Методическая статья

Ближней инфракрасной (NIR) света увеличивается экспрессия маркера функции митохондрий у мышей вестибулярного сенсорного эпителия

DOI:

10.3791/52265

⸱

14 марта 2015 г.

 ,  ,  , 
1Discipline of Physiology, University of Sydney, 2Discipline of Biomedical Science, University of Sydney

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Митохондриальная дисфункция является отличительной чертой клеточного старения. Эта статья использует неинвазивный ближней инфракрасной (NIR) лечение, чтобы улучшить функцию митохондрий в старении мыши вестибулярного сенсорного эпителия.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Стратегии для ослабления снижение функции баланса с увеличением возраста преимущественно сосредоточены на физической терапии включая балансовые задач и упражнений. Тем не менее, эти подходы не решают основных причин снижения балансовой стоимости. Использование мыши, оценивали влияние ближней инфракрасной (NIR) на метаболизм клеток в вестибулярных сенсорного эпителия. Данные, собранные показывает, что это просто и безопасно вмешательство может защитить эти уязвимые клетки от вредного воздействия естественного старения. мРНК экстрагировали из изолированного периферийного вестибулярного сенсорного эпителия (CRISTA ampullaris и утрикулярной макулы), а затем транскрибируется в кДНК-библиотеки. Эта библиотека была затем зондировали на экспрессию повсеместного антиоксидант (SOD-1). Выражение Антиоксидант гена, затем использовали для количественной оценки клеточного метаболизма. Использование транскраниальной доставку Нир у молодых (4 недели) и старше (8 - 9 месяцев) мышей и режим краткого рассмотрения (90 сек / день в течение 5 днейАйс), эта работа предполагает Нир само по себе может быть достаточным, чтобы улучшить функцию митохондрий в вестибулярной сенсорной эпителия. Поскольку в настоящее время нет в наличии, доступные неинвазивные методы терапии для улучшения вестибулярной функции волосковых клеток, применение внешним БИК излучения создает потенциальный стратегию противодействия влияния старения на клеточном метаболизме InThe вестибулярного сенсорного эпителия.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Снижение производительности баланса и последующего спада являются общими, и, к сожалению, часто определяющие особенности естественного старения 1. Влияние этого снижения может быть как физическое, так и социальные, и значительно снижает качество жизни для пожилых людей. В ответ, физические методы лечения и реабилитации были объектом исследований в падений, но не были связаны с последовательным снижением распространенности повторных падений. В то же время, работа исследования изменений в периферической или центральной системы вестибулярного (система, отвечающая за поддержание баланса) не хватает, и потенциальных терапевтических стратегий, направленных на эти системы и основные причины дисбаланса ограничено.

Последние работы по возрастными нейродегенеративных расстройств, включая возрастной макулярной дегенерации 2-4, модели болезни Альцгеймера 5-8, и болезни Паркинсона 9-12 показали, нейропротекторное действие СИmple неинвазивный применение ближней инфракрасной (NIR) света. Кроме того, в вестибулярной системы, Нир был использован для повышения активности вестибулярных первичных афферентных нейронов в пробирке 13. В то время как механизм Нир света не очень хорошо понял, большинство исследований с использованием БИК предположили, что Нир стимулирует митохондрии комплекс IV (цитохром с-оксидазы) 14-17, чтобы облегчить клеточный метаболизм. В вестибулярном сенсорного эпителия субкутикулярных пластина типа я волосковых клеток плотно в митохондриях 18 и, таким образом, может представлять собой сайт действий для терапевтического лечения НДК.

Здесь кратко, неинвазивного лечения режим transcranially применяется Нир, которые могут быть использованы для измерения клеточный метаболизм (и, как следствие, функции митохондрий) в мыши вестибулярного сенсорного эпителия описаны. Также обсуждается подготовка вестибулярного сенсорного эпителия и показано, что Нир увеличивает экспрессию ubiquitoнам антиоксидант супероксиддисмутаза (1) в сенсорном эпителии - было показано ранее, важно для выживания клеток улитки волос 19.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

О себе Этика: Все процедуры, описанные ниже, были одобрены Университета комитета Сидней животных этике.

1. Животные

ПРИМЕЧАНИЕ: 1 и 8 - 9-месячный мышей (C57 / BL6) были получены из ресурсного центра животных (Перт, Австралия). Мышей содержали в Bosch грызунов фонда в университете Сиднея.

  1. Дом мышей в стандартных клетках мыши на 12/12 ч свет / темнота цикла с доступом к пище и воде вволю.
  2. Разделите мышей в каждой возрастной группе в ближней инфракрасной (NIR), обработанные, или фиктивных лечение группы (контроль) для сравнения.

