Методическая статья

Минимально инвазивная техника для инъекций в Крыса зрительного нерва

DOI:

10.3791/52249

⸱

19 мая 2015 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Johns Hopkins University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Прямая инъекция в зрительный нерв крысы полезна для регенеративных исследований. Мы демонстрируем минимально инвазивную технику прямой инъекции в зрительный нерв крысы, которая не предполагает вскрытия черепа. При использовании этого метода хирургические осложнения сводятся к минимуму, а восстановление проходит более быстро.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Зрительный нерв крысы является полезной моделью для исследований регенерации стволовых клеток. Прямая инъекция в зрительный нерв крысы позволяет доставить его в центральную нервную систему в минимально инвазивной хирургии без удаления кости. Эта техника описывает подход к визуализации и прямой инъекции зрительного нерва после незначительного фасциального расслоения из орбитального гребня с использованием конъюнктивального тракционного шва для мягкого вытягивания глаза вниз и наружу. Типичными примерами инъекции зрительного нерва являются успешные инъекции окрашенных шариков.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Зрительный нерв представляет собой идеальное место для центральной нервной системы (ЦНС) регенеративной исследований, включая офтальмологических заболеваний, таких как неврит зрительного нерва, глаукома и травмы. Инъекции различных стволовых клеток либо продемонстрировали эффективность или показали обещание в замене потерянного миелина, увеличение аксонов счет и / или профилактики дегенеративных заболеваний. 1,2

Человек зрительного нерва содержится приблизительно 1,2 млн параллельных аксоны путешествия от сетчатки к перекреста с диаметром приблизительно 3,0-3,5 мм. 3 Для моделирования заболеваний человека в лаборатории, крысы часто использовался. Взрослой крысы зрительного нерва содержится приблизительно 100 000 аксонов в диаметре примерно 0,5 мм. 4 Одним из основных ограничений в ЦНС регенеративной исследования прямой доступ без костей. Осложнения и хирургические риски к животным выше, когда череп или позвонки удаляются. Подобно преимуществминимально инвазивные подходы в позвоночнике, 5 прямых зрительного нерва инъекции без открытия черепа предложение сводится осложнений и более быстрое восстановление.

Этот метод был использован в предыдущих исследованиях. 6 В этой рукописи и сопровождающей видео, мы демонстрируем порядок минимально инвазивной, чтобы придать стволовых клеток в крысиных зрительного нерва.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры на животных были одобрены Комитетом Джонса Хопкинса уходу и использованию животных в. Анестезия машины требуют ежегодной проверки и калибровки как необходимо.

1. Анестезия и позиционирование

  1. Анестезия.
    1. Выполните все хирургические процедуры под наркозом с 2-3% изофлуораном. Подтвердите соответствующий уровень анестезии пальца щепоткой и частоты дыхания. Убедитесь, что крысы не дрогнул в ответ на носок щепотку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: вздрогнул указывает, что анестезия уже слишком поздно, и, возможно, требуют более длительного наркоза перед началом или более высокой концентрации изофлуораном. Частота дыхания менее 1 дыхание каждые 2 сек слишком медленно указанием анестезии является слишком высоким и может потребовать осветление изофлуораном концентрации.
    2. Безопасный животное, как необходимо, чтобы избежать движения головы во время процедуры. Поместите каплю лидокаина на хирургическом глаза. Используйте искусственные слезы каждые 10 минут, чтобы предотвратить сухость под наркозом. Датьинъекция бупренорфина 0,01 мг / кг подкожно перед операцией и затем каждые 6-8 часа по мере необходимости.
  2. Позиционирование.
    1. Поместите крыс в стереотаксической рамы и согреться с грелку. Смочите кожу головы мех с алкоголем, заботясь, чтобы избежать воздействия на глаза. Используйте стерильные инструменты и стерильных чтобы свести к минимуму риск послеоперационных инфекций.

2. Контроль глаз

  1. Поместите 4-0 шва в боковой конъюнктивы и связать его с достаточно шва, чтобы обеспечить нежный тягу.

