Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Генерация человека Аллоантиген-специфических Т-клеток из периферической крови

12.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52257

⸱

21 ноября 2014 г.

 , 
1Department of Pathology, University of California, San Diego

В этой статье

Краткое содержание

В этой статье описывается метод получения и размножения клонов Т-клеток человека, которые специфически реагируют на определенный аллоантиген. Этот протокол может быть адаптирован для клонирования Т-клеток человека, специфичных для различных пептидных MHC-лигандов.

Аннотация

Изучение биологии Т-лимфоцитов человека часто включает в себя изучение реакций на активирующие лиганды. Т-клетки распознают и реагируют на обработанные пептидные антигены, представленные молекулами MHC (человеческий ортолог HLA) через рецептор Т-клеток (TCR) высокочувствительным и специфичным образом. В то время как основная функция Т-клеток заключается в опосредовании защитных иммунных реакций на чужеродные антигены, представленные собственным MHC, Т-клетки устойчиво реагируют на антигенные различия в аллогенных тканях. Реакцию Т-клеток на аллоантигены можно описать как прямую или косвенную аллореактивность. При аллореактивности Т-клетка реагирует высокоспецифичным распознаванием как представленного пептида, так и молекулы MHC. Устойчивый олигоклональный ответ Т-клеток на аллогенную стимуляцию отражает большое количество потенциально стимулирующих аллоантигенов, присутствующих в аллогенных тканях. В то время как широта аллореактивных реакций Т-клеток является важным фактором в инициации и опосредовании патологии, связанной с биологически значимыми аллореактивными реакциями, такими как реакция «трансплантат против хозяина» и отторжение аллотрансплантата, она может препятствовать анализу реакции Т-клеток на аллогенные лиганды. С этой целью данный протокол описывает метод получения аллореактивных Т-клеток из наивных лейкоцитов периферической крови человека (PBL), которые реагируют на известные аллоантигены пептид-MHC (pMHC). Протокол применяет мультимерное мечение pMHC, обогащение магнитными шариками и проточную цитометрию к методам культивирования отдельных клеток in vitro для получения аллоантиген-специфических клонов Т-клеток. Это позволяет изучать биохимию и функцию Т-клеток, реагирующих на аллогенную стимуляцию.

Введение

Т-лимфоциты являются важнейшими компонентами адаптивной иммунной системы. Т-клетки ответственны за не только непосредственно опосредовании защитные иммунные ответы к патогенам с помощью различных эффекторных механизмов, но и активно поддерживать иммунологическую аутотолерантность и направляя ответы других клеток в иммунной системе. Эти функции направлены через ряд интегрированных сигналов, в том числе Т-клеточного рецептора (TCR) лигирования, цитокинов и хемокинов, и метаболитов 1. Из этих сигналов, TCR имеет особое значение, так как она обеспечивает характерную специфичность, которая определяет роль Т-клеток в адаптивного иммунитета. TCR взаимодействует с линейными пептидных антигенов, представленных MHC (человек ортолог HLA) молекул (ПКИКЖ комплексов) в специфической и чувствительной манере, чтобы обеспечить сигналы, которые инициируют функцию клеток эффекторных Т. Биохимические параметры TCR взаимодействия с ПКИКЖ лигандов обеспечить не только специфику для Tклеточной активации, но также имеют качественную воздействие на последующее функции Т-клеток 2. Таким образом, изучение функции Т-клеток часто требуется рассмотрении ответов на клоновых Т-клеток с определенной антигенной специфичности.

