Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выполнение субретинальных инъекции грызунов для доставки пигментного эпителия сетчатки клеток в суспензии

17.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52247

⸱

23 января 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell and Molecular Biology, The Scripps Research Institute, 2Lowy Medical Research Institute

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем принятый сообществом протокол в мультимедийном формате для субретинального введения болюса клеток RPE крысам и мышам. Этот подход может быть использован для определения потенциала спасения, профилей безопасности и выживаемости трансплантированных клеток RPE после имплантации в животные модели дегенерации сетчатки.

Аннотация

Превращение света в электрические импульсы происходит в наружной сетчатке и осуществляется в основном с помощью палочек и колбочек фоторецепторов и пигментного эпителия сетчатки (RPE) клеток. НПП обеспечить необходимую поддержку для фоторецепторов и смерти или дисфункции ПЭС клеток характерно возрастной макулярной дегенерации (ВМД), основной причиной необратимой потере зрения у людей в возрасте от 55 лет и старше. Хотя никакого лечения для AMD, выявлено не было, имплантация здорового ПЭС в пораженных глаз, может оказаться эффективным средством для лечения и большое число клетках ПЭС может быть легко генерируется из плюрипотентных стволовых клеток. Несколько интересных вопросов, касающихся безопасности и эффективности НПП доставки клеток все еще может быть рассмотрен на животных моделях, и хорошо принимаются протоколы, используемые для введения ППД были разработаны. Техника, описанная здесь была использована несколькими группами в различных исследованиях и предполагает в первую очередь создание дыру в глаза с острой иглой. Тогда шприц с BluNT иглы загружен клеток вставляется через отверстие и проходит через стекловидное тело, пока она слегка не коснется RPE. С помощью этого метода впрыска, который относительно прост и требует минимального оборудования, мы достигаем последовательное и эффективной интеграции клеток, полученных клеток RPE в стволовых между принимающей ПЭС, который предотвращает значительное количество дегенерации фоторецептора на животных моделях. Хотя это и не часть фактической протокола, но также описывают, как определить степень травмы, вызванной инъекцией, и как проверить, что клетки вводили в субретинальной пространства с помощью методов визуализации в естественных условиях. Наконец, использование данного протокола не ограничивается клетках ПЭС; он может быть использован для введения любое соединение или клетки в субретинальной пространстве.

Введение

Сенсорная сетчатка организована в функциональные ярусы нейронов, глии и эндотелиальных клеток. Фоторецепторы в задней части сетчатки активируются светом; Посредством фототрансдукции они преобразуют фотоны в электрические сигналы, которые обрабатываются интернейронами и передаются в зрительную кору головного мозга. Фототрансдукция не может произойти без скоординированных усилий глии Мюллера и клеток пигментного эпителия сетчатки (РПЭ). РПЭ организованы в монослой непосредственно за фоторецепторами и выполняют множество разнообразных функций, неотъемлемых от функции фоторецепторов и гомеостаза. На самом деле, РПЭ и фоторецепторы настолько взаимозависимы, что их считают одной функциональной единицей. Смерть или дисфункция РПЭ приводит к разрушительным вторичным воздействиям на фоторецепторы и связана с возрастной макулярной дегенерацией (ВМД), ведущей причиной слепоты у пожилых людей1,2.

Хотя лекарство от ВМД не было найдено, несколько клинических исследований показали, что замена клеток RPE может быть многообещающим терапевтическим вариантом3-13. С появлением технологии стволовых клеток теперь стало возможным получать большое количество клеток RPE in vitro из эмбриональных и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hES и hiPS), которые сильно напоминают свои соматические аналоги функционально и анатомически14-26. Также было показано, что РПЭ, полученные из стволовых клеток, функционируют in vivo несколькими независимыми группами, включая нашу собственную, что значительно замедляет дегенерацию сетчатки у крыс и мышей со спонтанной дегенерацией сетчатки16,18,21,22,25,28,29. Эта комбинация клинических и доклинических подтверждающих доказательств настолько убедительна, что в настоящеевремя проводится несколько клинических испытаний по предотвращению дегенерации сетчатки с использованием клеток RPE, полученных из стволовых клеток.

RPE может быть легко получен из hES и/или hiPS и имплантирован в субретинальное пространство грызунов с использованием различных методов деривации и инъекции32,33. (См. статью о методах в мультимедийном формате, демонстрирующую используемый нами протокол направленной дифференцировки)34. Остаются критически важные вопросы, касающиеся безопасности, выживаемости и функциональных возможностей экзогенно доставленных клеток РПЭ после имплантации, поэтому способность выполнять субретинальные инъекции у грызунов является критически важным навыком16,18,21,29,36,37. Доставка СИЗИЗ не тривиальна, и область разделилась на наиболее эффективную технику инъекции. Протокол, который мы описываем здесь, является простым и эффективным способом доставки болюса клеток РПЭ субретинально и был использован в первом клиническом исследовании трансплантации РПЭ, полученных из стволовых клеток31. (Читатель также может обратиться к другой статье JoVE от Eberle et al. для альтернативного описания субретинальных инъекций у грызунов. пункт 38)

Техника, описанная в этой рукописи, не может быть визуализирована, и травма неизбежна (как и при любой технике субретинальной инъекции). Она выполняется путем проделывания отверстия прямо под сосудами лимба и введения тупой иглы по транссклеральному пути для введения болюса клеток под диаметрально противоположную сетчатку. Человек, делающий инъекцию, почувствует сопротивление, когда тупой иглой коснется сетчатки. Тем не менее, клетки могут быть непосредственно визуализированы после инъекции, а степень индуцированной отслойки сетчатки может быть определена путем маркировки клеток RPE транзиентным флуоресцентным маркером и их обнаружения с помощью конфокального сканирующего офтальмоскопа (cSLO). Система оптической когерентной томографии (ОКТ) также может использоваться для мониторинга травмы и легкого определения места инъекции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все животные были обработаны в соответствии с этическими принципами, установленными в научно-исследовательском институте Скриппса.

1. Подготовка материалов для инъекций (~ 20 мин)

  1. Предварительно теплый раствор диссоциации клеток (предпочтительно тот, который инактивируется через разведении, а не с сывороткой), стерильной PBS и культуральные среды (таблица 1).
  2. Стерилизацию шприц с тупой иглой путем разборки и кипячения части в воде в течение 15 мин.

2. Подготовка клетки ПЭС для инъекций (~ 30 мин до 1 ч)

  1. Отделить ПЭС клеток с использованием предварительно нагретого раствора для диссоциации клеток в течение 5-8 мин при температуре 37 ° С.
  2. Очистите клетки осторожно, чтобы освободить тех, которые были до сих пор прилагается.
  3. Развести клетки с большим объемом культуральной среды (пополнить 15 мл трубки), чтобы инактивировать диссоциации решение и считать их.
  4. Центрифуга при 800 х г в течение 5 мин для осаждения клеток.
  5. Ресуспендируют клеток в 200 000 клеток / мкл (для доставки 100 000 клеток в объеме 0,5 мкл) в стерильной подогретого PBS и передавать их в 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
  6. При желании можно добавить живой клетке переходных флуоресцентный маркер и инкубировать при 37 ° С в течение 30-45 мин.
  7. Загрузка шприц с тупой иглой с 0,5 мкл клеток. Вводить клетки как можно скорее.

3. Sub сетчатки инъекции (~ 5 мин на инъекций)

ПРИМЕЧАНИЕ: Если возможно, изучить технику со взрослыми белых крыс с лимба суда значительно легче визуализировать. Вводите Быстрый зеленый раствор при изучении (перед тем, как вводить клетки) до более упростить и ускорить визуализацию в месте инъекции.

