аммония (APS) и 25 мкл тетраметилэтилендиамина (TEMED).
4. Сразу залить раствор акриламида в геле и пусть он полимеризации. Подождите примерно 30 минут.
5. Соберите электрофореза с гелем, заполните танки с 0,5 × КЭ и соединиться с источником питания.

6. электрофоретической подвижности сдвига Анализ

1. Развести 25 мкг белкового экстракта из клеток или тканей с цитоплазматической буфере для лизиса (таблица 1) в общем объеме 10 мкл (более низкие концентрации белка также могут быть использованы). Держите на льду. При необходимости добавить 1 мкл 1: 4 разбавляют 2-меркаптоэтанола (2-Me), чтобы активировать спящий IRP1 (конечная концентрация: 2%) ^25.
2. Развести меченых IRE зонд в дважды дистиллированной H ₂ O в 200 000 копий в минуту / мкл, тепло денатурация при 95 °С в течение 1 мин, и остыть при комнатной температуре в течение по меньшей мере 5 мин.
3. Настройка реакции EMSA, добавив 1 мкл меченого ИРЭ зонда выписке белка.
4. Инкубировать в течение 20 мин при комнатной температуре.
5. Добавить 1 мкл 50 мг / мл гепарина в реакции (ингибировать неспецифические белковые взаимодействия с зондом ⁹⁾ и продолжают инкубацию в течение еще ​​10 мин. Алиготе исходного раствора гепарина (50 мг / мл) и хранят при -80 ° С.
6. При использовании длинных радиоактивными зондами (> 60 нуклеотидов), добавляют 1 мкл РНКазы Т1 (1 ед / мкл) и инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре, чтобы уменьшить неспецифическую белок связывания с зондом, и чтобы лучшее разделение РНК / белок Комплекс во время электрофореза.
7. Добавить 3 мкл загрузочного буфера (80% глицерин + бромфенола синего), перемешать и нагрузка на 6% неденатурирующем полиакриламидном геле.
8. Запустите гель в течение 60 мин при 130 V (5 В / см).
9. Transfer гель на большой фильтровальной бумаги и сухим.
10. Expose в пленку и развивать радиоавтографии. Время экспозиции может находиться в диапазоне от 1 часа (или меньше) до O / N.

Радиоактивно IRE проба была приготовлена, как описано в разделах 3 и 4 протокола. Последовательность зонда 5'-GGGCGAAUUC GAGCUCGGUA CCCGGGGAUC СГГ C UUCAA C AGUGC UUGGA CGGAUCCU-3 '; в выделенные жирным шрифтом нуклеотиды представляют собой непарный C остаток и цикл, которые являются критическими IRE особенности. Удельная активность зонда была 4,5 × 10 9 имп / мкг РНК.

Для оценки влияния железа возмущений на ИРЭ-связывающей активностью, мышиные RAW264.7 макрофаги не лечить, или лечить с гемина (источник железа) или десферриоксамин (железо хелатора). Лизаты получают и анализируют с помощью EMSA с зондом IRE (8000 импульсов в минуту / мкг белка). Типичные данные приведены на рисунке 1, с более короткими и более длинных экспозиций авторадиограмм на левой и правой панелей, соответственно. Мышиные IRE / IRP1 и IRE / IRP2 комплексы обладают различной подвижностью и два отдельные полосывидны в полосе 1, что соответствует необработанных клеток. Утюг комплексообразования глубоко побудило IRE-связывающих деятельность как IRP1 и IRP2 (дорожка 2), в то время как препараты железа уменьшается их (дорожка 3). Предварительное 2% 2-МЕ полностью активном IRP1 (нижняя панель), даже в экстрактах железных клетках, обработанных. Это свидетельствует о том, что железо возмущения не попадают на стабильность IRP1, а также служит в качестве контроля нагрузки. В отличие от предварительной обработки 2-МЕ ингибирует ИРЭ-связывающую активность в IRP2. БЫСТРЫЙ мигрирующие неспецифические полосы не зависит от железа.

Далее, мы проанализировали ИРЭ-связывающей активности в печени дикого типа, Irp1 - / - и Irp2 - / - мышей, ранее кормили в течение одной недели со стандартом или обогащенной железом диете (рис 2). Irp1 - / - и Irp2 - / - мышей были любезно предоставлены доктором МВт Hentze (EMBL, Гейдельберг). В диких экстрактов печени типа, IRP1 приходится на крупной фракции ИРЭ-связывающей активности и IRE / IRP2 комплексов были едвавидимые (дорожки 1, 2), что согласуется с предыдущими наблюдениями 26. IRP2 выставлены мощный ИРЭ-связывающей активности в экстрактах печени Irp1 - / - мышей (дорожки 3, 4). В этих условиях, не наблюдалось IRE / IRP1 комплексы. Кроме того, нет ИРЭ / IRP2 комплексы не образовывались в экстрактах печени Irp2 - / - мышей (дорожки 5, 6). Кормление мышей с высоким содержанием железа диете снижение печени ИРЭ-связывающая активность обоих IRP1 и IRP2; Этот эффект был более драматичным на IRP2 (полосы 7-12). Следует отметить, что после обработки дикого типа или Irp2 - / - экстрактов печени с 2-МЕ, ИРЭ-связывающая активность IRP1 была увеличена до точки, где она смещается почти все IRE зонд (это отчетливо наблюдается в более короткий воздействия авторадиограмм На левой панели).