Человек Т-клеток отсек, содержащий приблизительно 10 12 αβ Т-клеток, содержит примерно 10 7 - 10 8 различных αβTCRs 3-4. Это Разнообразный репертуар предоставляет возможность для признания огромного массива пептидов из потенциальных патогенов, что бы потребовать ответа Т-клеток для защитного иммунитета. Подсчитано, что частота Т-клеток в ответ на заданном чужеродного антигена, представленного себя MHC составляет порядка 10 -4 - 10 -7 при отсутствии предварительного иммунного ответа на этот антиген 5. Наивный Т-клеток репертуар формируется тимуса отбора, чтобы обеспечить способность распознавать собственного MHC представляя пептидные антигены и ограничения реагироватьivity против самостоятельных пептид антигенов, максимизации потенциальной полезности для посреднических защитный иммунитет 2. Тем не менее, в нарушение этого разработана реактивность, относительно большой частоты, 10 -3 - 10 -4, Т-клеток от иммунологически наивных лиц реагировать на стимуляцию с аллогенных клеток, признавая обе иностранные молекулы МНС, а также эндогенные пептиды они представляют 6. Признание аллогенных лигандов ПКИКЖ структурно похож на признании иностранных антигенов, представленных самостоятельной МНС; TCR имеет критические биохимические взаимодействия как с аллогенной молекулы МНС, а также представленного пептидом 7. Прочный характер ответа Т-клеток к аллогенных результатов стимуляции из разнообразия рМНС комплексы, присутствующие на поверхности аллогенных клеток 8. Подсчитано, что каждый представляет МНС примерно 2 х 10 4 различные эндогенные пептидные антигены 9. Это бreadth реакции на аллогенной стимуляции является существенным аспектом клинически соответствующей патологии, такие как отторжение аллотрансплантата или трансплантат против хозяина (РТПХ), в результате Т-клеток аллореактивность.

Изучение человека Т-клеток аллореактивными ответов традиционно полагались на рассмотрении поликлональные ответы наивных Т-клеток после стимуляции аллогенных клеток. Повторные стимуляции с одной и той же линии аллогенных клеток в сочетании с ограниченным разбавлением анализ способен генерировать клоновых Т-клеток с определенной признания аллогенной HLA 10. Тем не менее, этот подход является проблематичным для изучения ответов на отдельных лигандов аллогенных ПКИКЖ, как большой и разнообразный репертуар эндогенного рМНС комплексы присутствует при заданном аллогенных HLA стимулирует широкий репертуар Т-клеток. Это возбуждение масса населения и ограничение подход потребует разбавления скрининг большого числа клонов, чтобы изолировать Т-клеток с желаемым реакционномVity против одного ПКИКЖ лиганда. Кроме того, частота Т-клеток, отвечающих на индивидуальной аллогенной ПКИКЖ лиганда является относительно низким среди наивных Т-клеточных популяций, который представляет собой барьер для эффективной генерации клонов Т-клеток человека, реагирующих на данному антигену.

Выявление и изоляция антиген-специфических Т-клеток из поликлональных популяций были включены по развитию флуорофорных меченных ПКИКЖ мультимерами 11. Этот подход использует определенные пептидные антигены загруженные в рекомбинантных растворимых биотинилированных молекул МНС, которые помечены путем связывания с стрептавидин-меченого флуорофора. Мультимеризации рМНС увеличивает алчность, компенсируя неразрывно низкий (мкм) сродства TCR для растворимых лигандов ПКИКЖ. Меченые клетки могут быть идентифицированы и выделены с помощью проточной цитометрии. Тем не менее, этот подход все еще ограничено низкой частоты антиген-специфических Т-клеток среди населения наивных Т-клеток, которые, как правило,порядков меньше, чем предел точной идентификации и количественного определения на большинстве цитометров. Для решения этой ограничение, метод ПКИКЖ тетрамера маркировки и последующего обогащения магнитного бисера для тетрамерных-меченых клеток были разработаны 12. Этот метод показал, надежное обнаружение, перечисление, и выделение низкочастотных антиген-специфических Т-клеток.

Этот протокол описывает эффективный протокол для генерации клонов Т-клеток человека, которые специфически реагируют на отдельных лигандов аллогенных ПКИКЖ. Протокол применяется ПКИКЖ (HLA) мультимера маркировки и обогащение для выделения Аллоантиген-специфический Т-клеток человека с проточной цитометрии сортировки клеток и надежный метод для культуры в пробирке человеческих Т-клеток, чтобы обеспечить выпуск клонов Т-клеток из отдельных отсортированных клеток ( Обзор на рисунке 1).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол требует использования периферической крови от добровольцев. Все исследования на людях должны быть рассмотрены и одобрены человека исследований Institutional Review Board в целях обеспечения соблюдения Хельсинкской декларации (2013 г.) и о медицинском страховании портативности и подотчетности Закон 1996 года.