  1. Обезболить грызуна. Использование внутрибрюшинные инъекции 100 мг / мл кетамина и 10 мг / мл ксилазина (20 мкл / 10 г тела швосемь) изофлураном более ингаляции, поскольку трудно маневрировать грызуна и ввести в глаз с мордой в ингаляторе.
    1. Убедитесь, что животное глубоко под наркозом, зажимая одну из его лап. Если вздрагивает, подождите еще несколько минут и повторите попытку перед началом субретинальной инъекции.
  2. Установите грызуна на бок, так что глаз, который будет введен сталкивается с потолка.
  3. Под микроскопом рассекает мягко растянуть кожу так, глаз появляется немного вверх из гнезда (временное Экзофтальм) и становится более доступным, удерживая его голову двумя пальцами чуть выше уха и по его челюсти и аккуратно растянуть параллельно кожи на веки так что глаз появляется немного вверх из гнезда (Смотрите рисунок 1С). Не беритесь грызуна слишком близко к горлу.
  4. С 30 соль-диез одноразового предварительно стерилизуют иглы, сделать отверстие непосредственно под лимба (если сосуды поражены, кровотечение бэлектронной значительным и это будет трудно найти отверстие позже) и под углом, чтобы не касаться объектива с иглой (рис 1D). Не прикасайтесь к линзам с острым (или тупой) иглой или формирования непосредственной катаракты произойдет.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекции работать с двумя людьми лучше. Таким образом, один человек может пройти шприц с тупой иглой лицу, осуществляющему инъекции после того как они создали первое отверстие с резким одноразовой иглой, чтобы сохранить фокус на котором отверстие.
  5. Уберите одноразовые острую иглу из глаз, сохраняя при этом сцепление на голове. Помните, именно там, где отверстие.
  6. После завершения работы установки предварительно загруженных шприц с тупой иглой на микроманипулятора или держа его за руку, вставьте кончик шприца с тупой иглой через отверстие, заботясь снова не прикасайтесь к объективу и аккуратно нажмите на него через глаз не очень мягко, пока чувство сопротивления (рис 1D).
  7. Кeeping все движения к минимуму, тщательно вводить клетки ПЭС медленно в субретинальной пространстве.
    ПРИМЕЧАНИЕ: НПП / отслойки сетчатки будет наводиться; это неизбежно. Тем не менее, чище впрыска минимизирует отряд и значительно повышает шансы на прикрепления (рис 1E). Любые преувеличенные движения могут переместить иглу обратно в сетчатке, и боковых движений может привести к повреждению сетчатки. Использование топливного насоса не является обязательным, но позволяет очень точной доставки.
  8. Уберите шприц медленно. Применить глаз увлажнение падает держать глаз о водой.
  9. Продолжайте следить за животное, пока он не восстановит грудины лежачее положение. Не оставляйте животное без присмотра или вернуться в клетку с другими оповещения животных, пока он вновь не грудины лежачее положение.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мы можем доставить суспензии клетках ПЭС в субретинальной пространстве грызунов быстро и последовательно, используя методику, описанную в этой рукописи. Хотя это и не требуется, травмы могут быть значительно минимизированы с помощью установки, показанной с микроманипулятором на рисунке 1А и B. Держите грызунов, как показано на рисунке 1С для временного экзофтальм. Шаги же, если производится с микроманипулятора или вручную; они изображены в мультфильме на рис 1D. При вып...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этой статье мы расскажем относительно простой способ для выполнения субретинальных инъекции ПЭС клеток в суспензии у крыс и мышей. Протокол проста в освоении и более опыт работы с техникой будет переводить в меньшем количестве травм (Рисунок 3, это является одним из лучших инъекций), особенно если микроманипулятор используется (рис 1а). Любая травма может контролироваться в естественных условиях с системой cSLO и восьмеричные (рис 2), если таковой имеется. Ес...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Ни у одного из авторов нет никаких коммерческих разоблачений, которые можно было бы декларировать.

Благодарности

Мы хотим поблагодарить Элисон Дорси за помощь в разработке техники субретинальной инъекции. Мы также выражаем признательность Национальному институту глаза (гранты NEI EY11254 и EY021416), Калифорнийскому институту регенеративной медицины (грант CIRM TR1-01219) и Медицинскому исследовательскому институту Лоуи (LMRI) за очень щедрое финансирование этого проекта.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2-Меркаптоэтанол (55 мМ)Gibco 21985-02350 мл x 1 
Cell ScapersVWR89260-222Case x 1
CellTracker Green CMFDAMolecular ProbesC3455250 &; g x 20
DPBS, без кальция, без магнияGibco14190-144500 мл x 1 
Светосильный зеленыйSigma-AldrichF725825 г x 1 
Genteal Geldrops Глазные капли с умеренной и сильной смазкой Walmart406094125 мл x 1
Hamilton Model 62 RN SYRHamilton87942Шприц x 1 
Игла Hamilton 33 G, 0,5", точка 3 (нержавеющая сталь 304)Иглы Hamilton7803-05x 6
KnockoutDMEM Gibco10829-018500 мл x 1 
KnockOut Serum ReplacementGibco10828-028500 мл x 1 
L-глютамин 200 мМGibco25030-081100 мл x 1
магнитный стендLeica Biosystems39430216стенд x 1
MEM раствор заменимых аминокислот 100X Gibco11140-050100 мл x 1
МикроманипуляторLeica Biosystems3943001Манипулятор x 1
Пенициллин-стрептомицин (10 000 Ед/мл)Gibco15140-122100 мл x 1
шприц со скользящим наконечником без игл BD  (3 мл)   VWRBD309656Pack x 1
Иглы специального назначения BD  (30 г, 1")VWRBD305128Box x 1
TrypLE Express Enzyme (1X), без фенола красныйGibco12604013100 мл x 1

Ссылки

  1. Bird, A. C. Therapeutic targets in age-related macular disease. The Journal of Clinical Investigation. 120 (9), 3033-3041 (2010).
  2. Jong, P. T. Age-related macular degeneration. Med, N. . E. ngl. J. . 355 (14), 1474-1485 (2006).
  3. Abe, T. Auto iris pigment epithelial cell transplantation in patients with age-related macular degeneration: short-term results. The Tohoku Journal Of Experimental Medicine. 191 (1), 7-20 (2000).
  4. Algvere, P. V., Berglin, L., Gouras, P., Sheng, Y. Transplantation of fetal retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration with subfoveal neovascularization. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 232, 707-716 (1994).
  5. Binder, S. Outcome of transplantation of autologous retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: a prospective trial. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45 (11), 4151-4160 (2004).
  6. Binder, S. Transplantation of autologous retinal pigment epithelium in eyes with foveal neovascularization resulting from age-related macular degeneration: a pilot study. Am. J. Ophthalmol. 133 (2), 215-225 (2002).
  7. Juan, E., Loewenstein, A., Bressler, N. M., Alexander, J. Translocation of the retina for management of subfoveal choroidal neovascularization II: a preliminary report in humans. Am. J. Ophthalmol. 125 (5), 635-646 (1998).
  8. Falkner-Radler, C. I. Human retinal pigment epithelium (RPE) transplantation: outcome after autologous RPE-choroid sheet and RPE cell-suspension in a randomised clinical study. British Journal of Ophthalmology. 95 (3), 370-375 (2011).
  9. Joussen, A. M. How complete is successful 'Autologous retinal pigment epithelium and choriod translocation in patients with exsudative age-related macular degeneration: a short-term follow-up' by Jan van Meurs and P.R. van Biesen. Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 241 (12), 966-967 (2003).
  10. Lai, J. C. Visual outcomes following macular translocation with 360-degree peripheral retinectomy. Arch. Ophthalmol. 120 (10), 1317-1324 (2002).
  11. Machemer, R., Steinhorst, U. H. Retinal separation, retinotomy, and macular relocation: II. A surgical approach for age-related macular degeneration? Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 231 (11), 635-641 (1993).
  12. MacLaren, R. E. Autologous transplantation of the retinal pigment epithelium and choroid in the treatment of neovascular age-related macular degeneration. Ophthalmology. 114 (3), 561-570 (2007).
  13. Peyman, G. A. A technique for retinal pigment epithelium transplantation for age-related macular degeneration secondary to extensive subfoveal scarring. Ophthalmic Surgery. 22 (2), 102-108 (1991).
  14. Buchholz, D. E. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (10), 2427-2434 (2009).
  15. Carr, A. J. Molecular characterization and functional analysis of phagocytosis by human embryonic stem cell-derived RPE cells using a novel human retinal assay. Mol. Vis. 15 (4), 283-295 (2009).
  16. Carr, A. J. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4 (12), e8152(2009).
  17. Hirami, Y. Generation of retinal cells from mouse and human induced pluripotent stem cells. Neurosci Lett. 458 (3), 126-131 (2009).
  18. Idelson, M. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional retinal pigment epithelium cells. Cell Stem Cell. 5 (4), 396-408 (2009).
  19. Klimanskaya, I. Derivation and comparative assessment of retinal pigment epithelium from human embryonic stem cells using transcriptomics. Cloning Stem Cells. 6 (3), 217-245 (2004).
  20. Kokkinaki, M., Sahibzada, N., Golestaneh, N. Human Induced Pluripotent Stem-Derived Retinal Pigment Epithelium (RPE) Cells Exhibit Ion Transport, Membrane Potential, Polarized Vascular Endothelial Growth Factor Secretion, and Gene Expression Pattern Similar to Native RPE. Stem Cells. 29 (5), 825-835 (2011).
  21. Krohne, T. Generation of retinal pigment epithelial cells from small molecules and OCT4-reprogrammed human induced pluripotent stem cells. Stem Cells Translational Medicine. 1 (2), 96-109 (2012).
  22. Lund, R. D. Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats. Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).
  23. Meyer, J. S. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (39), 16698-16703 (2009).
  24. Osakada, F. In vitro differentiation of retinal cells from human pluripotent stem cells by small-molecule induction. J. Cell Sci. 122 (17), 3169-3179 (2009).
  25. Vugler, A. Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE: anatomy of cell genesis, expansion and retinal transplantation. Exp. Neurol. 214 (2), 347-361 (2008).
  26. Westenskow, P. D. Using flow cytometry to compare the dynamics of photoreceptor outer segment phagocytosis in iPS-derived RPE cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53 (10), 6282-6290 (2012).
  27. Zarbin, M. A. Current concepts in the pathogenesis of age-related macular degeneration. Arch. Ophthalmol. 122 (10), 598-614 (2004).
  28. Li, Y., et al. Long-term safety and efficacy of human-induced pluripotent stem cell (iPS) grafts in a preclinical model of retinitis pigmentosa. Molecular Medicine. 18, 1312-1319 (2012).
  29. Wang, N. K. Transplantation of reprogrammed embryonic stem cells improves visual function in a mouse model for retinitis pigmentosa). Transplantation. 89 (8), 911-919 (2010).
  30. Ramsden, C. M. Stem cells in retinal regeneration: past, present and future. Development. 140 (12), 2576-2585 (2013).
  31. Schwartz, S. D. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. The Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
  32. Carr, A. J. Development of human embryonic stem cell therapies for age-related macular degeneration. Trends in Neurosciences. 36 (7), 385-395 (2013).
  33. Westenskow, P., Friedlander, M. Ch. 111. The New Visual Neurosciences. Werne, J. S., Chalupa, L. M. , The MIT Press. Cambridge, MA. 1611-1626 (2013).
  34. Westenskow, P., Sedillo, Z., Friedlander, M. Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from iPS. J. Vis. Exp. , Forthcoming Forthcoming.
  35. Furhmann, S., Levine, E. M., Friedlander, M. Extraocular mesenchyme patterns the optic vesicle during early eye development in the embryonic chick. Development. 127 (21), 4599-4609 (2000).
  36. Lu, B. Long-Term Safety and Function of RPE from Human Embryonic Stem Cells in Preclinical Models of Macular Degeneration). Stem Cells. 27 (9), 2126-2135 (2009).
  37. Zhao, T., Zhang, Z. -N., Rong, Z., Xu, Y. Immunogenicity of induced pluripotent stem cells. Nature. 474 (7350), 212-215 (2011).
  38. Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. Subretinal transplantation of MACS purified photoreceptor precursor cells into the adult mouse retina. Journal Of Visualized Experiments. , e50932(2014).
  39. Huber, G. Spectral domain optical coherence tomography in mouse models of retinal degeneration. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 5888-5895 (2009).
  40. Kim, K. H. Monitoring mouse retinal degeneration with high-resolution spectral-domain optical coherence tomography. Journal of Vision. 53 (8), 4644-4656 (2008).
  41. Pennesi, M. E. Long-term characterization of retinal degeneration in rd1 and rd10 mice using spectral domain optical coherence tomography. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 4644-4656 (2012).
  42. Fisher, S. K., Lewis, G. P., Linberg, K. A., Verardo, M. R. Cellular remodeling in mammalian retina: results from studies of experimental retinal detachment. Progress in Retinal And Eye Research. 24 (3), 395-431 (2005).
  43. Hu, Y. A novel approach for subretinal implantation of ultrathin substrates containing stem cell-derived retinal pigment epithelium monolayer. Ophthalmic Research. 48 (4), 186-191 (2012).
  44. Diniz, B. Subretinal implantation of retinal pigment epithelial cells derived from human embryonic stem cells: improved survival when implanted as a monolayer. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (7), 5087-5096 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Субретинальная инъекцияхирургия глаза грызуновметод доставки клетокинъекция тупой иглойпункция острой иглойвизуализация in vivoконфокальная сканирующая офтальмоскопияоптическая когерентная томографияприготовление клеточной суспензии
Выполнение субретинальных инъекции грызунов для доставки пигментного эпителия сетчатки клеток в суспензии
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.