Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Обращение с хлопковых крыс в исследованиях для доклинических оценки онколитических вирусов

9.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52232

⸱

24 ноября 2014 г.

 ,  , 
1Department of Pathology and Molecular Medicine, McMaster Immunology Research Centre, Institute for Infectious Disease Research, McMaster University

В этой статье

Краткое содержание

Хлопковые крысы чрезвычайно возбудимы и обладают сильной реакцией «беги или бей». Описан метод обработки, оптимизированный для снижения стресса у животных, что сделает хлопковых крыс более доступными в качестве доклинической модели.

Аннотация

Онколитические вирусы - это новая противоопухолевая терапия, способная нацеливаться на опухолевые клетки, оставляя здоровые клетки нетронутыми. Недавние исследования показали, что для того, чтобы эта стратегия была успешной, необходимо участие иммунной системы хозяина. Поэтому онколитическую виротерапию следует оценивать в контексте иммунокомпетентной модели. Кроме того, изучение противоопухолевой терапии на переносимых животных моделях может лучше обобщить результаты, полученные в клинических испытаниях. Хлопковые крысы, обычно используемые для изучения респираторных вирусов, являются привлекательной моделью для изучения онколитической виротерапии, поскольку сингенные модели карциномы молочной железы и остеосаркомы хорошо известны. Тем не менее, отсутствует опубликованная информация о правильной процедуре обращения с этими высоковозбудимыми грызунами. Описанный подход к обработке и отлову сводит к минимуму стресс животных и облегчает проведение экспериментов. Этот метод основан на способности исследователя сохранять спокойствие во время работы и своевременно выполнять процедуры. Наконец, мы опишем, как подготовить опухолевые клетки молочной железы хлопковой крысы к последовательному образованию подкожной опухоли, а также как выполнять внутриопухолевые и внутрибрюшинные инъекции. Эти методы могут быть применены к широкому спектру исследований, способствующих развитию хлопковой крысы в качестве актуальной доклинической модели для изучения противоопухолевой терапии.

Введение

Онколитического вируса (OV) избирательно реплицироваться в опухолевых клетках, используя биохимические различия между нормальными и опухолевыми клетками 1,2. Существуют два типа ОВС: те, которые не требуют мутацию, чтобы достичь селективного онколиза, называют природе вирусов дикого типа и те, которые должны быть разработаны, чтобы достичь селективного онколиза. Сбор мутаций в пределах данного типа опухоли определяет природу селективного преимущества роста над нормальными клетками для О.В. 2. Безопасность и выгода от использования ОВС была продемонстрирована в клинических испытаниях 3-7. Несмотря на достижения в области онколитической виротерапии существуют пробелы между доклинических и клинических результатов, предполагая, что лучшие модели необходимы для оценки противоопухолевой эффективности ОВС.

Крупного рогатого скота типа герпеса 1 (BHV-1) является членом семьи Herpesviridae и Alphaherpesviridae подсемейства. BHV-1 INITIТочные бычьей комплекс респираторных заболеваний у крупного рогатого скота, проявляется в самых разнообразных симптомов, напоминающих простуду 8,9. BHV-1 связывается крепления и ввода рецепторы, используемые HSV-1, такие как гепарансульфата и nectin-1 10. Тем не менее, он связывается CD155 в месте nectin-2 10. BHV-1 имеет очень узкий спектр хозяев, так что он не в состоянии эффективно ввести и инициировать репликацию в нормальных и трансформированных мышиных клеток 3,4,10. Это делает использование обычных моделей мышей проблематично. Онколитический емкость BHV-1 была продемонстрирована ин витро 11,12. BHV-1, как было показано, чтобы инициировать репликацию в и убивать опухолевые клетки человека из различных гистологических происхождения, включая клетки рака молочной железы и рака молочной железы инициирования клеток 11,12. Тем не менее, противоопухолевое емкость BHV-1 должны быть оценены в естественных условиях в контексте иммунитетом.

Аденовируса человека (Ad), для которыхЕсть 57 определены серотипов, наиболее часто вызывает респираторные заболевания у людей. Онколитических векторы объявления были оценены по их противоопухолевой эффективности с несколькими продвижения в клинических испытаниях 13-15. Несмотря на многообещающие доклинических данных, клинические результаты не оправдали ожиданий. Модели ксенотрансплантата человеческой опухоли, как правило, используется для изучения противоопухолевой эффективности векторов объявление, хотя они обладают ослабляется иммунный ответ на вирус 16,17. Кроме того, сингенные мышиные модели непермиссивные инфекции объявления, что делает оценку иммунного ответа с помощью этих моделей непрактичные 17,18.