1. Выделение Т-клеток из цельной крови

  1. Перед началом, нагреть градиент плотности среды до комнатной температуры. Алиготе 4 мл в градиенте плотности среды в 2-4 стерильные 15 мл конические пробирки для центрифугирования (1 трубка будет использоваться для каждого 10 мл общий объем разбавленной крови).
  2. Получить 10-20 мл крови в спрей гепарина 1-2 натрия с покрытием (зеленый-топ) венозные трубки забора крови. Сбор с человеческими образцами под надзором опытных людей, и в соответствии с Экспертным советом институциональных утвержден протокол.
  3. Протрите внешнюю трубок с 70% этанола. Осторожно снимите верхние части физаполненной сбора трубки и переливать кровь в стерильную 50 мл центрифужную пробирку.
  4. Добавить 10 мл стерильной фосфатно-буферным раствором (PBS) в каждую пробирку для сбора крови. Соберите PBS, добавить в декантированной цельной крови, и аккуратно перемешать.
  5. Добавить 25 мкл человеческого Т-клеточного обогащения Коктейль / 2 мл общий объем. Инкубируют при комнатной температуре в течение 20 мин.
  6. Использование 10 мл пипетки, слоя до 10 мл на 1: 1 разбавленной крови осторожно сверху на градиенте плотности среды. Будьте осторожны, чтобы не нарушить поверхность градиента плотности среды.
  7. Центрифуга слоистых крови и градиент плотности среда в 1200 мкг в течение 20 мин при 20 о С.
  8. Удалить труб из центрифуги, заботясь, чтобы не нарушить интерфейс между градиенте плотности среды и слоем лейкоцитов на границе раздела между градиенте плотности среды и разбавленной плазмы. Используя 5 мл пипетки, аккуратно собрать лейкоцитов слой и перейти на новую стерильную 50 мл коническую ваннойе.
  9. Добавить PBS, чтобы довести объем собранного PBL до 50 мл и осторожно перемешать.
  10. Центрифуга при 600 мкг в течение 5 мин при 20 о С. Слейте.
  11. Ресуспендируют клетки осаждали в 10 мл стерильной проточной цитометрии буфер (стерильно фильтруют ФБР, содержащим 1% BSA) сортировки. Образец 10 мкл клеточной суспензии, разбавленных 1:10 (добавить в избранное 90 мкл) трипановым синим рассчитывать клеток с использованием гемоцитометра (ожидается выход 1 - 4 х 10 6 клеток / трубка из цельной крови).
    1. Удалить 1 мл аликвоты, трансфер в 5 мл пробирку, и держать на льду для анализа Т-клеток не помеченных тетрамере. Хранить клеточной суспензии на льду.

2. Магнитный Обогащение Аллоантиген-специфических Т-клеток

  1. Развести аллоантиген ПКИКЖ тетрамером до 1: 100 в стерильном буфере сортировки.
  2. Центрифуга клеточной суспензии (9 мл из шага 1,11) при 600 х г в течение 5 мин при температуре 20 о С. Слейте.
  3. Добавить 50 мкл разбавляют аллоантиген ПКИКЖ тетрамере к осаждаликлетки (до 10 7 клеток). Смешать, осторожно пипеткой. Трансфер в стерильную пробирку 5 мл. Инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре.
  4. Добавить 2 мл рода буфер. Центрифуга при 600 мкг в течение 5 мин при 20 о С. Слейте.
  5. Ресуспендируют клеток в 100 мкл буфера сортировки. Добавить 10 мкл Биотин выбор коктейля и выдержать в течение 15 минут при комнатной температуре.
  6. Добавить 5 мкл магнитных наночастиц и инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре.
  7. Добавить 2,5 мл рода буфер и аккуратно перемешать с помощью пипетки. Удалить 100 мкл аликвоты, трансфер в 5 мл пробирку, и держать на льду для анализа клеток предварительно обогащению.
  8. Поместите 5 мл пробирку, содержащую суспензию клеток в клеточной сепарации магнита. Крышка должна быть свободно поверх трубки. Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
  9. Аккуратно снимите крышку с трубы. Держа трубку и магнит вместе, переливать содержимое трубки в чистую пробирку 5 мл. Не стучите и не трясите содержимое трубки вудалить последние капли жидкости.
  10. Извлеките трубку от магнита. Добавить 2 мл холодного буфера сортировки и аккуратно перемешать с помощью пипетки. Образец 10 мкл клеточной суспензии, разбавленной 1: 2 (добавление 10 мкл) трипановым синим рассчитывать клеток с помощью гемоцитометра.

