Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

ОТВЕТСТВЕННОСТЬ пигментного эпителия сетчатки (НПП) и из индуцированных плюрипотентных стволовых (IPS) клетки по-разному размеры эмбриональных телец

10K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52262

⸱

4 февраля 2015 г.

 ,  ,  ,  , 
1Ocular Trauma, U.S. Army Institute of Surgical Research

В этой статье

Краткое содержание

Цель настоящего доклада состоит в описании протоколов для получения пигментного эпителия сетчатки (НПП) и из индуцированных плюрипотентных стволовых (плюрипотентных) клеток, используя различные размеры эмбриональных органов.

Аннотация

Плюрипотентные стволовые клетки обладают способностью бесконечно размножаться и дифференцироваться практически в любой тип клеток. Кроме того, разработка методов перепрограммирования соматических клеток в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPS) вызвала интерес и волнение по поводу возможности индивидуальной персональной регенеративной медицины. Тем не менее, эффективность дифференцировки стволовых клеток в направлении желаемой линии остается низкой. Целью данного исследования является описание протокола получения пигментного эпителия сетчатки (РПЭ) из iPS-клеток (iPS-RPE) путем применения подхода тканевой инженерии для получения однородных популяций эмбриоидных телец (БЭ), общего промежуточного звена при дифференцировке in vitro. В протоколе применяется формирование определенного размера БЭ с использованием технологии микролуночных планшетов. Также объясняются методы идентификации белковых и генных маркеров РПЭ методами иммуноцитохимии и полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Наконец, описана эффективность дифференцировки БЭ разных размеров, контролируемая с помощью флуоресцентно-активируемого анализа маркеров РПЭ методом сортировки клеток (FACS). Эти методы облегчат дифференцировку iPS-клеток в RPE для будущих применений.

Введение

Индуцированные плюрипотентные стволовые (IPS) клетки типа плюрипотентных стволовых клеток, полученных путем перепрограммирования взрослых клеток с внешними факторами 1. В отличие от этого, эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), другой тип плюрипотентных стволовых клеток, которые генерируются из внутренней клеточной массы бластоцисты 2-3. Несмотря на их различное происхождение, плюрипотентных клеток и ЭСК сравнимы по их неограниченной мощности, чтобы воспроизвести в пробирке и в их способности дифференцироваться в любой тип клеток 4-5. Эти характеристики плюрипотентных клеток делает их идеальными кандидатами для применения в персональной регенеративной медицины. Последние научно-исследовательские работы сосредоточены на разработке надежных протоколов дифференциации по производству специализированных взрослых клеток, включая пигментный эпителий сетчатки (ПЭС) 6-11.

Для потенциальных клинических применений плюрипотентных клеток, полученных, направленной дифференцировки для этого конкретного типа клеток является существенным. Есть различные методыопубликованы направленной дифференцировки обоих ЭСК и плюрипотентных клеток в ПЭС, что сильно варьируется в их эффективности 6-7, 12-16. Мы до сих пор не знаю, что многие из молекулярных событий, которые регулируют судьбу клеток / ткани в процессе развития или дифференциации. В последние годы, были предприняты усилия для разработки протокола дифференцировки, которые могут имитировать эмбрионального развития, как это возможно. В бластоцисты фазе, неизрасходованный население стволовых клеток вместе в трехмерной микросреде. Таким образом, различные стратегии были применены, чтобы сделать клетки ESC / IPS собраны вместе и расти их в трех измерениях. Эти стволовых клеток агрегаты называются эмбриональные органы (EBS). Исследования показали, что EB дифференцировки стволовых клеток имитировать ранней стадии развития эмбриона и могут самопроизвольно привести к примитивной энтодермы на его внешней поверхности. Позже, по мере развития развития Е.Б., дифференцированная клетка фенотипы всех трех зародышевых линий появляются 17-18. Therefore, EBS на основе дифференциации протоколы привлекли много внимания к дифференцировке в пробирке ESC / IPS клетки и хорошим кандидатом для производства НПП из плюрипотентных стволовых клеток 13.

ЭТ можно сделать, используя несколько методов от регулятора / IPS клеток. Первоначально ЭТ были сделаны соскабливания прилипшие колоний и поддержания их в неадгезированных суспензионной культуре. Тем не менее, этот подход дает гетерогенную популяцию ЭТ, что вызывает низкую воспроизводимость. Висячие культуры клеток падение и микролуночный формирование ЭТ основе Другие популярные методы для формирования ЭТ, которые дают однородные ЭТ определенных размеров, которые легко воспроизводимым. Кроме того, этот метод может дать микролуночный большое количество агрегатов с меньшим усилием.

Дифференцирование клеток в ЭТ регулируется мультиплексированием морфогенетических сигналов от внеклеточной и внутриклеточной микросреды. В отличие от дифференциации в Пнolayer формат ЭТ обеспечить платформу для комплексной сборки клеток и межклеточного сигналов, чтобы произойти 17. Интересно, что наблюдалось количество плюрипотентных стволовых клеток, используемых для отдельных ЭТ влиять на судьбу клеток. Например, в кроветворной исследования дифференциации эмбриональных клеток, было отмечено, что 500-клеточной EB стимулирует дифференциацию к миелоидной то время как 1000-клетки EB толкают к эритроидного линии 20. В другом исследовании, меньше ЭТ выступает энтодермы дифференциацию в то время как более крупные ЭТ способствовало к нервно-ктодерму дифференциации 11, 17.

Эти последние исследования убедительно показывают, что число ESC / IPS клеток, используемых для отдельных ЭТ влияют на ЭТ, основанные дифференциацию любых типов клеток. Однако, по нашим сведениям, не существует каких-либо текущих исследований, которые вскрыли влияние размера EBS в своей склонности к дифференциации к ПЭС. Целью данного исследования является описание влиянияEB размер по наведению стебля плюрипотентных (IPS) клеток - пигментный эпителий сетчатки (IPS-РПЭ) дифференциация и определить оптимальное количество клеток, чтобы сделать ЭТ для направленной дифференцировки в сторону НПП линии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка культуры Реагенты и культуральные планшеты

  1. Подготовьте подачи свободной стволовых клеток культуральной среды путем добавления 100 мл 5х бессывороточной дополнение к 400 мл стволовых клеток базальной среде. Носитель является стабильным при 4 ° С в течение до 2-х недель, и при -20 ° С в течение 6 месяцев.
  2. Добавить 10 мкМ раствор ро-ассоциированный, суперспирализованного, содержащий протеин киназы (ROCK) ингибитора (Y-27362) в продаже эмбриоидного тела (EB) образование среды.
  3. Подготовка дифференциации среды путем добавления 0,1 мМ β-меркаптоэтанола, 0,1 мМ заменимых аминокислот, 2 мМ L-глутамина, 10% замены нокаутом сыворотки (KSR) и 10 мкг / мл гентамицина, чтобы Дульбекко в модификации Дульбекко / питательной смеси F-12 (DMEM / F12).
  4. Подготовка IPS-НПП среды путем добавления 1x N1 добавки, 0,1 мМ заменимых аминокислот, 250 мкг / мл таурин, 13 нг / мл трииодо-L-тиронин соль натрия, 20 нг / мл гидрокортизона, 5 мкг / мл гентамицина и 15% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 21 минимально необходимой среды Игла (MEM). Доводят рН до 7,4.
  5. Подготовка трииодо-L-тиронина соли запаса натрия. Растворите 1 мг трииодо-L-тиронина натриевой соли в 1 н гидроксида натрия, осторожно вращая. Добавить 49 мл MEM, чтобы 50 мл 20 мкг / мл трииодо-L-тиронина натриевой соли. Подготовка аликвоты и заморозить при -20 ° C до необходимости. Использование соответствующего объема для достижения желаемой концентрации в конечной культуральной среде.
  6. Подготовка гидрокортизон маточного раствора. Солюбилизации 1 мг гидрокортизона в 1 мл 100% -ного этанола при осторожном перемешивании. Добавить 19 мл MEM, чтобы 20 мл 50 мкг / мл гидрокортизона раствор. Аликвоты и заморозить при температуре -20 ° С до использования. Использование соответствующего объема для достижения желаемой концентрации в конечной культуральной среде.
  7. Подготовка рабочего раствора диспазу 1 мг / мл в DMEM / F12.
  8. Подготовка матрицы с покрытием пластин
    1. Подготовка матрицы белка, выделенного из Engelbreth-Холм-рой (EHS) Меморандум о взаимопониманиисаркома SE клетки в DMEM / F12 до 0,08 мг / мл. Шерсть каждую лунку 6-луночного планшета с 1 мл раствора матрицы. Инкубируйте покрытием пластин при комнатной температуре в течение 1 часа.
    2. После 1 ч инкубации аспирации избыточного DMEM / F12. Добавить 0,5 мл фидерных без стволовых клеток культуральной среде, чтобы предотвратить высыхание скважин. Планшеты с покрытием матрицы готовы к использованию.
  9. Подготовка микрострипы пластины, путем промывки в каждую лунку по 2 мл DMEM / F12. Удалить DMEM / F12 и добавить 0,5 мл формирования EB среде с добавлением Rock ингибитора в каждую лунку. Центрифуга пластины при 2000 х г в течение 5 мин, чтобы удалить пузырьки воздуха.
  10. Подготовка FACS буфера окрашивания путем смешивания 2% FBS, и 0,09% азид натрия в фосфатно-солевом буфере (PBS). Регулировка буфер до рН 7,4.
  11. Подготовка трипсин раствор нейтрализующей добавлением 10% FBS, чтобы DMEM / F12.

2. плюрипотентных Культура

  1. Перед IPS посева клеток, теплый питатель, свободной от стволовых клеток культуральной среды до 37 ° С, и имеют маТрикс покрытием пластин готов.
  2. Быстро разморозить клетки IMR90-1 плюрипотентных в C на водяной бане 37 °. Затем снимите крио-флакон из водяной бани и протрите ампулу с 70% этанола. Передача клеток в 15 мл коническую трубку, используя 2 мл пипетку, чтобы свести к минимуму нарушение клеточных комочков.
  3. Добавить 5 мл теплой подачи без стволовых клеток культуральной среды для клеток каплям и осторожно перемешать. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре, и удалить супернатант.
  4. Тщательно ресуспендирования скопления клеток в 2 мл подачи без стволовых клеток культуральной среды и семенем скопления клеток в лунках матрицы покрытием пластины. Место пластины в 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2, 95% влажности.
  5. Изменить среду клеточной культуры IPS ежедневно. Соблюдайте недифференцированных колониям 6:55 дней после посева. Проверьте недифференцированных колоний, которые готовы для прохода (колоний с плотной центра) под световым микроскопом.

3. пассажи из плюрипотентных клеток

  1. До начала и до прохождения клетки IPS, согреть диспазу решение, DMEM / F12 и подачи без стволовых клеток культуральной среде до 37 ° C на водяной бане.
  2. Перед пассажей плюрипотентных клеток, удалите все области дифференциации, очищая территорию и аспирационных среду. Тщательно промойте клетки плюрипотентных с 2 мл DMEM / F12.
  3. Добавить 1 мл 1 мг / мл диспаза в каждую лунку и инкубируют при 37 ° С в течение 7 мин. Аспирируйте диспазу и осторожно промыть клетки колонии с 2 мл DMEM / F12 два раза. После промывки, добавьте 2 мл фидерных без стволовых клеток культуральной среде в каждую лунку.
  4. Использование 5 мл пипетку осторожно очистить колонии пластины с образованием клеточных скоплений. Передача отдельные сгустки клеток в 15 мл коническую трубку. Добавьте достаточное количество подачи без стволовых клеток культуральной среды, чтобы отобрать следующий отрывок клеток.

4. Генерация ЭТ Использование Планшетный

  1. Получение суспензии отдельных клеток из плюрипотентных клеток
    1. Снимите mediuм от плюрипотентных клеток и промыть клетки плюрипотентных 2 мл DMEM / F12. Добавить 750 мкл Accutase для плюрипотентных клеток в каждую лунку 6-луночного планшета. Инкубируйте клетки при 37 ° С и 5% CO 2, чтобы клетки, чтобы отсоединить от пластины (примерно 5-10 мин).
    2. Используйте пипетку осторожно отделить все оставшиеся клетки и отделить все оставшиеся клетки на поверхности пластины. Передача клеток в 50 мл коническую трубку. Промыть пластины с 5 мл DMEM / F12, и объединить промыть DMEM / F12 с клетками в конической трубе. Передайте клеточной суспензии через сито 40 мкм клетки, чтобы удалить любые возможные скопления остаточных клеток.
    3. Центрифуга клетки при 300 х г в течение 5 мин при комнатной температуре, чтобы удалить Accutase. Ресуспендируют осадок клеток в формировании среды EB таким образом, что концентрация клеток составляет примерно 0,5-1,0 × 10 7 клеток / мл.
    4. Определить количество жизнеспособных клеток путем подсчета клеток с трипановым синим и гемоцитометра.
  2. Adjustinг плотность клеток в лунках, чтобы сформировать контролировали по размеру ЭТ
    1. Регулировка количества клеток в каждую лунку в планшете генерировать желаемые размеры EB. Добавить клеток в лунки пластин, полученного на стадии 1.9, равномерно распределить клетки осторожно пипеткой несколько раз клеткам.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество ячеек, необходимых на лунку = требуемое количество клеток на EB х количество лунок на лунку.
    2. Регулировка среды пласта ЕВ с добавлением ингибитора Rock в лунках, к конечного объема 2,0 мл. В распространении клетки осторожно пипеткой в ​​каждую лунку. Центрифуга Планшетный на 100 мкг в течение 3 мин. Место пластин в инкубаторе при 37 ° С с 5% СО 2 и 95% влажности в течение 24 ч.
  3. Сбор ЭТ из Планшетный
    1. Урожай ЭТ из лунок с помощью пипетки среды в хорошо вверх и вниз с 1 мл микропипетки для удаления большей части ЭТ. Суспензию пропускали EB через перевернутый 40 мкм ячейкифильтр в верхней части 50 мл коническую трубку, чтобы удалить отдельные клетки.
    2. Вымойте планшете 5 раз 1 мл DMEM / F12, чтобы удалить все EBS. Сбор моет и передать перевернутой ячейки фильтра. Поверните ячейки фильтра лицевой стороной вверх на новый 50 мл коническую трубку. Сбор ЭТ промывкой формирования среды EB. Количество ЭТ для определения выхода.

5. Покрытие ЭТ и начало Дифференциация

  1. Пластина ЭТ на белковой матрицы, покрытой шесть-луночных планшетах (как на этапе 1.8.1) при плотности <1000 ЭТ / лунку в среде формирования EB плюс Rock ингибитора 10 мкМ. Инкубируйте ЭТ при 37 ° С с 5% СО 2 и 95% влажности в течение 24 ч.
  2. 24 ч после EB покрытия, заменить дифференциации среды, чтобы инициировать дифференциацию. Изменение половина дифференцировки среды через день до тех пор, пока клетки собирают для последующего анализа.
  3. Сбор образцов на 6-й день, 17, 29 и 60, чтобы провести RT-PCR, IMMunocytochemistry и FACS для проверки выражение характерных генов и белков ПЭС.

6. Экстракция РНК и ПЦР

  1. Извлечение РНК из образцов EB в соответствии с инструкциями, приведенными в коммерчески доступного набора. Определить концентрацию РНК с помощью спектрофотометра.
  2. Выполнение обратной транскрипции на 100 нг общей РНК в соответствии с коммерчески доступной РНК в кДНК обратной транскрипта комплекта.
  3. Выполнение ПЦР с 10 нг кДНК с использованием следующих праймеров (таблица 1) при концентрации 10 мкмоль / 10 нг кДНК. Установка ПЦР следующим образом: денатурация ДНК при 95 ° С в течение 5 мин, усиливаются с 35 циклами при 95 ° С в течение 15 сек, 60 ° C в течение 30 сек, 72 ° С в течение 1 мин, а затем в последнем цикле на 72 ° С в течение 10 мин. Запуск ПЦР-продукт на 1% агарозном геле.

7. Иммуноцитохимия

  1. Вымойте ЭТ с PBS в два раза при комнатной температуре. Закрепите ЭТ при комнатной температуре в 4% paraformaldehyde в течение 10 мин. Промыть один раз PBS при комнатной температуре. Магазин образцы в PBS при 4 ° С до тех пор, пока используется для окрашивания.
  2. На окрашивания дня гости фиксированные клетки с фиксацией и проницаемости реагентов. Инкубируйте образцы с блокирующим раствором (10% козьей сыворотки в пермеабилизации раствора) в течение 1 ч при комнатной температуре.
  3. Выполнение иммунохимии в 10% козьей сывороткой в ​​пермеабилизации раствора с использованием следующих первичных антител в указанных разведений: анти-Pax6 (1:10), анти-RX (1: 200), анти-MITF (1:30), а анти- ZO1 (1: 100). Инкубируйте образцы с соответствующими антителами O / N при 4 ° С.
  4. На следующий день, снимите первичное антитело из клеток и промыть образцы три раза PBS. Инкубируйте образцы с флуорофором-конъюгированные вторичные антитела в течение 1 ч при комнатной температуре.
  5. Удалите вторичное антитело из клеток и промыть образцы трижды в PBS. Установите крышку скользит на стеклах с DAPI, содержащей монтажную среду и позволяют образцы, чтобы установить O / N в темной камере.Используйте флуоресцентного микроскопа для визуализации окрашивания.

8. Окрашивание для анализа FACS

  1. Вымойте культурно ЭТ в PBS в два раза. Инкубируйте ЭТ с 0,5 мл 0,25% трипсина в течение 5-10 мин, чтобы суспензии отдельных клеток. Нейтрализовать трипсина трипсином нейтрализующего раствора (1 мл / лунку).
  2. Передача клеточной суспензии в 15 мл коническую пробирку и центрифугируют при 600 х г в течение 10 мин.
  3. Жидкость над осадком сливают и добавляют 10 мл DMEM / F12 с клетками в трубке. Аккуратно переверните, чтобы перемешать клетки. Центрифуга на 600 х г. После центрифугирования, отбросить супернатант и ресуспендирования клеток в FACS буфере окрашивания.
  4. Подсчитайте общее количество клеток. Центрифуга при 600 х г в течение 10 мин. После центрифугирования отбросить супернатант. Зафиксировать клетки немедленно при добавлении 0,5 мл 4% параформальдегида. Все хорошо перемешать, осторожно встряхивая. Инкубируйте клетки при 4 ° С в течение 20 мин.
  5. Центрифуга при 600 мкг в течение 10 мин и снятьсупернатант. Vortex мягко, чтобы сорвать осадок клеток. Клетки проницаемыми добавлением 1 мл охлажденного раствора пермеабилизации. Вихревой аккуратно, чтобы смешать и инкубировать на льду в течение 30 мин.
  6. Центрифуга при 600 х г в течение 10 мин и удалить супернатант. Добавить 3 мл FACS окрашивания буфера и ресуспендируют. Повторите этот шаг для еще один раз. Ресуспендируют клеток в FACS буфере окрашивания в конечной концентрации 5 × 10 6 клеток / мл.
  7. Передача 100 мкл клеточной суспензии (0,5 × 10 6 клеток) в каждую микроцентрифужные пробирки и добавить рекомендуемый объем первичного антитела. Для Рах6, добавить 5 мкл PE анти-Рах6 в 100 мкл клеточной суспензии. Для MITF, добавить 5 мкл анти-MITF в 100 мкл клеточной суспензии.
  8. Тщательно перемешать, инкубировать при комнатной температуре в течение 60 мин. Добавить 3 мл FACS буфера окрашивания. Смешайте и центрифуге при 600 мкг в течение 10 мин. Удалить супернатант и повторите 8,16 в течение двух дополнительных раз.
  9. Для окрашивания MITF, инкубировать клетки в средней antiboду, козы против мышиного Alexa Fluor 488 в разведении 1: 2000 в течение 1 часа при 4 ° С. Для окрашивания Рах6, избежать этого шага.
  10. Промыть клеток с 5 мл FACS буфера и окрашивания центрифуге при 600 х г в течение 10 мин. Повторите этот процесс для еще два раза.
  11. Ресуспендируют клеток в 500 мкл FACS буфера и окрашивания вихря осторожно, чтобы нарушить клеточный осадок. Образцы готовы для анализа проточной цитометрии.

9. IPS-НПП Выделение и культуры

  1. В 29-й день аккуратно вырезать вокруг выделенных пигментных колоний от пластины культуры с использованием пипетки 200 мкл. Передача с плавающей колонии в 15 мл коническую трубку. Центрифуга колоний при 600 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре, и удалить супернатант.
  2. Ресуспендируют клеток колонии в 10 мл DMEM / F12 и центрифуге при 600 х г в течение 10 мин. Удалить супернатант.
  3. Подготовка суспензии отдельных клеток путем инкубации колонии с 2 мл 0,25% трипсина при 37 ° С в течение 7-10 мин, Аккуратно вихрь клеточной суспензии отделить колоний.
  4. Нейтрализовать трипсина путем добавления 2 мл IPS-НПП среды. Центрифуга при 600 х г в течение 10 мин и отбросить супернатант. Ресуспендируют отдельные клетки в 2 мл IPS-НПП среды. Передача клеток в белковой матрице с покрытием 6-луночного планшета и место в инкубаторе при 37 ° С, 5% СО 2 и 95% влажности.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В этом эксперименте, плюрипотентных клетки культивировали и дифференцировались в ПЭС линии от EB. ЭТ контролируемых размеров были сформированы с использованием Планшетный. Как видно на рисунке 1 формирования EB была гомогенной в Планшетный. Эти ЭТ затем собирали и высевали на 6-луночные планшеты (рис 2).

НПП могут быть идентифицированы по их классической шестиугольной морфологии, пигментации и выражения ПЭС маркеров. После 12 недель культуры, 200-клеток ЭТ б...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Для полной реализации обещание плюрипотентных стволовых клеток для клеточной терапии, необходимо регулировать их дифференцировку в последовательной и воспроизводимой образом. Этот отчет описывает протоколы для формирования контролировали по размеру ЭТ с использованием микролуночные технологии пластины, инициировать дифференциацию к ПЭС и идентификации белковых и генных маркеров ППД. Для синхронизации дифференциации в пробирке, однородные размеры ЭТ были сформированы с помощью известных чисел иПК центрифугировал...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мнения или утверждения, содержащиеся здесь, являются частными взглядами авторов и не должны толковаться как официальные или отражающие взгляды Министерства армии или Министерства обороны. Это исследование было проведено в то время, когда авторы Альберто Муньис, Рамеш Р. Кайни, Уитни А. Грин и Чжэ-Хёк Чой были постдокторантами Национального исследовательского совета в USAISR. Эта работа была поддержана Исследовательской программой клинической реабилитационной медицины армии США (CRMRP) и Исследовательской программой военной оперативной медицины (MOMRP).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
mTeSR1 media + 5x добавкаStem Cell Technologies5850
Y-27632 (Rock Inhibitor)Технологии стволовых клеток72304
DMEM/F12Life Technologies11330-032
2-меркаптоэтанолSigmaM-7154
Заменимые аминокислотыHyclone (Fisher)SH30853.01
Нокаутирующая замена сывороткиLife Technologies10828-028
Гентамицин Life Technologies15750-060
L-глютаминLife Technologies25030-081
MEM mediaLife Technologies10370-021
N1 добавкаSigmaN-6530-5ML
ТауринSigmaT-8691-25G
ГидрокортизонSigmaH0888-1G
Плод крупного рогатого скота сывороткаГиклон (Fisher)SH3008803HI
Трийодо-L-тиронин натрия  сольSigmaT6397
Гидроксид натрияSigmaS5881
DispaseLife Technologies17105-041
MatrigelBD Biosciences354277
Фосфатный буферный физиологический растворHyclone(Fisher)10010-023
Aggrewell 400 Планшетныетехнологии стволовых клеток27940
AggreWell Технологии среднихстволовых клеток5893
Технологии стволовых клетокAccutase7920
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit BDBiosciences554714
мышиного антитела Anti-PAX6Исследования развития Hybridoma Bank
Rabbit Anti-RX антителаAbcamAb23340
Mouse  Anti-MITF антителоThermo ScientificMS-772-P
Rabbit Anti-ZO-1 антителоInvitrogen40-2200
RNeasy plus mini kitQiagen74134
PCR master mixPromegaM7502
Высокая емкость РНК к кДНК наборLife Technologies4387406

Ссылки

  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).
  2. Reubinoff, B. E., et al. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  4. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  5. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  6. Buchholz, D. E., et al. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (10), 2427-2434 (2009).
  7. Ukrohne, T. U., et al. Generation of retinal pigment epithelial cells from small molecules and OCT4 reprogrammed human induced pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 1 (2), 96-109 (2012).
  8. Subba, R. M., Sasikala, M., Nageshwar, R. D. Thinking outside the liver: induced pluripotent stem cells for hepatic applications. World J Gastroenterol. 19 (22), 3385-3396 (2013).
  9. Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: a source of cardiac regeneration. J Mol Cell Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).
  10. Mak, S. K., et al. Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage. Stem Cells Int. 2012, 140427(2012).
  11. Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
  12. Cour la, M., Tezel, T. The Retinal Pigment Epithelium. Advances in Organ Biology. 10, 253-273 (2006).
  13. Vaajassari, V., et al. Toward the defined and xeno-free differentiation of functional human pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelial cells. Mol Vis. 17, 558-575 (2011).
  14. Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4 (12), e8152(2009).
  15. Muniz, A., et al. Retinoid uptake, processing, and secretion in human iPS-RPE support the visual cycle. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (1), 198-209 (2014).
  16. Meyer, J. S., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (39), 16698-16703 (2009).
  17. Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnol Prog. 25 (1), 43-51 (2009).
  18. Kurosawa, H. Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells. J Biosci Bioeng. 103 (5), 389-398 (2007).
  19. Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
  20. Ng, E. S., et al. Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation. Blood. 106 (5), 1601-1603 (2005).
  21. Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).
  22. Maintenance of hESCs and hiPSCs. mTESR1 and mTESR2. , Stem Cell Technologies. Available from: http://www.stemcell.com (2010).
  23. The Analysis of DNA or RNA using its wavelengths: 230 nm. 260 nm. 280nm.. About Biotechnology. 230, Available from: http://archive.today/0qTh (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Индуцированные плюрипотентные стволовые клеткиформирование эмбриональных телецтехнология микролуночных планшетовнаправленная дифференцировкаиммуноцитохимияанализ методом ОТ-ПЦРсортировка клеток с помощью флуоресцентно-активированного клеточного сортировщикаэкспрессия маркеров РПЭинкубация клеточных культур
ОТВЕТСТВЕННОСТЬ пигментного эпителия сетчатки (НПП) и из индуцированных плюрипотентных стволовых (IPS) клетки по-разному размеры эмбриональных телец
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.