Иммунная система хозяина была определена как наиболее влиятельного механизма, посредством которого OVS вызывать гибель клеток опухоли 19. Ответы Противоопухолевые между толеризованной и без толеризованной опухоли антигеном (ТАА) модели отличаются и может значительно повлиять на успех О.В. терапии. HSV-1 О.В. KM100 (ICP0 N212VP16 в 1814 году 20) 20,21 вызвало регрессию опухоли у 80% мышей с опухолями в мышиной полиома Средний Т-антигена модели 22 Рак молочной железы. Тем не менее, в ее-2 моделей / Neu, противоопухолевая эффективность из KM100 колебалась от 20% полной регрессии в сингенных мышей и опухолевых застой в трансгенных, HER2-толеризованной мышей. Вместе эти данные подчеркивают важность полного оценке OVS с помощью животных моделей, которые лучше всего повторять человеческую иммунную пейзаж, чтобы в полной мере понять, какие функции определения терапевтического успеха.

Хлопок крыса (Sigmodon hispidus), коренными жителями Северной и Южной Америки, наиболее часто используется в качестве модели респираторно-синцитиальный вирусной инфекции (как рассмотрено в 5). Хлопковые крысы также используется в-BHV-1 анти исследований вакцинации, поскольку они воспроизводят в патологии, связанной с бычьим респираторных заболеваний сложного 6,23. Кроме того, BHV-1 инфекции хлопковых крысявляется иммуногенным, вызывая устойчивый слизистых оболочек и системного иммунных ответов 6,23-25. Клеточные линии были получены в результате спонтанного фибросаркому и остеосарком молочной железы (LCRT) и кости (CCRT и VCRT), соответственно 26. Крысах были использованы для оценки эффективности в естественных условиях онколитических векторов объявление как они восприимчивы к инфекции объявление и имеет аналогичные патологию человека 27-29. Использование ослабленным иммунитетом моделей для предварительной клинической оценки OVS не только менее свидетельствует о клинических ответов на терапии, но они не принимают во внимание роль иммунной системы в онколитической виротерапии 30,31. Таким образом, сингенная и опухолевые толеризованной модели хлопок крыса молочной железы и остеосаркомы являются актуальными моделями, в которых для оценки доклинических эффективность OVS, таких как BHV-1 и объявления, которые не могут быть исследованы с помощью обычных моделей мышиных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Примечание: протоколы, используемые были утверждены нашей институциональной животных Совета по этике исследований на Университете МакМастер в соответствии с Канадским советом по руководящих принципов по уходу за животными. Эксперименты проводились на Университет МакМастер Центральный животных фонда.

1. Культивирование LCRT Клетки

  1. Культура LCRT клетки в среде Игла в модификации Игла (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамина, 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина. Поддержание клеток в Т-150 колбу с тканевой культурой при 37 ° С и 5% СО 2. Прохождение клетки, когда они образуют 90% сливающийся монослой (каждые 2-3 дня, рисунок 1).
  2. Предварительно теплой 1x забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), 1x трипсина и среднего C водяной бане 37 ° в течение 10 мин до разделения клеток.
  3. Аспирируйте среднего из колбы и промыть клетки с 5 мл 1x PBS.
  4. После промывки, аспирация PBS и инкубироватьклетки с 2 мл трипсина 1х, пока клетки диссоциируют из колбы (~ 2 мин).
  5. Ресуспендируют клеток в 8 мл среды (в общей сложности 10 мл клеточной суспензии) и аккуратно пипеткой вверх и вниз, чтобы разбить скопления клеток.
  6. Поддерживать клетки в T-150 колбу путем посева 1 мл клеточной суспензии в 24 мл среды (в общей сложности 25 мл на Т-150) и рок-колбы осторожно из стороны в сторону. Поддерживать клетки при 37 ° С и 5% СО 2 до следующего раскола.