2. ближней инфракрасной (NIR) Облучение и Шам Лечение

  1. Бритье мех на голове и шее мыши электрической бритвой, насколько это возможно, чтобы предотвратить быстрое отрастание волос до завершения режима лечения. Для поддержания патогена, свободной от статуса у мышей, использовать 70% этаноладля очистки инструментов от бритья животных и F10 ветеринарной дезинфицирующего средства между животными из отдельных клеток. Делайте это 2 - 3 дня до начала лечения, так животные не слишком обработаны.
  2. Задержите курсор, удерживая проксимального конца хвоста и дайте ему отдохнуть в ладонь одной руки или поверхности стола так, чтобы минимизировать стресс, который может привести к ложным результатам.
  3. Держите НДК (670 нм) LED (светодиодная) устройство 1 - 2 см от обнаженного (бритой) Площадь и включите устройство в течение 90 сек (рис 1А).
    Примечание: изменение температуры, в результате воздействия 90 сек измеряли как <0,2 ° С в 100 мл воды.
  4. Повторите шаги 2,2 - 2,3 для лечения обман группе животных, но оставить устройство выключено (рисунок 1b).
  5. Повторите этапы 2,2 - 2,3 для NIR-блокированного лечения группы животных, но охватывает устройство с алюминиевой фольгой.
  6. Повторите шаги 2,2 - 2,5 ежедневно в approximatE 24 интервалов ч в течение 5 дней подряд.
  7. Выписка вестибулярный сенсорный эпителий (3 кристы и 1 утрикулярные макулы) из обоих ушей на пятый день после обращения (смотри раздел 3 ниже).

3. Ткань Добыча 20

  1. Подготовьте 300 мл глицерина на основе искусственного спинномозговой жидкости (ACSF), состоящие из (в мМ): 26 NaHCO 3, 11 глюкоза, глицерин 250, 2,5 KCl, 1,2 NaH 2 PO 4, 1,2 MgCl 2, 2,5 и CaCl 2. До добавлением CaCl 2, газовые решение с карбогена (95% O 2 и 5% СО 2), чтобы установить рН 7,4 и избегать поспешности кальция (облачность). Холод раствор в -80 ° C морозильнике в течение 45 мин так, чтобы лед образуется суспензия.
  2. Подготовка выделения РНК буфера для лизиса в маркированных завинчивающейся крышкой микропробирок (останавливает треск крышками, когда изменения давления трубка между замораживания и оттаивания в жидком азоте) в соответствиис инструкциями производителя или обычных лабораторных практикумов. Есть жидкий азот готов в алюминиевом сосуд Дьюара.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте защитную одежду и eyeware при обращении с жидким азотом. Убедитесь, что используется жидкий азот в хорошо проветриваемом помещении, объем его виде газа примерно в 700 раз, что его жидкой форме и может вызвать удушье.
  3. Глубоко анестезию мыши с кетамина (400 мг / кг) через внутрибрюшинным инъекции. Разрешить задних конечностей рефлекс полностью ослабевать признак того, что мыши полностью под наркозом.
  4. Обезглавьте мышей с острыми ножницами из нержавеющей стали и сделать надрез вдоль сагиттальной кожи черепа с помощью лезвия бритвы (округляется # 22). На данный момент и в течение шаги 3,5 - 3,9, держите свода черепа, мозга и основной вестибулярный аппарат так круто, как можно с помощью регулярного применения ледяной ACSF над ткани.
  5. Использование острый руку стандартных ножниц модели сделать Смальл разрез в черепе на Lambda и разрезать вдоль стреловидного шва.
  6. Аккуратно вставьте одну руку мелкого кусачек под теменной кости, сохраняя лезвие как можно ближе к нижней поверхности кости без смещения мозга. Безопасные и оторваться теменной кости с боков и затылочной кости кзади, пока мозг не подвергается.
  7. Используйте маленькую лопаточку из нержавеющей стали и поднимите мозг от передней и средней черепной ямки, чтобы разоблачить Преддверно-улитковый нерв (CN VIII). Трансекта нерв, чтобы предотвратить ненужную напряженность на первичных афферентных аксонов, которые непосредственно иннервируют вестибулярные волосковые клетки.
  8. Удалить мозг в целом после перерезки CN VIII.
  9. Обратите внимание на костный лабиринт, содержащий улитку и периферийные вестибулярные органы в средней черепной ямки. Сделайте два небольших разрезов рядом с каждым костного лабиринта и вырезать всю структуру, удерживая переднюю полукруглую канал и потянув позжесоюзником.
  10. Сразу погрузиться вырезали лабиринты в рассекает блюдо с ледяной решение ACSF (как описано в шаге 3.1), непрерывно перфузии с карбогена.
  11. Под стереомикроскопа, нажмите и удерживайте лабиринта улитки и закрепите его на дно сосуда с щипцами.
    1. Используйте прямой тонкий пинцет, чтобы поцарапать небольшое отверстие в указанном выше передней полукруглые канала (SSC) ампулы кости.
    2. Аккуратно увеличить это открытие, достигнув непосредственно под костью и стряхивая наружу от ампулы. Соблюдайте осторожность здесь не нажать щипцами в отверстие и повредить хрупкую перепончатого лабиринта ниже. Продолжайте в том же образом до тех пор, сумочка, передний и боковой ампулы не все подвержены. Если возможно удалить заднюю ампулу также.
  12. Использование тонких щипцов, осторожно поднимите мешочке и мозоли от костного лабиринта, пока они не будут полностью отключены. Где это возможно, провести ихих ассоциированных полукружных каналов, чтобы избежать повреждения чувствительного эпителия. В некоторых случаях, проксимальная часть полукруглой мембранного канала, возможно, потребуется, чтобы отрезать с помощью ножниц радужной оболочки, чтобы освободить ампул от кости.
  13. Надежно понять вестибулярные органы между кончиком пинцета и месте в буфере для лизиса, полученного ранее в шаге 3.2. Аккуратно водоворот щипцы вокруг в буфере для обеспечения вестибулярные органы были отключены от щипцов. Проверьте это дело, принося щипцы под стереомикроскопа.
    1. Винт на крышке микротрубочек и сразу же заморозить образец в жидком азоте.