3. Вскрытие

  1. Первоначальный рассечение.
    1. Сделайте ~ 1 дюйм разрез в коже, покрывающей глазницы, используя размер 10 скальпель, как показано на рисунке 1. Уберите кожи и основной фасции и тщательно отсечь фасции. Чтобы предотвратить чрезмерное кровотечение в хирургическое, избежать сокращения кровеносных сосудов, а рассекает фасцию. Используйте стратегически плAced советы хлопка для обеспечения гемостаза.
  2. Глубже рассечение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С нежным тяги на конъюнктиву глаз, потянув вниз и из розетки, превосходит орбитальный мышцы придут в поле зрения. Для того, чтобы разоблачить зрительный нерв, эта мышца должны быть сокращены и ретро-орбитального жира удаляются. Жир может быть отброшен и не должны быть заменены после инъекции. С этой точки, зрительного нерва панель должна быть видна в виде пучка самого зрительного нерва, а также кровеносных сосудов, завернутые в твердой мозговой оболочки (рис 1).
    1. Сделайте небольшой надрез в твердой мозговой оболочки, используя скальпель или 31 калибра скошенный иглу, чтобы сделать пирсинг менее травматично.

4. Внесите Инжектор

  1. Вытяните стекла микропипетки с диаметром 50-100 мкм. Для обеспечения стабильности, смонтировать микропипетку на микроманипулятора и присоединить к шприцу Hamilton, подключенного к инфузионный насос.
  2. Потяните вверх шарики (или стволовых клеток)восстановленного в объеме 0,5-1,0 мкл в микропипетки ретроградной вместе с 0,5 мкл объем метилового синего раствора до и после.
    ПРИМЕЧАНИЕ: скорость инфузии устанавливается на 0,5-2 мкл в минуту предотвращает травмы зрительного нерва.

5. Инъекции

  1. Опустите кончик микропипетки на зрительный нерв чуть выше никированной твердой мозговой оболочки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: крошечный, но оживленным движением кончика стеклянной в оптических результатов нерва наименьшим ущербом. Когда начинается инфузионный насос, метил синий краситель должен выделить область впрыскиваемого зрительного нерва. Краситель остаются локализованными в зрительном нерве без утечки в субарахноидальное пространство.
  2. Последующие второй полосы метил-синего, чтобы определить, когда инъекции стволовых клеток, является полной и превратить инфузионного насоса от а вторая доза метилового синего вводят. Держите микропипетки еще в зрительном нерве в течение 2 мин для каждого тома 1 мкл впрыскивают в, чтобы предотвратить высокоевыброса давление на выводе микропипеткой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативный подход заключается в подключении пипетки с воздушным заполненный шприц, которым можно управлять вручную. В любом случае, во избежание чрезмерной силы, чтобы минимизировать ущерб зрительных нервов. Мы рекомендуем инъекционных не больше, чем 2 мкл объема в каждом зрительного нерва.

6. Последующие

  1. Немедленное.
    1. При инъекции завершается, удалить микропипетки вместе с любыми ватные палочки, используемых, чтобы обеспечить гемостаз. Шовный кожу 3-0 шелка и снимите конъюнктивы шов.
    2. Держите крыс тепло на грелку, пока они не выходят из наркоза. Не оставляйте животное без присмотра, пока он не пришел в сознание достаточно, чтобы поддерживать грудины лежачее положение. Не возвращать животное, претерпела операцию на компании других животных до полного восстановления.
    3. Если животное проявляет признаки боли в том числе чрезмерной вялости, атаксии, или трудился дышуг, управлять соответствующую обезболивание с внутримышечного бупренорфина (0,05 мг / кг) до трех раз в день.
  2. Длительный срок.
    1. Для следующего 24-48 часов, наблюдать крысу осложнений после операции, включая отек или выписки из раны или другие признаки боли, такие как вокализации, сгорбившись внешний вид, не-ухода, или не ест. Рассмотрим консультации с ветеринаром или этической эвтаназии как надо.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