2. Оценка репликации вирусов и цитотоксичности в LCRT клеток

  1. Вирус Репликация
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вирусные конструкции, выражающие флуоресцентной метки, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP), под управлением эндогенных вирусных промоторов облегчения визуализации заражения вирусом и распространять с помощью флуоресцентной пластины читателей.
    1. Семенной LCRT клеток в культуре пластин, оставляя хорошо для подсчета. Семенной клетки таким образом, что они будут на 80-90% сплошности на день позже. Использование концентрации 10 5 челLs / мл (100 мкл на лунку) для получения желаемого слияния на день позже в 96-луночных плоскодонных планшетах.
    2. На следующий день, предварительно теплой 1X PBS, 1x трипсина, полной и свободной от сыворотки средой, в водяной бане при 37 ° в течение 10 мин до начала эксперимента.
    3. Отберите среду из подсчета хорошо и промыть клетки с 5 мл 1x PBS, тряся его по поверхности хорошо.
    4. После промывки, аспирация PBS и инкубировали клетки с 2 мл трипсина 1х до клетки диссоциируют из колбы (~ 2 мин).
    5. Ресуспендируют клеток в соответствующем объеме полной среде с получением плотности клеток в счетной диапазоне с помощью гемоцитометра. Для обеспечения точного подсчета клеток, тщательно перемешать клеточной суспензии до инокуляции гемоцитометра с помощью пипетки вверх и вниз.
    6. Определить объем вирусного штамма, необходимого для инфекции в желаемом множественности инфекции (MOI).
      Обязательно Paque единиц (БОЕ) = количество посеянных клеток * МВД(БОЕ / клетка)
      Объем вирусного штамма требуется = требуемая бое / вирус Stock титр (БОЕ / мл)
    7. Подготовка вируса инокулята в среде без сыворотки в пробирках. Тщательно перемешать на вортексе или пипетки перед добавлением инокулята в клетки.
    8. Инфицировать клетки в течение 1 часа при 37 ° С, после чего применить обслуживания накладку DMEM + 1% FBS.
    9. Сканирование пластины один и два дня после заражения (PI) для визуализации флуоресценции GFP.
  2. Вирус цитотоксичности
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните ресазурин цитотоксичности в условиях низкой освещенности, как соединение светочувствительной. И содержащую среду должны быть включены только для коррекции фоновой флуоресценции.
    1. Подготовка 5% (объем / объем) раствор резазурин в 1x PBS. Смешайте решение с помощью пипетки.
    2. Отберите среду из клеток и применять 5% раствор резазурин. Включить и среду, содержащую только для коррекции фоновой флуоресценции.
    3. Инкубируйте клетки в течение 30 мин при 37 ° С, послекоторый гласил флуоресценции с помощью флуоресцентного планшет-ридер (возбуждение 530 нм, эмиссия 595 нм).
    4. Анализ данных относительно неинфицированных лиц контрольной группы коррекции фоновой флуоресценции.

3. Корпус и регулировать

  1. Корпус и диета
    1. Дом крысах индивидуально для уменьшения внутренней борьбы в поликарбонатных крыс клетки, содержащие грызунов Солома (1/8 "кукурузник постельных принадлежностей), раздел ПВХ трубы длиной не более 8 дюймов и nestlets как обогащение (рисунок 2).
    2. Используйте защищаемого стальная корзина сидеть возвышаться из клетки и содержат корм для грызунов и бутылку воды.
      Примечание: Эта установка клетки позволит безопасно и легко захвата животных, с размещением трубы обогащения по отношению к концу клетки существа первостепенное значение.
  2. Обработка
    1. Ручка хлопка крыс утром, до раундов за животными техников, чтобы избежать волнующие их, прежде чемПроцедура.
    2. Во время всех процедур, носить толстые кожаные перчатки для защиты.
    3. Как животные, прежде всего, остается в трубах обогащению, использовать их для передачи крыс в новую клетку во обычной очистки. Кроме того, открыть клетку немного, чтобы обработчик для достижения их руку в, животных, то, может быть ограничено по scruffing кожу чуть выше плеч и нажимая. Уход практика не применять чрезмерную силу, как животное может укусить свой язык.
    4. Будьте терпеливы и использовать твердую руку, так как животные имеют сильную реакцию полета или бой и постараемся, чтобы избежать захвата бег и прыжки из клетки. Главное, не справиться животных за хвост, как будет происходить degloving.
    5. Ловушка животных в их обогащения труб более прямой обработки. Это значительно уменьшает повреждения и сбежать.

4. Захват и Анестезия

  1. Захват
    1. Носите толстые кожаные перчатки для защитыионов в всех процедур.
    2. Используйте большую прозрачную пластиковую емкость с отверстиями для воздуха и крышкой, обезболивающий индукции камеры достаточно большой, чтобы соответствовать контейнер и носовой обтекатель, установленное на выходе газового шланга (рис 3).
    3. Работа в парах, чтобы сделать процедуру более эффективной и сократить время экспозиции животных в ИФ, ингаляции анестетика. Убедитесь, что один исследователь отвечает за открытие и замены стальное покрытие на клетке и крышке индукции камеры (обработчик 1 #) и их помощник отвечает за захват животного в трубке и транспорта на индукции камеры (обработчик # 2).
    4. Поместите клетку на плоской поверхности, и удалить внешнюю крышку. Приподнимите лоток подачи стали и медленно маневрировать трубку обогащению, так что параллельно сторонам каркаса и против задней части. Если необходимо, используйте объект маневрировать трубку обогащению, не открывая клетку, чтобы избежать перемешивания животное (ручкаR # 1).
    5. Если животное становится взволнованным и оставляет трубку, время, достаточное для животных, чтобы расслабиться и вновь поселиться в трубку (обработчика # 1).
    6. Медленно и намеренно поднять край крышки стали дальше всего от трубки обогащения, сохраняя другой конец в контакте с сепаратором. Сделать пространство, достаточное для пластиковой тары (обработчик # 2).
    7. Одним плавным, быстрым движением, нажмите на пластиковый контейнер возвышаться трубки по обогащению урана. Поддержание контакт контейнера с стороне клетки, захвата животное в трубе. Выполните шаги 4.1.6 и 4.1.7 как можно быстрее (обработчика # 2).
    8. Снимите лоток подачи стальной и дать пластиковую крышку контейнера с укротителем # 2 (обработчик 1 #). Вставьте пластиковую крышку между боковыми клетки и контейнером, вспоминая придатков захваченных животного в процессе. Не закрывать контейнер, так как это сделает следующий шаг сложнее (обработчик # 2).
  2. AnesthesАйова
    1. Убедитесь, что контейнер остается закрытым и транспортировки животного в индукции камеры. Быстро разместить животное в камере и снимите крышку контейнера одним движением жидкости (обработчик # 2). Откройте и сразу же заменить крышку индукции камеры (обработчик # 1).
    2. Включите потока изофлюрана к индукции камеры (5 л / мин) и контролировать животное на наличие признаков летаргии, после чего быстро скользят животное из трубки и контейнер, удаляя как с индукционной камеры для облегчения циркуляции газа.
    3. Когда крыса полностью под наркозом, переместите его рабочей поверхности и поместите на нос и рот в нос конуса (рис 3). Крыса полностью под наркозом, когда он не отвечает на силового ног крайнем случае.
    4. Поместите ветеринар вазелин глазной мази на глазах животного, чтобы предотвратить сухость и ссадины. Это важный шаг, как хлопок крыс имеют большие глаза, которые могут быть подвержены инфекции в случае травмы.
    5. Тщательно контролировать и поддерживать постоянную частоту дыхания и убедитесь, что нос животного остается в носовом конусе фитинга на протяжении всей процедуры. Регулировка скорости потока изофлуран соответствующим образом. Количество изофлуран анестезии необходимо каждое животное будет меняться.
    6. После процедуры можно вернуться животное в клетку и убедиться, что он восстанавливает полную мобильность и грудины лежачее положение.

5. Подготовка LCRT клеток для подкожного опухолевого образования

ПРИМЕЧАНИЕ: Один T-150 колбу LCRT (90% слияния) дает около 2 х 10 7 клеток. Стройте количество Т-150 колб, необходимых от общего числа клеток, необходимых. Семенной дополнительные колбы, чтобы обеспечить общее количество клеток, необходимых получают и для размещения клеток, утраченных в процессе подготовки и те, которые необходимы для дополнительных инъекций. Хранить клетки на льду, когда это возможно, чтобы продлить жизнеспособность клеток.

  1. Для уборки клетки, аспирация среды из колбы апD промывки клеток с 5 мл 1x PBS.
  2. Аспирируйте PBS, и инкубировали клетки с 2 мл трипсина 1х, пока клетки диссоциируют из колбы (~ 2 мин).
  3. Ресуспендируют клеток в 8 мл среды (в общей сложности 10 мл клеточной суспензии) и аккуратно пипеткой вверх и вниз, чтобы разбить скопления клеток. Продолжайте собирать клетки от дополнительных колбах.
  4. Бассейн все клеточные суспензии в одну коническую трубку, примерно в 4 Т-150 в 50 мл коническую трубку.
  5. Центрифуга трубки на 160 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
  6. Аспирируйте средних и ресуспендируют осадок клеток в соответствующий объем PBS (10 мл PBS на Т-150) с получением плотности клеток в счетной диапазоне с помощью гемоцитометра. Для обеспечения точного подсчета клеток, тщательно перемешать клеточной суспензии перед загрузкой гемоцитометр с помощью пипетки вверх и вниз.
  7. Рассчитать общее количество клеток:
    Общее количество собранных клеток = подсчета клеток (клеток / мл) х ресуспендирование объем (мл)
  8. ОпределятьОбъем клеточной суспензии требуется для всех инъекций. Сделайте 2-3 дополнительных доз в эксперименте. В общей сложности 5 × 10 5 клеток LCRT вводили подкожно образуют пальпируемых опухолей в течение 3-4 дней.
    Общее количество клеток, необходимых = 5 х 10 5 клеток х общего количества доз,
    Объем клеточной суспензии требуется (мл) = (общая клетки, необходимые * сумма объемов закачки) / (общее число клеток, полученных)
  9. Пипеткой необходимый объем клеточной суспензии в коническую пробирку, содержащую PBS и тщательно перемешать. Кратные отдельные инъекции (100 мкл) в пробирки Эппендорфа. Поддержание труб на льду во время процедуры инъекции.

6. Инъекции

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните процедуры с двух исследователей, один для выполнения инъекций, а остальные мониторы частота дыхания животного и общее состояние под наркозом. Используйте инсулиновые шприцы (29 г х 1/2 ", 0,3 мл) для всех инъекций и новой иглой длякаждое животное.

  1. Подкожные инъекции
    1. Захват и обезболить животное (раздел 4).
    2. Бритье место инъекции, используя ножницы. Хлопок крыса мех густой и требует резкого триммер, чтобы получить гладкую поверхность для инъекций. Очистите место инъекции 70% -ного этанола с помощью ватного тампона и дайте ему полностью испариться, прежде чем продолжить.
    3. Загрузка шприцы (29 г х 1/2 ", 0,3 мл) с клетками путем составления медленно и неуклонно. Если пузырьки видны фильм шприц с какой-либо силой. После того, как пузырьки в верхней толкать поршень до жидкости в верхней части иглы.
    4. Подтяжка кожи в месте инъекции (называется палаток кожи) и вставить иглу конической стороной вверх. Убедитесь, что игла движется свободно под кожу, чтобы избежать инъекций внутримышечно.
    5. Выгнать содержимое шприца равномерно и медленно. Извлеките иглу конической стороной вниз.
  2. Внутриопухолевых инъекции
    1. Захватбы обезболить животное (раздел 4).
    2. Очистите место инъекции 70% -ного этанола с помощью ватного тампона и дайте ему полностью испариться, прежде чем продолжить.
    3. Загрузка шприцы (29 г х 1/2 ", 0,3 мл) с вирусом посевного путем составления медленно и неуклонно, удерживая иглу в вертикальном положении. Если пузырьки видны фильм шприц с какой-либо силой. После того, как пузырьки в верхней нажатием затем плунжера, пока жидкость не находится в верхней части иглы.
    4. Вставить иглу конической стороной вверх в опухоль и удалить содержимое шприца равномерно и медленно при перемещении иглы в веерообразной модели, частично извлечение иглы перед каждым движением, чтобы предотвратить рваные раны опухоли. Извлеките иглу конической стороной вниз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: подкожные опухоли LCRT быстро растет, достигая примерно 100 мм 3 в течение 5-7 дней. Кроме того, некротические и геморрагические центров часто образуют на поверхности опухоли в течение нескольких дней и требуют CAreful мониторинг (Рисунок 4).
  3. Внутрибрюшинные инъекции
    1. Захват и обезболить животное (раздел 4).
    2. Очистите место инъекции 70% -ного этанола с помощью ватных тампонов и дайте ему полностью испариться, прежде чем продолжить.
    3. Загрузка шприцы (29 г х 1/2 ", 0,3 мл) с препаратом путем составления медленно и неуклонно. Если пузырьки видны фильм шприц с какой-либо силой. После того, как пузырьки в верхней нажатием затем плунжера, пока жидкость не находится в верхней части иглы.
    4. Вставьте иглу в правом нижнем квадранте живота. Оттяните на поршень, чтобы гарантировать, что кровь или фекалии не отсасывали, это указывает на неправильное расположение иглы. Если это происходит, вывести иглы и подготовить новый шприц. Когда игла установлена ​​правильно, изгнать содержимое шприца равномерно и медленно.

7. удаления опухоли и Necropsy

  1. Сбор и очистить альл инструменты с 70% этанола до эвтаназии животного.
  2. Эвтаназии животное желаемым способом, CO 2 ингаляции (2 л / мин в течение 5-10 мин) рекомендуется. Осмотрите животное для каких-либо патологий в состоянии тела.
  3. Место животное в спинной лежачее положение на вскрытии борту и очистить животное с 70% этанола.
  4. Используйте пинцет, чтобы поднять кожу в нижней части живота. Вырезать через кожу и мышцы с помощью ножниц и сделать медиальной разрез, идущую по длине животного (анус до подбородка).
  5. Разрежьте грудной клетки, делая два надреза, один с боков до стороне грудной клетки и один по грудине, чтобы разоблачить сердце и легкие. Проверьте долях легких для любых метастазов 27,29.
  6. Осмотрите все органы для нарушений и записывать любые изменения по цвету, размеру и консистенции. Если необходимо, разрежьте органы с помощью скальпеля, чтобы изучить внутренние ткани. В частности, исследовать печень, почки, селезенка и желудочно-кишечный тракт,
  7. Проверьте лимфатические узлы метастазов и увеличение 27,29.
  8. Для сбора опухоль, чтобы боковые разрезы выше и ниже опухоли, так что кожа может быть отстранилась от тела с помощью пинцета. В то время как крепко держит кожу с помощью пинцета, использовать скальпель, чтобы тщательно удалить опухоль, сокращая между опухолью и дермы (рисунок 5).
  9. Сразу же место опухоли в маркированный контейнер 10% нейтральный буферный формалин.
  10. В зависимости от размера опухоли, позвольте 1-2 дней (≤ 2 мм, малый) или 5-6 дней (> 2 мм, большой) для фиксации перед приготовлением разделы для гистологического анализа (рисунок 6).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Из-за чрезвычайно возбудимой природе хлопковых крыс, будучи знакомы с использованием процедур и оптимизированные для снижения нагрузки животных облегчит их использование в качестве доклинической модели животных. Использование надлежащих методов обработки также позволит свести к минимуму риск для исследователя.

При использовании хлопковых хомяков крайне важно сохранять спокойствие. Крысы очень возбудимы и будет пытаться избежать их клетку. Использование в трубе обогащения и nestlets сведут к ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Хлопковые крысы очень возбудимы и обладают сильной реакцией на бегство. Поэтому следует проявлять особую осторожность, чтобы свести к минимуму любой чрезмерный стресс для животного. Описанная конфигурация клетки позволит безопасно и легко отлавливать животных, при этом размещение развивающей трубки имеет первостепенное значение. При установке клеток убедитесь, что пробирки для обогащения соответствуют требованиям к размеру и форме и расположены в правильной ориентации в клетке. Также важно убедиться, что все технические ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы признают, что нет никаких финансовых конфликтов интересов, связанных с этим исследованием.

Благодарности

Брианна Каддингтон является стипендиатом Канадского фонда рака молочной железы. Эта работа была спонсирована операционными грантами от Общества исследования рака и Исследовательского института Канадского онкологического общества (ранее Канадский альянс по исследованию рака молочной железы). Мы благодарим Энн Толлефсон (Медицинский факультет Университета Сент-Луиса) за LCRT-клетки, а также доктора Кэтлин Делани и Марион Коррик за техническую помощь в размещении хлопковых крыс и седативных препаратах.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Дульбекко s модифицированный Eagle' s medium Gibco11965-092Можно использовать любую марку 
1X Фосфатно-солевой буфер Может быть приготовлен в лаборатории, фильтр для стерилизации
200 мМ L-глутаминаGibco25030164может использовать любую марку
100x Антибиотик-антимикотик;Gibco15240-062Можно использовать любую марку
фетальной бычьей сывороткиQuality Biological Inc.110-001-101HIМожно использовать любую марку
T-150cm2 колбу для культуры тканейFisher Scientific14-826-80Можно использовать любую марку
1X TypLE ExpressLife Technologies12604-013
12-луночный планшет для клеточной культуры, плоское дноFisher Scientific08-772-29Можно использовать любую марку, необходимо обрабатывать культуру тканей
alamarBlueLife ТехнологииDAL1025Можно использовать альтернативный реагент для определения жизнеспособности клеток
8640 Teklad 22/5 Диета для грызуновHarlan 8640
1/8" подстилка для грызунов кукурузного початкаHarlan7092
ГнездаAncare-Изготовленыиз целлюлозного первичного хлопкового волокна, беспыльные и автоклавируемые
конические пробирки 50 млFisher Scientific14-432-22Можно использовать любую марку, должен быть стерильным
Изофлуран USP, 99,9 %, ингаляционный анестетикPharmaceutical Partners of Canada Inc.M60302
70% этанолМожно приготовить в лаборатории
10% нейтральный буферизованный формалинSigma-AldrichHT501128Можно использовать любую марку
NAPCO NapFlow 1200 Класс II A/B3 Биобезопасный шкаф для микробиологической безопасности (колпак для клеточных культур)Модель NAPCOИспользуемая в настоящее время недоступнаМожно использовать любую марку
Thermo Fisher Scientific Precision Нагреваемая водяная баня Fisher Научнаямодель в настоящее время не доступна Может использовать любую марку
[header]
Reichert Bright-line гемацитометрSigma-AldrichZ359629Можно использовать любую марку
Typhoon Trio BioAnalyzer Используемая модель GE Healthcare Life Sciencesнастоящее время недоступна Можно использовать любой считыватель флуоресцентных пластин
Tecan Safire2 Мультидетектирующий микропланшетный считывательTecan Модель бывшегов употреблении в настоящее время недоступна Можно использовать любой считыватель флуоресцентных пластин
Настольная центрифуга Allegra 6RBeckman Coulter366816Можно использовать любую марку
Настольный наркозный аппаратVetEquipМодель б/у в настоящее время не доступна Можно использовать любую марку, должен быть портативным
Мини-машинки для стрижки арахисаWahlМожно использовать любую марку маленьких машинок для стрижки
29 г x 1/2', 0,3 млBD329464Можно использовать любую марку. Рекомендуется использовать инсулиновые шприцы, так как они облегчают инъекции через крысу». жесткая кожа. 
Ватные палочкиMedPro018-425Можно использовать любую марку
Остроконечные ножницы для рассеченияFisher Scientific8940Можно использовать любую марку
Рассекающие тканевые щипцыFisher Scientific13-812-41Можно использовать любую марку
в инсулина

