Здесь мы приводим протокол для анализа РНК / белковые взаимодействия. Сдвиг анализа электрофоретической подвижности (EMSA) основан на дифференциальной миграции РНК / белковые комплексы и свободной РНК в процессе электрофореза нативного гель. При использовании радиоактивно помеченных РНК-зонда, РНК / белковые комплексы могут быть визуализированы с помощью авторадиографии.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Электрофоретической подвижности сдвига анализа (EMSA) по изучению РНК-белковых взаимодействий: ИРЭ / IRP примера
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
РНК / белковые взаимодействия являются критическими для посттранскрипционных регуляторных путей. Среди наиболее изученных цитозольными РНК-связывающих белков железные регуляторные белки, IRP1 и IRP2. Они связывают гладить реактивные элементы (IRES) в нетранслируемых регионов (НТО) нескольких целевых мРНК, тем самым управляя перевод или стабильность мРНК. IRE / ПИВТ взаимодействия были широко изучены EMSA. Здесь мы опишем протокол EMSA для анализа ИРЭ-связывающую активность в IRP1 и IRP2, которые могут быть обобщены для оценки активности других РНК-связывающих белков, а также. Неочищенный лизат белков, содержащих РНК-связывающий белок, или очищенный препарат этого белка, инкубируют с избытком 32 P-меченного зонда РНК, что позволило для образования комплекса. Гепарин добавляется исключает неспецифическое белок, чтобы исследовать связывание. Затем смесь анализируют без денатурации электрофорезом на полиакриламидном геле. Бесплатно зондмигрирует быстро, в то время как РНК / белковый комплекс экспонатов отсталых мобильности; Таким образом, процедура также называется "гель задержка" или "bandshift" анализа. После завершения электрофореза гель сушат и РНК / белковые комплексы, а также свободный зонда, обнаруживаются с помощью авторадиографии. Общая цель протокола заключается в выявлении и количественной IRE / IRP и другие РНК / белковые взаимодействия. Кроме того, EMSA также может быть использован для определения специфичности, аффинности связывания и стехиометрию взаимодействия РНК / белок изучаемого.
Введение
EMSA был первоначально разработан для изучения связи ДНК-связывающих белков с последовательностями ДНК-мишени 1,2. Принцип одинаков для РНК / белковые взаимодействия 3, которая является предметом данной статьи. Вкратце, РНК отрицательно заряженные и будет мигрировать к аноду при не-денатурирующих электрофореза в полиакриламидном (или агарозных гелей). Миграция в геле зависит от размера РНК, которая пропорциональна его заряда. Специфическое связывание белка с РНК изменяет свою подвижность, и комплекс мигрирует медленнее по сравнению со свободной РНК. Это, главным образом, за счет увеличения молекулярной массы, но также к изменениям в ведении и, в....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Экспериментальные процедуры с мышами были утверждены Care комитета животных Университета МакГилл (протокол 4966) мимо.
1. Получение белковых экстрактов из культивируемых клеток
- Промыть культивируемые клетки дважды 10 мл охлажденного на льду забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS).
- Собрать прилипшие клетки или с резиновой полицейского или пластмассовым скребком клеток в 1 мл охлажденного льдом PBS, передачи суспензии в 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
- Спина в микроцентрифужных в течение 5 мин при 700 мкг, при 4 ° С. Отберите PBS.
- Добавить 100 мкл ледяной цитоплазматической буфера для ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Радиоактивно IRE проба была приготовлена, как описано в разделах 3 и 4 протокола. Последовательность зонда 5'-GGGCGAAUUC GAGCUCGGUA CCCGGGGAUC СГГ C UUCAA C AGUGC UUGGA CGGAUCCU-3 '; в выделенные жирным шрифтом нуклеотиды представляют собой непарный C остаток и цикл, которые являются критическими IRE особенности. Удельная активность зонда была 4,5 × 10 9 имп / мкг РНК.
Для оценки влияния железа возмущений на ИРЭ-связывающей активностью, мышиные RA.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы опишем протокол, который был разработан для изучения IRE-связывающих деятельности IRP1 и IRP2, и мы показываем репрезентативные данные. С помощью различных зондов, этот протокол также может быть скорректирована для изучения других РНК-связывающих белков. Важным шагом является размер зонда. Использование длинных зондов, который является общим, когда точное место связывания неизвестно, может привести к РНК / белковые комплексы, которые не мигрируют по-другому, чем в свободной РНК. В этом случае, желательно, для у.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантом от Канадского института исследований в области здравоохранения (MOP-86514).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| леупептин | SIGMA | L2884 | |
| PMSF | SIGMA | 78830 | |
| BioRad Protein Assay | BIORAD | 500-0006 | |
| T7 РНК-полимераза | Thermoscientific | EPO111 | |
| РНКаза Ингибитор ИНВИТРОГЕН | 15518-012 | ||
| UTP [альфа-32P] | Perkin-Elmer | ||
| Сцинтилляционная жидкость | Beckman Coulter | 141349 | |
| гепарином | SIGMA | H0777 | |
| Rnase T1 | Thermoscientific | EN0541 | |
| Наименование оборудования | |||
| Tissue Ruptor | Qiagen | 9001271 | |
| Сцинтилляционный счетчик | Beckman Coulter | LS6500 | |
| Protean II xi Cell | BIORAD | 165-1834 | |
| 20 луночных гребней | BIORAD | 165-1868 | толщиной 1,5 |
| мм 1,5 мм проставок | BIORAD | 165-1849 | |
| PowerPac | BIORAD | 164-5070 |
Ссылки
- Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525 (1981).
- Garner, M. M., Revzin, A.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
