Мы предоставляем подробное описание протокола для проточного цитометрического анализа поверхностных антигенов и/или внутриклеточных антигенов в типах нейронных клеток. Объясняются важнейшие аспекты планирования экспериментов, пошаговые методологические процедуры и фундаментальные принципы проточной цитометрии, чтобы нейробиологи могли использовать эту мощную технологию.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Проточной цитометрии протоколы для поверхностных и внутриклеточных антиген анализ нейронных типов клеток
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Проточная цитометрия широко используется для определения клеточных популяций в иммунологии, гематологии и онкологии. Здесь мы приводим подробное описание протоколов проточного цитометрического анализа кластера дифференцировочных (CD) поверхностных антигенов и внутриклеточных антигенов в типах нервных клеток. Наше пошаговое описание методических процедур включает в себя: сбор нейронных культур in vitro, необязательный этап мечения карбоксифлуоресцеином сукцинимидиловым эфиром (CFSE), за которым следует окрашивание поверхности антигена конъюгированными антителами к CD (например, CD24, CD54) и последующее внутриклеточное обнаружение антигена с помощью первичных/вторичных антител или флуоресцентно меченных Fab-фрагментов (мечение Зеноном). В видео демонстрируются наиболее важные шаги. Кроме того, кратко объясняются принципы планирования экспериментов, включения критических элементов управления и основы проточного цитометрического анализа (идентификация целевой популяции и исключение мусора; стратегия стробирования; компенсация спектрального перекрытия) для того, чтобы нейробиологи с ограниченными знаниями или специальной подготовкой в области проточной цитометрии могли оценить ее полезность и лучше использовать эту мощную методологию.
Введение
Проточной цитометрии была широко использована в иммунологии, гематологии и онкологии для определения клеточных популяций с помощью внутренних свойств рассеяния, экспрессии антигенов на клеточной поверхности, и других параметров флуоресценции 1-3. Наши идеи в развитие родословия и болезни являются результатом в значительной степени непрерывного уточнения этой методологии после ее первоначального 4,5 реализации. Повышение осведомленности о количественном и в целом аналитический потенциал проточной цитометрии недавно призвал к его более широкое применение в исследованиях стволовых клеток и может позволить так же глубокое прогресса в более короткие ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. нервных клеток урожая
- Оценка микроскопом:
- До начала эксперимента, проверки состояния культуры с ярко-поле или фазово-контрастной микроскопии.
ПРИМЕЧАНИЕ: При первичной нервной ткани, полученной от вскрытия, в принципе, одинаково поддаются проточной цитометрии анализ 14,28, пожалуйста, обратите внимание, что фокус протокола является в клетках, полученных от в пробирке нейронных клеточных системах.
- До начала эксперимента, проверки состояния культуры с ярко-поле или фазово-контрастной микроскопии.
- Сбора клеток 7:
- Осторожно мыть посуды / флакон адгезивных клеток с Mg 2+ / Ca 2+ свободный забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) при комнатной темпер....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Протокол, представленные здесь позволяет универсальный экспериментальных подходов (Рисунок 2). В своем сжатые версии (шаги 1, 3 и 6), можно считать, руководство для простого окрашивания поверхностных антигенов. В более сложной форме, количество со-маркировки парадигм с диапазоном внутриклеточных антигенов может осуществляться (необязательные стадии 2 и / или от 4 до 5). Кроме того, шаг CFSE маркировка примером его полез.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Протокол, представленные здесь, хорошо известна в культурах нервных клеток, полученных из человеческих стволовых клеток, но может быть в равной степени применено к другим нейронных клеточных источников в том числе первичной ткани или нейронных клеточных линий. В дополнение к эмбриональных источников, нервные стволовые клетки или клетки-предшественники могут быть извлечены из нейрогенных областей мозга взрослого человека 27. Кроме того, проточной цитометрии и FACS могут быть использованы для количественной оце.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов.