3. Подготовка Т-клеток для одноклеточные проточной цитометрии сортировки клеток

  1. Добавить холодного буфера сортировки во все пробирки клеток (тетрамер без маркировки, тетрамер-меченого не-обогащенный, и тетрамер-меченого обогащенный), чтобы довести объем до 3 мл.
  2. Центрифуга при 600 мкг в течение 5 мин при 4 ° С и переливать буфера для восстановления клеток.
  3. Ресуспендируют клетки осаждали в 25 мкл холодного буфера сортировки. Добавить 5 мкл человеческого блок Fc. Инкубируют на льду в течение 20 мин.
  4. Подготовка антитела для проточной цитометрии сортировки. Смешайте 15 мкл буфера сортировки, 15 мкл анти-CD5, 15 мкл анти-CD14, и 15 мкл анти-CD19.
  5. Добавить 20 мкл смеси антител в каждую пробирку клеток. Инкубируют на льду в течение 20 мин.
  6. Добавить 2 мл холодного буфера сортировки в каждую пробирку.
  7. Центрифуга при 600 мкг в течение 5 мин при 4 ° С и переливать буфера для восстановления клеток.
  8. Ресуспендируют клеток в концентрации 1 х 10 -2 6 клеток / мл в буфере сортировки.
  9. Аликвотные 100 мкл человеческой Т-клеточной культуральной среде Игла (DMEM Исков, дополненной 2 мМ GlutaMAX, 10 мМ HEPES, 50 мкг / мл гентамицина, 50 мкМ 2-меркаптоэтанола, 10% инактивированной нагреванием человеческую АВ сыворотки, и 2,5 нг / мл рекомбинантного человеческого ИЛ-2) в каждую лунку 96-луночного культурального планшета круглого дна клетки. Держите на льду.

4. Выделение тетрамере меченных Т-клеток одноклеточными проточной цитометрии Сортировка

  1. Создание проточной цитометрии параметров литниковых для выявления аллоантиген-ПКИКЖ тетрамере меченых Т-клетки (рис 2.а). Используйте предварительно обогащение тетрамерное помечены фракцию установить гейт стратегии по ликвидации дублеты, ворота на лимфоцитах, исключить CD19 выражения В-клеток и CD14выражая моноциты, и определить Т-клеток путем экспрессии CD5. Используйте образец не помеченный тетрамере как флуоресценции минус одна контроля для установления гейтинг для идентификации тетрамерных связывания Т-клеток (с 0% CD5 + CD14 - CD19 - клетки из образца не помеченного тетрамере должны подпадать эти ворота) ,
    Примечание: стробирования стратегий, которые не адекватно жесткими будет приводить к выделению не-Т-клеток или Т-клеток, которые не антиген-специфических, в то время как чрезмерно ограничивающие стратегии стробирования будет уменьшить количество Т-клеток, выделенных.
  2. Программирование параметров пластина для одного вида клеток. Направьте сортировщик для размещения 1 CD5 + CD14 - CD19 - тетрамер + ячейку в каждую лунку. Направьте тарелку настроить, чтобы содержать 1 отрицательного контроля (клетки не сортируются в колодец) и 1 положительный контроль хорошо (100 CD5 + CD14 - CD19 - Тетрамер - клетки) в каждой строке (Рисунок 2.Тип ).
  3. Использование установленную проточной цитометрии стратегии стробирования и установки пластины, выделить индивидуальные тетрамер-связывающий Т-клеток непосредственно в 96-луночный планшет с использованием проточной цитометрии клеточного сортера.