По завершении эксперимента крыс забивали, и перфузию 4% параформальдегидом. Зрительные нервы были тщательно рассечены и установлен для криостата срезов. Рисунок 2 показывает пример крыс всей зрительного нерва при низкой мощности, в котором синий краситель Эванса вводили для визуализации сайт. Стрелка указывает точное местоположение инъекции. Это было сделано рассечение в течение нескольких минут после инъекции, как указано в ограниченной диффузии красителя вниз нерва. В других инъекций, мы наблюдали мед...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Прямое введение в зрительный нерв стволовых клеток или других препаратов, предназначенных для облегчения регенерации, обеспечивает удобную модель по сравнению с другими способами инъекций в ЦНС. Этот метод занимает меньше времени, требует меньше полной анестезии, позволяет избежать сверления или удаления черепной или костной ткани, снижает частоту осложнений и обеспечивает более быстрое восстановление после операции.

Наиболее важные шаги в этом протоколе включают: 1. Адекватный гемостаз в опе...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет содержательной информации, которую они могли бы сообщить.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано NeuralStem, Inc. и Проектом Джона Хопкинса RESTORE.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Крыса ЛьюисаЧарльз Ривер4Подойдет любой штамм крыс.
Наркозный аппаратSurgivetCDS9000CDS 9000 Аппарат для анестезии мелких животных - Крепление на полюсе
Инфузионный насосStoelting53129
Микроскоп для рассеченияNational Optical409-411-1105
Волоконно-оптический источник светаFisher Scientific12-562-21
Диссекция и стереотаксический инструментToelting51400
Съемник пипетокKopf750
ПипеткиWorld Precision Instruments18150-6
Одноразовые лезвия скальпеляHarvard Apparatus810-15-021
Ножницы для иридэктомииЭлектронная микроскопияНауки Uniband LA-4XF

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dahlmann-Noor, A., Vijay, S., Jayaram, H., Limb, A., Khaw, P. T. Current approaches and future prospects for stem cell rescue and regeneration of the retina and optic nerve. Canadian journal of ophthalmology Journal canadien d'ophtalmologie. 45 (4), 333-341 (2010).
  2. Quigley, H. A., Iglesia, D. S. Stem cells to replace the optic nerve. Eye. 18 (11), 1085-1088 (2004).
  3. Ghaffarieh, A., Levin, L. A. Optic nerve disease and axon pathophysiology. International review of neurobiology. 105, 1-17 (2012).
  4. Fukui, Y., Hayasaka, S., Bedi, K. S., Ozaki, H. S., Takeuchi, Y. Quantitative study of the development of the optic nerve in rats reared in the dark during early postnatal life. Journal of anatomy. 174, 37-47 (1991).
  5. Celestre, P. C., et al. Minimally invasive approaches to the cervical spine. The Orthopedic clinics of North America. 43 (1), 137-147 (2012).
  6. Hallas, B. H., Wells, M. R. A Novel Technique for Multiple Injections into the Mammalian Optic Nerve. Kopf Carrier. 54, (2001).
  7. Harvey, A. R., Hellstrom, M., Rodger, J. Gene therapy and transplantation in the retinofugal pathway. Progress in brain research. 175, 151-161 (2009).
  8. Adachi-Usami, E. Optic neuritis--from diagnosis to optic nerve transplantation. Nippon Ganka Gakkai zasshi. 104 (12), 841-857 (2000).
  9. Slater, B. J., Vilson, F. L., Guo, Y., Weinreich, D., Hwang, S., Bernstein, S. L. Optic nerve inflammation and demyelination in a rodent model of nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy. Investigative ophthalmology & visual science. 54 (13), 7952-7961 (2013).
  10. Zarbin, M. A., Arlow, T., Ritch, R. Regenerative nanomedicine for vision restoration. Mayo Clinic proceedings. 88 (12), 1480-1490 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи