Методическая статья

Оценка стволовых клеток Недвижимость в человека рака яичников клеток с использованием много- и отдельных клеток на основе сферах Анализы

DOI:

10.3791/52259

⸱

3 января 2015 г.

 ,  , 
1Department of Biomedicine, University Hospital Basel, 2Department of Internal Medicine II, University Hospital Tübingen

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализы сфер in vitro обычно используются для идентификации раковых стволовых клеток. Здесь мы сравниваем анализы на основе одиночных и многоклеточных сфер. Более трудоемкие одноклеточные анализы или добавки метилцеллюлозы дают более точные результаты, в то время как многоклеточные анализы, выполняемые в жидкой среде, могут сильно зависеть от плотности клеток.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Годы исследований показывают, что рак яичников содержит гетерогенную смесь клеток, включая субпопуляцию так называемых "раковых стволовых клеток" (CSCs), ответственных за инициацию, поддержание и рецидив опухоли после обычной химиотерапии. Поэтому идентификация ЦСК яичников является важной целью. Обычно используемым методом оценки потенциала ЦСК in vitro является анализ сфер, при котором клетки покрываются в неадгезивных условиях культивирования в бессывороточной среде с добавлением факторов роста, и формирование сфер оценивается через несколько дней. В этой статье мы рассмотрим доступные в настоящее время протоколы для анализов на рак яичников человека и проведем параллельный анализ между широко используемыми многоклеточными анализами и более точной системой, основанной на осаждении одиночных клеток. Наши результаты показывают, что как многоклеточные, так и одноклеточные анализы сфер могут быть использованы для исследования образования сфер in vitro. Более трудоемкие и дорогие анализы на основе одиночных клеток больше подходят для функциональной оценки отдельных клеток и приводят к более точным результатам в целом, в то время как анализы на основе нескольких клеток могут сильно зависеть от плотности покрытых клеток и требуют предварительных экспериментов по титрованию. Добавки метилцеллюлозы к многоклеточным анализам могут быть эффективно использованы для уменьшения механических артефактов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Появляется все больше доказательств того, что карциномы яичников состоят из гетерогенных смесей клеток и содержат так называемые «раковые стволовые клетки» (ОСК), ответственные за инициацию, поддержание и рецидив заболевания после традиционной цитотоксической терапии1-3. Поэтому разработка молекулярных стратегий, нацеленных на ЦСК яичников, является важной целью и обещает улучшить терапию пациентов с раком яичников.

Предпосылкой для понимания молекулярных особенностей СКК является их надежная изоляция от не-ОСК. Тем не менее, идентификация ЦСК яичников представляется сложной задачей. В то время как экспрессия CD133 и активность альдегиддегидрогеназы (ALDH)4,5, как сообщалось, маркируют ЦСК яичников, некоторые данные указывают на то, что эти маркеры нестабильны6. Как правило, при раке яичников, за исключением, например, карциномы молочной железы7, экспрессия ALDH1 связана с благоприятным исходом8, а экспрессия предложенного варианта маркера стволовых клеток CD44 не имеет прогностической ценности9. Совсем недавно мы показали, что экспрессия белка эмбриональных стволовых клеток SOX2 придает стволовость клеткам карциномы яичников10, а высокая экспрессия SOX2 связана с клинически агрессивными карциномами яичников и молочной железы11,12. Поэтому в данном отчете мы используем лентивирусную репортерную конструкцию, содержащую красный флуоресцентный белок (RFP), экспрессия которого контролируется регуляторной областью SOX2, в качестве метода выделения предполагаемых ЦСК яичников.

По определению, ЦСК могут как самообновляться, так и дифференцироваться, давая начало всем типам опухолевых клеток. Предполагаемые популяции ЦСК должны быть проанализированы с помощью функциональных анализов, выполненных in vivo. По понятным причинам в клетках человека такие функциональные тесты ограничиваются анализами ксенотрансплантатов, включающими в себя в основном трансплантацию опухолевых клеток человека мышам с ослабленным иммунитетом10,13.

Альтернативный метод in vitro был предложен Брентом Рейнольдсом и Сэмом Вайсом, которые впервые сообщили о так называемом нейросферном анализе как суррогатном анализе, оценивающем стволовой потенциал в нервных клетках14. Донту и его коллеги позже подтвердили использование этого анализа для оценки потенциала стволовых клеток в клетках молочной железы15,16. Здесь клетки молочной железы человека были помещены в разном количестве в бессывороточную среду с добавлением эпидермального фактора роста (EGF), основного фактора роста фибробластов (bFGF), B-27 и гепарина и культивировались в неадгезивных условиях в течение семи-десяти дней до того, как формирование сферы было оценено с помощью микроскопии. Следуя этому протоколу с некоторыми корректировками количества клеток, питательной среды и добавок, несколько групп исследовали потенциал стволовых клеток in vitro из нескольких типов рака, таких как опухоли молочной железы17, головного мозга18, поджелудочной железы19 итолстой кишки 20. При карциноме яичников мы недавно сообщили о целесообразности анализа сфер и сравнили его результаты с результатами, собранными в моделях ксенотрансплантатов мышей in vivo 10. Мы обнаружили, что сверхэкспрессия белка стволовых клеток SOX2 усиливает как in vitro, так и in vivo опухолегенность клеток карциномы яичников человека10. Тем не менее, частота клеток, инициирующих сферу, была выше, чем частота клеток, инициирующих опухоль, измеренная in vivo10, что позволяет предположить, что либо анализ сфер может привести к ложноположительным результатам по техническим причинам, либо, в качестве альтернативы, анализ in vivo может быть неэффективным и привести к ложноотрицательным результатам.

В этом отчете мы более подробно анализируем анализы многоклеточных сфер яичников, рассматриваем различные протоколы, доступные в литературе, и сравниваем их с анализом на основе одной клетки. Мы показываем, что анализ на основе одной клетки обеспечивает более точные и воспроизводимые результаты, чем анализ на основе нескольких клеток, на который может сильно влиять плотность покрытых клеток, если в культуры не добавляется метилцеллюлоза для иммобилизации клеток. Однако, также в анализах на основе одиночных клеток, инициирующий сферический потенциал in vitro наблюдается с более высокой частотой, чем in vivo, инициирующий потенциал опухоли.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Генерация OVCAR-3 человека рак яичников клеток, стабильно трансдуцированную Лентивирусов Содержащие SOX2 регуляторной области Reporter Construct

  1. Создание лентивирусные частиц от трансфекции HEK 293T-упаковочную линию клеток с корреспондентом конструкции признании нормативно область Sox2, как описано 10,21.
    ПРИМЕЧАНИЕ: репортер построить дополнительно содержит дестабилизации домен ProteoTuner Shield System вперед белка флуоресценции tdTomato. Shield1 связывается с доменом дестабилизации тем самым предотвращая протеасомы ухудшить флуоресценции белка 22.
  2. Трансдукции OVCAR-3 клетки с лентивирусов частиц в течение периода времени от 24 ч. После удаления вируса супернатант и промыть клетки забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS) и культивировали в полной среде (RPMI, дополненной 10% FBS, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина).
  3. 48 ч позже, 10 мкг / мл PuroMYCIN добавляли к культурам и выдерживали в течение 5 дней, чтобы позволить выбор правильной трансдуцированных клеток.

2. Подготовка сортировки клеток и покрытия

  1. Добавить Shield1 1: 1000 разбавление 24 ч до сортировки клеток. Используйте стабильно трансдуцированные OVCAR-3 клетки без лечения Shield1 в качестве отрицательного контроля (рисунок 1). Аспирируйте носитель из колбы, промыть клетки 1х PBS и Trypsinize клетки с 0,05% трипсин-ЭДТА в течение 3 мин.
  2. Остановка с помощью трипсина полную среду (смотри выше), рассчитывать количество клеток, центрифуги клетки при 300 мкг при комнатной температуре (15 - 25 ° С) в течение 5 мин.
  3. Слить супернатант и ресуспендирования клеток тщательно 0,5 - 1 мл стерильной PBS.
  4. Используйте ячейки фильтра крышку фильтра 40 мкм для получения одного суспензии клеток.
  5. Отрегулируйте количество клеток до 5 миллионов клеток на мл.
  6. Подготовка сверхнизкой крепления 96-луночных планшетах с 100 мкл сфер средний (MEGM с добавлением факторов роста, цитокинов и дополнений,B-27, гепарин натрия; или DMEM / F12, дополненной факторами роста, цитокины, и добавки, В-27, гепарина-натри с добавлением или без добавления 1% метилцеллюлозы, смотри также таблицу 1). При желании добавить антибиотики в среде в концентрации 100 U / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина, чтобы свести к минимуму риск возможного загрязнения.
  7. Сортировка ППП + и RFP- клетки в подготовленные 96-луночных планшетах сверху, 1 клетка на лунку (одна ячейка на основе анализа сферы) и 100 клеток на лунку (мульти сферы клеток основе анализов), соответственно. Выполните сортировку по коммерчески доступного клеточного сортера (см Материалы), используя режим Single Cell, отсортируйте установки: 100 μ сопла, давление оболочка 20 фунтов на квадратный дюйм, и выход маски 0, маски чистота 32, фазовой маски 16.
  8. Оценка эффективности нанесения покрытия путем микроскопом совершение лунки, содержащие клетки (для одной ячейки на основе анализа) и подсчетом числа клеток в отдельных лунках (для нескольких клеток на основе анализа; фиг.2 ).
  9. Инкубируйте клетки при стандартных условиях в сферах среднего (для состава увидеть шаг 2,6) при 37 ° С и 5% СО 2. Дополнение ежедневно bFGF (20 нг / мл) и EGF (20 нг / мл).
  10. После одной недели, рассчитывать количество новых сфер опухолевые с помощью стандартного микроскопа с 4-кратным или 10-кратным увеличением и флуоресцентным микроскопом для обнаружения сигнала флуоресценции от интегрированной системы репортера. Граф сферы с диаметром, превышающим 100 мкм, как «больших» сфер и сферы диаметром 50 - 100 мкм, как «малых» сфер (рис 3). Будьте уверены, что вы считаете реальные сферы, а не кластеры клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В отдельных клеточных анализов сфера образования легче забить микроскопически после 10 (по сравнению с 7) дней культуры.
  11. Рассчитать долю сферы формирования клеток в RFP + и соответственно RFP- клеток в отдельных анализов на основе клеток (один 96-луночный планшет для каждого отдельного эксперимента) или нескольких клеток-баSED сферы анализы (одна скважина для каждого отдельного эксперимента), представленные Шоу и др. 16
    Примечание: Доля сферы образования клеток (%) = (число сфер) / (количество посеянных клеток) × 100

3. Серийные пассажи сфер

  1. Поместите содержимое каждой лунки в соответствующей стерильную пробирку и центрифуги при 300 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Для многоуровневая ячейка на основе сфер анализов, собрать воедино сферы из одной ямы. Вымойте хорошо 3 - 5 раз PBS и центрифуга 2 мин дольше. Для одиночных клеток на основе сфер анализов, собирать отдельные сферы. Из-за низкой числа клеток, используют 1,5 мл пробирки для центрифугирования и промывки этапов.
  2. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 200 мкл 0,05% трипсина-ЭДТА.
  3. Для достижения оптимального разделения клеток, инкубировать клеточную суспензию при 37 ° С в течение 5 мин в мягкую шейкере. Оптимизация трипсинизации время для вашего клеточной линии к более низкой ставке гибели клеток: если нет большойсферы видна растирают мягко, используя наконечник пипетки на 100 мкл. В случае крупные шарики по-прежнему присутствуют, инкубировать с трипсином еще 3 мин, а затем переходите к шагу тритурационного. В случае одного анализы на основе клеток убедитесь, оптимизировать время для оптимального выхода клеток живых клеток во время стадии обработки трипсином.
  4. Для инактивации трипсина, добавляют 500 мкл полной среды и центрифуге при 300 х г в течение 10 мин, в случае отдельных анализов клеток, центрифуги в течение дополнительных 2 мин.
  5. Удалить супернатант и ресуспендирования клеток тщательно сферах среде.
  6. Используйте ячейки фильтра крышку фильтра 40 мкм, чтобы получить один-клеточной суспензии.
  7. В случае использования RFP + и RFP- клеток в нескольких клеточных bassed анализов, оценить процент флуоресцирующих клеток в каждую лунку после ресуспендирования с помощью проточной цитометрии анализа.
  8. Для последовательных replating анализов отдельных клеток, семян 1 клеток на лунку в новый ультра низкой крепления 96-луночного планшета, полученных, как описано выше, С одной отдельной сфере, семян около 20 отдельных скважин. Для replating анализов на основе клеток нескольких первичных сфер, семена клеток, полученных из одной скважины первичных сфер в новый 96-луночного планшета и подсчитать число клеток на следующий день с помощью микроскопа.
  9. Оценка доли сферы клеток, образующих в средних сфер анализов, используя формулу, описанную в шаге 2.11.

4. Результат анализа

  1. Анализ результатов экспериментов, проведенных в независимых трижды и использовать T-Test Двусторонние Студенческая проанализировать нормально распределенных значений и иным Манна-Уитни тесты для статистического анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В обычных сфер анализов, почти 40% ЗП + OVCAR-3 клеток против 20% RFP- клеток привело к индивидуальной сфере опухоли в первичных сфер анализа (рис 4а). Кроме того, сферы, образованные ППП + клеток были больше по размеру, чем те, которые образованы путем RFP- клеток.

При посеве в отдельных клеточных анализов, RFP + клетки образуются также больше сфер, чем RFP- клеток, что подтверждает результаты выше. Тем не менее, существует тенденция к генерации меньшего количества сфер в в...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сферы культуры являются широко используемый метод для анализа стволовых клеток рака потенциал и обогащения стволовых клеток, как в широком диапазоне человеческих опухолевых клетках 15,25,26. В этих условиях культивирования, раковые клетки, которые не имеют самообновления, как ожидается, способность дифференцировать и в конечном итоге подвергаются клеточной гибели. Хотя они могут сначала образуют клеточные кластеры или даже опухоли сферы, особенно в начальных анализов, они не в состоянии поддерживать сферу фор...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано грантом от Baden-Württemberg Stiftung (Программа стволовых клеток для взрослых II), присужденным C.L. Мы благодарим доктора Мартину Конанц за критический вклад и рецензирование рукописи. Мы благодарим Эммануэля Траунекера и Тони Кребса из DBM FACS Facility (Университетская клиника Базеля) за помощь в сортировке FACS.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Пластина с низким креплениемCorning3474
MEGMLonzaCC-3151
ИнсулинLonzaCC-4136SingleQuots™ Набор
HydrocortisoneLonzaCC-4136SingleQuots™ Комплект
ЭФРLonzaCC-4136SingleQuots™ Набор
EGFSigmaE9644конечная концентрация: 20 нг/мл
FGFPeproTech100-18Bконечная концентрация: 20 нг/мл
B-27Invitrogen/ Gibco17504-044конечная концентрация: 1X
Heparin-Natrium-25000 IERatiopharmN68542.02разведение 1:1,000
Pen/StrepGibco15140-122
FCSGibco10500-064
RPMI 1640Gibco21875-034
Трипсин-ЭДТАGibco25300-054
Dulbecco s PBS (1X)Gibco14190-094
Shield1Clontech632189разведение 1:1,000
DMEM/F12Gibco21041-025
DMEM/F12 (порошок)Gibco42400-010
МетилцеллюлозаSigmaM0387
Пуромицина дигидрохлоридАпплименемA2856
Клетка сортировщикBDAria III клеточный сортировщик
FACS анализаторBDAccuri c6 проточный цитометр
МикроскопOlympusIX50 Osiris

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pardal, R., Clarke, M. F., Morrison, S. J. Applying the principles of stem-cell biology to cancer. Nat Rev Cancer. 3 (12), 895-902 (2003).
  2. Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
  3. Ahmed, N., Abubaker, K., Findlay, J. K. Ovarian cancer stem cells: Molecular concepts and relevance as therapeutic targets. Mol Aspects Med. 39, 110-125 (2014).
  4. Silva, I. A., et al. Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival. Cancer Res. 71 (11), 3991-4001 (2011).
  5. Kryczek, I., et al. Expression of aldehyde dehydrogenase and CD133 defines ovarian cancer stem cells. Int J Cancer. 130 (1), 29-39 (2012).
  6. Stewart, J. M., et al. Phenotypic heterogeneity and instability of human ovarian tumor-initiating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (16), 6468-6473 (2011).
  7. Ginestier, C., et al. ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome. Cell Stem Cell. 1 (5), 555-567 (2007).
  8. Chang, B., et al. ALDH1 expression correlates with favorable prognosis in ovarian cancers. Mod Pathol. 22 (6), 817-823 (2009).
  9. Cannistra, S. A., et al. CD44 variant expression is a common feature of epithelial ovarian cancer: lack of association with standard prognostic factors. J Clin Oncol. 13 (8), 1912-1921 (1995).
  10. Bareiss, P. M., et al. SOX2 expression associates with stem cell state in human ovarian carcinoma. Cancer Res. 73 (17), 5544-5555 (2013).
  11. Pham, D. L., et al. SOX2 expression and prognostic significance in ovarian carcinoma. Int J Gynecol Pathol. 32 (4), 358-367 (2013).
  12. Lengerke, C., et al. Expression of the embryonic stem cell marker SOX2 in early-stage breast carcinoma. BMC Cancer. 11, 42(2011).
  13. Lapidot, T., et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).
  14. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
  15. Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).
  16. Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
  17. Leis, O., et al. Sox2 expression in breast tumours and activation in breast cancer stem cells. Oncogene. 31 (11), 1354-1365 (2012).
  18. Higgins, D. M., et al. Brain tumor stem cell multipotency correlates with nanog expression and extent of passaging in human glioblastoma xenografts. Oncotarget. 4 (5), 792-801 (2013).
  19. Wang, Y. J., Bailey, J. M., Rovira, M., Leach, S. D. Sphere-forming assays for assessment of benign and malignant pancreatic stem cells. Methods Mol Biol. 980, 281-290 (2013).
  20. Li, Y. F., Xiao, B., Tu, S. F., Wang, Y. Y., Zhang, X. L. Cultivation and identification of colon cancer stem cell-derived spheres from the Colo205 cell line. Braz J Med Biol Res. 45 (3), 197-204 (2012).
  21. Wu, F., et al. Identification of two novel phenotypically distinct breast cancer cell subsets based on Sox2 transcription activity. Cell Signal. 24 (11), 1989-1998 (2012).
  22. Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G., Wandless, T. J. A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules. Cell. 126 (5), 995-1004 (2006).
  23. Kawase, Y., Yanagi, Y., Takato, T., Fujimoto, M., Okochi, H. Characterization of multipotent adult stem cells from the skin: transforming growth factor-beta (TGF-beta) facilitates cell growth. Exp Cell Res. 295 (1), 194-203 (2004).
  24. Walia, V., et al. Loss of breast epithelial marker hCLCA2 promotes epithelial-to-mesenchymal transition and indicates higher risk of metastasis. Oncogene. 31 (17), 2237-2246 (2012).
  25. Leung, E. L., et al. Non-small cell lung cancer cells expressing CD44 are enriched for stem cell-like properties. PLoS One. 5 (11), e14062(2010).
  26. Bertolini, G., et al. Highly tumorigenic lung cancer CD133+ cells display stem-like features and are spared by cisplatin treatment. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16281-16286 (2009).
  27. Ma, L., Lai, D., Liu, T., Cheng, W., Guo, L. Cancer stem-like cells can be isolated with drug selection in human ovarian cancer cell line SKOV3. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 42 (9), 593-602 (2010).
  28. Wang, H., Zhang, Y., Du, Y. Ovarian and breast cancer spheres are similar in transcriptomic features and sensitive to fenretinide). Biomed Res Int. 2013, 510905(2013).
  29. Du, Y. R., et al. Effects and mechanisms of anti-CD44 monoclonal antibody A3D8 on proliferation and apoptosis of sphere-forming cells with stemness from human ovarian cancer. Int J Gynecol Cancer. 23 (8), 1367-1375 (2013).
  30. Xiang, T., et al. Interleukin-17 produced by tumor microenvironment promotes self-renewal of CD133 cancer stem-like cells in ovarian cancer. Oncogene. , (2013).
  31. Liu, T., Cheng, W., Lai, D., Huang, Y., Guo, L. Characterization of primary ovarian cancer cells in different culture systems. Oncol Rep. 23 (5), 1277-1284 (2010).
  32. Soritau, O., et al. Enhanced chemoresistance and tumor sphere formation as a laboratory model for peritoneal micrometastasis in epithelial ovarian cancer. Rom J Morphol Embryol. 51 (2), 259-264 (2010).
  33. Shi, M. F., et al. Identification of cancer stem cell-like cells from human epithelial ovarian carcinoma cell line. Cell Mol Life Sci. 67 (22), 3915-3925 (2010).
  34. Zhang, S., et al. Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors. Cancer Res. 68 (11), 4311-4320 (2008).
  35. Liang, D., et al. The hypoxic microenvironment upgrades stem-like properties of ovarian cancer cells. BMC Cancer. 12, 201(2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

SOX2

Похожие статьи