5. Культура и расширение Аллоантиген-специфических клонов Т-клеток

  1. После завершения сортировки клеток, центрифуги пластины при 600 мкг в течение 5 мин при 20 о С. Место культуры пластины при 37 о С в 6% CO 2 инкубаторе.
  2. Вихревые стимулирующие микросферы анти-CD3 / анти-CD28 в течение 30 сек ресуспендировать бусы.
  3. Рассчитать объем активатора бусин, необходимых для стимуляции Т-клеток, собранных (0,5 мкл активатора микрогранул / лунку). Передача расчетный объем стимуляторов бусин в стерильную пробирку 5 мл. Добавить 1 мл человеческого среду культивирования Т-клеток и вихрь.
  4. Поместите трубку с микрогранулами суспензии в магните. Крышка должна быть свободно поверх трубки. Инкубировать в течение 2 мин при комнатной температуре.
  5. Аккуратно удалитеколпачок с трубки. Держа трубку и магнит вместе, содержание переливать трубки в чистую пробирку 5 мл. Не стучите и не трясите содержимое трубки.
  6. Извлеките трубку от магнита. Добавить человеческих Т клеточную культуральную среду (100 мкл среды / 0,5 мкл микросфер вначале добавлен).
  7. Аликвоты по 100 мкл активатор шарик суспензии в каждую лунку 96-луночного планшета. Выдержите культуры пластину при 37 о С в 6% CO 2 инкубаторе.
  8. Монитор роста ежедневно микроскопического исследования клеток. Малые кластеры пролиферирующих клеток можно наблюдать под микроскопом после 5 - 7 дней культивирования (рис 3.а).
    Примечание: Визуализация клеточных культурах T в этой точке может быть трудно, и отсутствие наблюдаемых кластеров клеток на этой стадии не может быть показателем отсутствия растущих Т-клеток.
  9. На 14 дней после выделения клеток, кормовые культуры по тщательно удаляя 100 мкл СМИ офф в верхней части культуры и заменить 100 μ; Л свежей человеческой Т-клеток культуральную среду. Продолжить инкубации культуры пластину при 37 о С в 6% CO 2 инкубаторе.
  10. Монитор рост ежедневного микроскопическим исследованием и оценки цвета культуральной среды клеток. Большие кластеры клеток должно быть видно под микроскопом 2 - 3 дня после смены среды. Макроскопически клеточные осадки должны стать видимыми в течение 14 дней после смены среды.
  11. На 28 дней после изоляции клеток, определить растущие клоны под микроскопом. Передача объема 200 мкл роста-положительным 96-луночного планшета культуры в индивидуальных лунках 48-луночного культурального планшета, содержащего 200 мкл человеческого T клеточную культуральную среду.
  12. Добавить 100 мкл, содержащих 12,5 мкл стимулирующих анти-CD3 / анти-CD28 микрошариков (полученного, как описано в разделах 5.2 - 5.6). Выдержите культуры пластину при 37 о С в 6% CO 2 инкубаторе.
  13. Монитор роста ежедневно микроскопического экс культурыаминирование и оценка цвета культуральной среде. Когда Т клеточная культура достигает> 2x10 6 / мл (как правило, через 3-5 дней после повторной стимуляции, может быть оценена с каждым днем, который начинается СМИ поворота соломенно-желтого), трансфер культуру в лунку 24-луночного культурального планшета в и добавить 500 мкл человеческого Т-клеток среду.
  14. На 10-14 дней следовать повторное возбуждение, собрать 200 мкл Т клеточной культуры для оценки аллоантиген специфику помощью проточной цитометрии анализ ПКИКЖ тетрамере связывания (с помощью маркировки и стробирования стратегии, описанной в разделах 3 и 4.1).