Благодарности
Наша исследовательская программа финансируется через программу Эмми Нётер Немецкого научно-исследовательского общества (DFG), грант PR1132/3-1. Мы выражаем благодарность за дальнейшую поддержку со стороны Фонда Мюллера-Фаненберга Фрайбургского университета. Это исследование было частично поддержано Excellence Initiative Немецкого научно-исследовательского общества (GSC-4, Высшей школы Шпемана).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| DMEM/F12 (1:1) (модифицированная среда Игла в модификации Дульбекко/питательная смесь F-12) |  Life Technologies | 11330057 | |
| DPBS без Ca2+ Mg2+ | Life Technologies | 14190169 | |
| Фетальная бычья сыворотка, квалифицированная, одобренная ЕС, происхождение из Южной Америки (FBS) | Life Technologies | 10270-106 | |
| MEM, незаменимые аминокислоты (100x) | Life Technologies | 11140035 | |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604013 | |
| Раствор трипанового синего, 0,4% | Life Technologies | 15250061 | |
| Параформальдегид | Carl Roth | 335.3 | |
| Бычий сывороточный альбумин (BSA), фракция V | PAA Laboratories, Coelbe | K41-001 | |
| Детергент Tween-20 | Calbiochem | 655205 | |
| Карбоксифлуоресцеиновый сукцинимидный эфир (CFSE) | eBioscience | 65-0850-84 | |
| DMSO | AppliChem | A1584 | |
| Фильтры для флаконов express plus 0,22 µm, 250 мл | Millipore | SCGPU02RE | |
| Флаконы для культивирования клеток (T 25) | NUNC | 156367 | |
| Флаконы для культивирования клеток (T 75) | NUNC | 156499 | |
| Конические пробирки (15 мл) | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Конические пробирки (50 мл) | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Пипетка Пастера, стеклянная (150 мм) | STEIN Labortechnik, Remchingen | S03710150 | |
| Наконечники для пипеток (0,1-10 µl) | Corning | 4125 | |
| Наконечники для пипеток (1-200 µl) | Corning | 4126 | |
| Наконечники для пипеток (100-1000 µl) | Corning | 4129 | |
| Серологические пипетки, 5 мл | Corning | 4051 | |
| Серологические пипетки, 10 мл | Corning | 4101 | |
| Серологические пипетки, 25 мл | Corning | 4251 | |
| Пробирки для микроцентрифуги (0,5 мл) | Sarstedt | 72,699 | |
| Пробирки для микроцентрифуги (1,5 мл) | Greiner Bio-One | 616201 | |
| Пробирки для микроцентрифуги (2,0 мл) | Sarstedt | 72,695,500 | |
| Моноклональное антитело к Anti-Human CD24 APC | eBioscience | 17-0247-42 | Рабочий разведение 1:50 |
| Моноклональное антитело к Anti-Human CD54 PE | eBioscience | 12-0549-42 | Рабочий разведение 1:50 |
| Поликлональное антитело к нейрональному бета-тубулину класса III (β-Tubulin, Tuj1) | Covance | PRB-435P | Рабочий разведение 1:2,000 |
| Alexa Fluor 488, вторичные антитела (осел анти-кролик) | Life Technologies | A21206 | Рабочий разведение 1:2,000 |
| Набор для мечения IgG кролика флуоресцеином Zenon® | Life Technologies | Z-25342 | |
| Улучшенная камера подсчета Нойбауэра | Marienfeld | 0640010 | |
| Вортекс | Scientific Industries | G560E | |
| Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.001 | |
| Проточный цитометр Accuri C6 | Becton Dickinson (BD) | 653118 | |
| Охлаждаемая микроцентрифуга, PerfectSpin 24 R | Peqlab | 91-PSPIN-24R | |
| Орбитальный шейкер, Unimax 1010 | Heidolph | 543-12310-00 | |
| Охлаждаемая центрифуга, Rotanta 96 RC | Hettich | 4480-50 | |
| Биологический бокс безопасности II класса Safe 2020 | Thermo Scientific | 51026640 | |
| Инкубатор CO2, Heracell 240i | Thermo Scientific | 51026331 | |
| Вакуумная система, Vacusafe comfort | Integra Biosciences | 158320 | |
| Микроскоп, Axiovert 40 CFL | Zeiss | 451212 | |
| Контроллер пипеток, accu-jet pro | Brand | 26303 | |
| Микропипетка, Pipetman neo P20N (2-20 µl) | Gilson | F144563 | |
| Микропипетка, Pipetman neo P200N (20-200 µl) | Gilson | F144565 | |
| Микропипетка, Pipetman neo P1000N (100-1000 µl) | Gilson | F144566 |
Ссылки
- Herzenberg, L. A., et al. The History and Future of the Fluorescence Activated Cell Sorter and Flow Cytometry: A View from. 48 (10), 1819-1827 (2002).
- Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Cytometry: today’s technology and tomorrow's horizons. <....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