Ссылки

  1. Cervantes-Garcia, D., Ortiz-Lopez, R., Mayek-Perez, N., Rojas-Martinez, A. Oncolytic virotherapy. Ann Hepatol. 7 (1), 34-45 (2008).
  2. Vaha-Koskela, M. J., Heikkila, J. E., Hinkkanen, A. E. Oncolytic viruses in cancer therapy. Cancer Lett. 254 (2), 178-216 (2007).
  3. Abril, C., et al. Both viral and host factors contribute to neurovirulence of bovine herpesviruses 1 and 5 in interferon receptor-deficient mice. J Virol. 78 (7), 3644-3653 (2004).
  4. Nakamichi, K., Matsumoto, Y., Otsuka, H. Defective infection of bovine herpesvirus 1 in non-permissive murine cells. J Vet Med Sci. 63 (10), 1139-1142 (2001).
  5. Boukhvalova, M. S., Blanco, J. C. The cotton rat sigmodon hispidus model of respiratory syncytial virus infection. Curr Top Microbiol Immunol. 372, 347-358 (2013).
  6. Papp, Z., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. Induction of immunity in the respiratory tract and protection from bovine herpesvirus type 1 infection by different routes of immunization with recombinant adenovirus. Viral Immunol. 11 (2), 79-91 (1998).
  7. Hughes, T. C. R., Lilley, C. E., Ponce, R., Kaufman, H. L. Critical analysis of an oncolytic herpesvirus encoding granulocyte-macrophage colony stimulating factor for the treatment of malignant melanoma. Journal of Oncolytic Virotherapy. 3, 11-20 (2014).
  8. Jones, C., Chowdhury, S. A review of the biology of bovine herpesvirus type 1 (BHV-1), its role as a cofactor in the bovine respiratory disease complex and development of improved vaccines. Anim Health Res Rev. 8 (2), 187-205 (2007).
  9. Jones, C., Chowdhury, S. Bovine herpesvirus type 1 (BHV-1) is an important cofactor in the bovine respiratory disease complex. Vet Clin North Am Food Anim Pract. 26 (2), 303-321 (2010).
  10. Hushur, O., Takashima, Y., Matsumoto, Y., Otsuka, H. Restriction of bovine herpesvirus 1 (BHV-1) growth in non-permissive cells beyond the expression of immediate early genes. J Vet Med Sci. 66 (4), 453-455 (2004).
  11. Cuddington, B. P., Dyer, A. L., Workenhe, S. T., Mossman, K. L. Oncolytic bovine herpesvirus type 1 infects and kills breast tumor cells and breast cancer-initiating cells irrespective of tumor subtype. Cancer Gene Ther. 20 (5), 282-289 (2013).
  12. Cuddington, B. P., Mossman, K. L. Permissiveness of Human Cancer Cells to Oncolytic Bovine Herpesvirus 1 Is Mediated in Part by KRAS Activity. J Virol. 88 (12), 6885-6895 (2014).
  13. Small, E. J., et al. A phase I trial of intravenous CG7870, a replication-selective, prostate-specific antigen-targeted oncolytic adenovirus, for the treatment of hormone-refractory, metastatic prostate cancer. Mol Ther. 14 (1), 107-117 (2006).
  14. Freytag, S. O., et al. Phase I study of replication-competent adenovirus-mediated double suicide gene therapy for the treatment of locally recurrent prostate cancer. Cancer Res. 62 (17), 4968-4976 (2002).
  15. Benjamin, R., Helman, L., Meyers, P., Reaman, G. A phase I/II dose escalation and activity study of intravenous injections of OCaP1 for subjects with refractory osteosarcoma metastatic to lung. Hum Gene Ther. 12 (12), 1591-1593 (2001).
  16. Prince, G. A. The Cotton Rat in Biomedical Research. Animal Welfare Information Center Newsletter. 5 (2), Available from: http://www.nal.usda.gov/awic/newsletters/v5n2/5n2princ.htm 3-5 (1994).
  17. Tsai, J. C., Garlinghouse, G., McDonnell, P. J., Trousdale, M. D. An experimental animal model of adenovirus-induced ocular disease. The cotton rat. Arch Ophthalmol. 110 (8), 1167-1170 (1992).
  18. Ginsberg, H. S., et al. A mouse model for investigating the molecular pathogenesis of adenovirus pneumonia. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (5), 1651-1655 (1991).
  19. Russell, S. J., Peng, K. W., Bell, J. C. Oncolytic virotherapy. Nat Biotechnol. 30 (7), 658-670 (2012).
  20. Mossman, K. L., Saffran, H. A., Smiley, J. R. Herpes simplex virus ICP0 mutants are hypersensitive to interferon. J Virol. 74 (4), 2052-2056 (2000).
  21. Mossman, K. L., Smiley, J. R. Herpes simplex virus ICP0 and ICP34.5 counteract distinct interferon-induced barriers to virus replication. J Virol. 76 (4), 1995-1998 (2002).
  22. Hummel, J. L., Safroneeva, E., Mossman, K. L. The role of ICP0-Null HSV-1 and interferon signaling defects in the effective treatment of breast adenocarcinoma. Mol Ther. 12 (6), 1101-1110 (2005).
  23. Papp, Z., Middleton, D. M., Mittal, S. K., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. Mucosal immunization with recombinant adenoviruses: induction of immunity and protection of cotton rats against respiratory bovine herpesvirus type 1 infection. J Gen Virol. 78 (11), 2933-2943 (1997).
  24. Papp, Z., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. The effect of pre-existing adenovirus-specific immunity on immune responses induced by recombinant adenovirus expressing glycoprotein D of bovine herpesvirus type 1. Vaccine. 17 (7-8), 933-943 (1999).
  25. Mittal, S. K., et al. Induction of systemic and mucosal immune responses in cotton rats immunized with human adenovirus type 5 recombinants expressing the full and truncated forms of bovine herpesvirus type 1 glycoprotein gD. Virology. 222 (2), 299-309 (1996).
  26. Steel, J. C., et al. Syngeneic Cotton Rat Cancer Model for Replicating Adenoviral Vectors. Molecular Therapy. 13 (1), 123(2006).
  27. Toth, K., et al. Cotton rat tumor model for the evaluation of oncolytic adenoviruses. Hum Gene Ther. 16 (1), 139-146 (2005).
  28. Toth, K., Spencer, J. F., Wold, W. S. Immunocompetent, semi-permissive cotton rat tumor model for the evaluation of oncolytic adenoviruses. Methods Mol Med. 130, 157-168 (2007).
  29. Steel, J. C., et al. Immunocompetent syngeneic cotton rat tumor models for the assessment of replication-competent oncolytic adenovirus. Virology. 369 (1), 131-142 (2007).
  30. Workenhe, S. T., et al. Immunogenic HSV-mediated oncolysis shapes the antitumor immune response and contributes to therapeutic efficacy. Mol Ther. 22 (1), 123-131 (2014).
  31. Sobol, P. T., et al. Adaptive antiviral immunity is a determinant of the therapeutic success of oncolytic virotherapy. Mol Ther. 19 (2), 335-344 (2011).
  32. Prince, G. A. The Cotton Rat in Biomedical Research. Animal Welfare Information Center Newsletter. 5 (2), http://www.nal.usda.gov/awic/newsletters/v5n2/5n2princ.htm (1994).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Обращение с хлопковых крыс в исследованиях для доклинических оценки онколитических вирусов
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.