6. Долгосрочная Re-стимуляция и культура клонов Т-клеток

  1. Непрерывно повторно стимулируют и расширить клоновых культур Т-клеток с требуемой специфичностью могут быть каждые 14 дней. Сбор культуры клеток Т в стерильную пробирку 5 мл на 14-й день после последнего анти-CD3 / CD28 микрогранулами стимуляции. Объединение нескольких скважин из одной и той же клона Т-клеток в одной пробирке, до объема 2,5 мл.
  2. Добавить среду довести конечный объем до 2,5 мл и аккуратно перемешать с помощью пипетки.
  3. Поместите 5 мл пробирку, содержащую культуру Т-клеток в клеточной сепарации магнита для удаления старых микрошарики из культуры. Крышка должна быть свободно поверх трубки. Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
  4. Аккуратно снимите крышку с трубы. Держа трубку и магнит вместе, декантируют клеточной суспензии в свежую пробирку 5 мл. Не стучите и не трясите содержимое трубки для удаления последних капель жидкости.
  5. Добавить среду, чтобы довести до конечного объема 4 мл. Образец 10 мкл для подсчета клеток с использованием гемоцитометра.
  6. Восстановление Т-клеток путем центрифугирования при 600 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
  7. Слить супернатант. Ресуспендируйте Т-клетки на 10 6 клеток / мл клеточной культуральной среды человеческого T. Передача 1 мл аликвоты в каждую лунку тканевого культурального планшета 24-луночного.
  8. Повторно стимулировать Т-клетки посредством добавления 100 мкл среды, содержащей 12,5 мкл стимулирующего анти-CD3 / аNTI-CD28 микрошарики (как описано в разделах 5.2 - 5.6). Выдержите при 37 о С в 6% CO 2 инкубаторе.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Этот протокол описывает генерацию культур Т-клеток клональный человека с определяется аллоантиген специфики через обогащения магнитной борта и потока одноклеточного цитометрии сортировки стратегию. Рисунок 1 приводится краткое описание процесса.

figure-results-1
Рисунок 1: Обзор Протокол Протокол описано здесь обеспечивает надежный метод для генерации аллоант...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Аллореактивность Т-клеток является давно изученным и клинически значимым явлением. Устойчивые пролиферативные и эффекторные ответы Т-клеток на аллогенную стимуляцию позволили провести обширный анализ реакций Т-клеток человека in vitro посредством относительно простых смешанных реакций лимфоцитов Т-клеток периферической крови против инактивированных аллогенных клеток. Тем не менее, эти первичные аллореактивные Т-клеточные ответы являются олигоклональными и состоят из большого количества отдельных Т-клеток, реагир...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Автор хотел бы поблагодарить NIH Tetramer Core Facility за производство тетрамера. Автор также хотел бы поблагодарить Э.Д. О'Коннора и К.Е. Маркеса из лаборатории проточной цитометрии Human Embryonic Stem Cell Core Facility UCSD за помощь в сортировке клеток. Эта работа финансировалась за счет гранта Национального института здравоохранения K08AI085039 (G.P.M.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Пробирка для сбора венозной крови с гепарином натрия 16 x 100 ммBecton, Dickenson and Company366480
LymphoprepStemcell Technologies7801
Rosette Sep Human T Cell Enrichment KitStemcell Technologies15061
Dulbecco's PBS, 1x без Ca или MgCorning21-031-CV
Бычий сывороточный альбуминSigma-AldrichA7906
EDTASigma-AldrichE6635
Флуорофор-меченный тетрамер pMHCNIH TetramerFacility NA
EasySep Biotin SelectionKit Технологии стволовых клеток18553
EasySep Selection magnetStemcell Technologies18000
TruStain FcX Решениедля блокировки человеческого FcBiolegend422301
Anti-CD5 PE-Cy7 (клон UCHT2)Biolegend300621
Anti-CD14 FITC (клон HCD14)Biolegend325603
Anti-CD19 FITC (клон HIB19)Biolegend302205
DMEM от Iscove, без b-ME или L-глутаминаCorning15-016-CV
HEPESCorning25-060-CI
b-Меркаптоэтанол Life Technologies21985-023
GlutamaxLife Technologies35050061
Гентамицина сульфат (50 мг/мл)Omega ScientificGT-50
Сыворотка AB человека, мужской донорOmega ScientificHS-30
Рекомбинантный человеческий IL-2PeprotechAF 200-02
Dynabeads Т-активатор человека CD3/CD28Life Технологии11131D
Медиа
Буфер для сортировки
PBS, pH 7,41 л
BSA10 г
ЭДТА (0,5 М)2 мл
Среда для культивирования
Iscove's DMEM351,6 мл
Термоинактивированная человеческая AB сыворотка40 мл
HEPES (1 M)4 мл
Glutamax (100x)4 мл
Гентамицин (50 мг/мл)0,4 ml
b-меркаптоэтанол (14,3 M)1,4 мл
Рекомбинантный человеческий IL-2 (1 мг/мл)1 мл
клетокТ-клеток человека

Ссылки

  1. Smith-Garvin, J. E., Koretzky, G. A., Jordan, M. S. T cell activation. Annu. Rev. Immunol. 27 (1), 591-619 (2009).
  2. Morris, G. P., Allen, P. M. How the TCR balances sensitivity and specificity for the recognition of self and pathogens. Nat. Immunol. 13 (2), 121-128 (2012).
  3. Arstilla, T. P., et al. A direct estimation of the human αβ T cell receptor diversity. Science. 286 (5441), 958-961 (1999).
  4. Robbins, H. S., et al. Comprehensive assessment of T-cell receptor β-chain diversity in αβ T cells. Blood. 114 (19), 4099-4107 (2009).
  5. Alanio, C., Lemaitre, F., Law, H. K. W., Hasan, M., Albert, M. L. Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies. Blood. 115 (18), 3718-3725 (2010).
  6. Suchin, E. J., et al. Quantifying the frequency of alloreactive T cells in vivo: new answers to an old question. J. Immunol. 166 (2), 973-981 (2001).
  7. Felix, N. J., Allen, P. M. Specificity of T-cell alloreactivity. Nat. Rev. Immunol. 7 (12), 942-953 (2007).
  8. Morris, G. P., Ni, P. P., Allen, P. M. Alloreactivity is limited by the endogenous peptide repertoire. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (9), 3695-3700 (2011).
  9. Suri, A., et al. In APCs, the autologous peptides selected by the diabetogenic I-Ag7 molecule are unique and determined by the amino acid changes in the P9 pocket. J. Immunol. 168 (3), 1235-1243 (2002).
  10. Yssl, H., Spits, H. Generation and maintenance of cloned human T cell lines. Curr. Protoc. Immunol. 7, (2002).
  11. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
  12. Moon, J. J., et al. Naive CD4+ T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27 (2), 203-213 (2007).
  13. Chicz, R. M., et al. Specificity and promiscuity among naturally processed peptides bound to HLA-DR alleles. J. Exp. Med. 178 (1), 27-47 (1993).
  14. Ni, P. P., Allen, P. M., Morris, G. P. The ability to rearrange dual TCRs enhances positive selection, leading to increased allo- and autoreactive T cell repertoires. J. Immunol. In press, (2014).
  15. Morris, G. P., Uy, G. L., Donermeyer, D., DiPersio, J. F., Allen, P. M. Dual receptor T cells mediate pathologic alloreactivity in patients with acute graft-versus-host disease. Sci. Transl. Med. 5 (188), (2013).
  16. Altman, J. D., Reay, P. A., Davis, M. M. Formation of functional peptide complexes of class II major histocompatibility complex proteins from subunits produced in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 (21), 10330-10334 (1993).
  17. Sabatino, J. J., Huang, J., Zhu, C., Evavold, B. D. High prevalence of low affinity peptide-MHC II tetramer-negative effectors during polyclonal CD4+ T cell responses. J. Exp. Med. 208 (1), 81-90 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

pMHCHLA
Генерация человека Аллоантиген-специфических Т-клеток из периферической крови
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.