Наконец, мы оценивали ИРЭ-связывающей активности в печени и селезенке дикого типа и Hjv - / - мышей (рис 3). Hjv - / - мышей были любезно предоставлены доктором НК-Эндрюс (Университет Дьюка, Северная Каролина). Эти животные представляют собой модельнаследственной гемохроматоз 27, болезнь системной перегрузки железом, где избыточное железо накапливается в паренхиматозных клеток, в то время как макрофаги ретикулоэндотелиальной остается дефицит железа 28. Как и ожидалось, печень Hjv - / - мышей (с железом загружен гепатоцитов) выставлены уменьшилось ИРЭ-связывающую активность по сравнению с дикого типа (полосы 1-4). С другой стороны, ИРЭ-связывающая активность была выше в селезенке Hjv - / - мышей (содержащие железо-дефицитной макрофаги; дорожки 5-8). Здесь опять, лечение 2-ME способствует почти полное смещение зонда IRE в экстрактах печени (см короче экспозиции авторадиограммах на левой панели).

Таблица 1. Цитоплазма буфера для лизиса.

1. Решение следуетавтоклавировать и хранить при комнатной температуре.
2. Ингибиторы протеазы, такие как 10 мкг / мл лейпептина и 0,1 мМ фенилметансульфонилфторид (PMSF) могут быть добавлены перед использованием.
3. Добавление свежего 1 мМ dithiotheritol рекомендуется для обнаружения IRP2 деятельности.

Таблица 2. Исходные растворы для в пробирке реакции транскрипции.

<сильные> Таблица 3. Стоковые растворы для не-денатурирующих электрофореза в полиакриламидном геле.

Для изготовления 1 л 5x КЭ, использовать 54 г трис-основани, 27,5 г борной кислоты и 20 мл 0,5 М ЭДТА (рН 8,0).

Рисунок 1. Железная зависимая регуляция IRE-связывающий деятельность в RAW264.7 макрофагов. 10 7 клеток были либо не лечить или лечить O / N с 100 мкМ гемина или десферриоксамин. Цитоплазматическая лизаты получали и анализировали с помощью EMSA с 32 P-меченного зонда ИРЭ в отсутствие (вверху) или в присутствии 2% 2-МЕ (нижней). Позиции ИРЭ / IRP1 и IRE / IRP2 комплексов и свободного ИРЭ зонда обозначены стрелками. Звезда указывает на неспецифическую группу. Более короткие и более длинные разоблачения авторадиограммах показаны в левой и правой панелях, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2. Анализ ИРЭ-связывающий деятельность в печени дикого типа (WT), Irp1 - / - и Irp2 - / -. Мышей в возрасте 5 недель мышей (п = 2 для каждого генотипа), все в C57BL / 6 фоне 29, помещали на стандарт или высокой железа диете (содержащей 2% карбонильного железа). После одной недели животные были умерщвлены. Печеночные белковые экстракты получали и анализировали с помощью EMSA с 32 P-меченного зонда ИРЭв отсутствие (вверху) или в присутствии 2% 2-ME (внизу). Позиции ИРЭ / IRP1 и IRE / IRP2 комплексов и свободного ИРЭ зонда обозначены стрелками. Звезда указывает на неспецифическую группу. Более короткие и более длинные разоблачения авторадиограммах показаны в левой и правой панелях, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3. Анализ ИРЭ-связывающий деятельность в печени и селезенке дикого типа (WT) и Hjv - / - мышей. 10 недель старых мышей (п = 2 для каждого генотипа), все в C57BL / 6 фоне 30, были подвергнуты эвтаназии. Печеночная и селезенки белковые экстракты получали и анализировали с помощью EMSA с 32 P-меченного зонда ИРЭ в отсутствие (вверху) или в присутствии2% 2-МЕ (внизу). Позиции ИРЭ / IRP1 и IRE / IRP2 комплексов и свободного ИРЭ зонда обозначены стрелками. Звезда указывает на неспецифическую группу. Более короткие и более длинные разоблачения авторадиограммах показаны в левой и правой панелях, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.