4. Экстракция РНК и RT-PCR

  1. Следуйте стандартные методы РНК (мРНК) добычи мессенджера в соответствии с инструкциями изготовителя или предпочтительных протоколов лабораторных анализов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: коммерческая комплект, который используется носителей РНК, чтобы помочь изолировать небольшие урожаи мРНК был использован в этомПротокол. Более низкие объемы элюции может быть использован для повышения конечных концентраций мРНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Негативный "нет" фермента управления (НПВ) и "Нет матричной ДНК" управления (NTCS) также должны быть завершены, чтобы обеспечить достоверность наблюдаемых эффектов.
  2. Применение стандартных методов обратной транскрипции мРНК к комплементарной ДНК (кДНК) и амплификации генов-мишеней 21-23.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для сравнения влияния лечения НДК, с Янгом (4 недели) и старше (8 - 9 месяцев) мышей измеряли экспрессию антиоксидантной активности супероксиддисмутазы 1 (СОД-1) у молодых (п = 16) и старше (n = 20) Мыши, которые были NIR-обработке, ложной обработке или NIR-их. Рисунок 2 показывает значительное увеличение β-актина нормированной СОД-1 экспрессии более чем в 2 раза у молодых NIR обработанных животных по сравнению с молодыми ложной обработке животных (р <0,01) и молодых Нир-блокированные животные (р <...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представительства описанные здесь результаты показывают, что краткое транскраниальная доставка БИК светом (90 сек / день в течение 5 дней) достаточно, чтобы поднять уровень антиоксидантной выражение в старых мышей по сравнению с имитацией лечение мышей. В то время как излучаемый тепло может представлять собой источник митохондриальной и / или нейронов активации, как сообщает крысиного вестибулярной афферентов 24 - наши измерения тепла, излучаемого Нир светодиодное устройство было <0,2 ° С в течение 90 сек,...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы выразить признательность д-ра Пола Вайтинга и г-жу Женевьев Фонг за помощь в добыче мРНК и ПЦР, и Гарнетт Пасс и Родни Мемориальный фонд Уильямс за поддержку.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Quantum WARP 10Quantum Devices2070N030-A
Винтовая вершина микротрубочекКачество Научный пластик520-GRD-Q
Кетамин Парнелл, Александрия Австралия
Стандартные ножницыFST14001-12
Хирургические лезвия из углеродистой стали # 22LivingstoneSBLDCL 22
Friedman-Pearson rongeursFST16221-14
СтереомикроскопLeica MicrosystemsA60S
Dumont #5 SF щипцыFST11252-00
Isolate II RNA Micro KitBiolineBIO-52075

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Agrawal, Y., Carey, J. P., Della Santina,, C, C., Schubert, M. C., Minor, L. B. Disorders of balance and vestibular function in US adults: data from the National Health and Nutrition Examination Survey, 2001-2004. Archives of internal medicine. 169, 938-944 (2009).
  2. Bessho, K., et al. Effect of subthreshold infrared laser treatment for drusen regression on macular autofluorescence in patients with age-related macular degeneration. Retina. 25, 981-988 (2005).
  3. Olk, R. J., et al. Therapeutic benefits of infrared (810-nm) diode laser macular grid photocoagulation in prophylactic treatment of nonexudative age-related macular degeneration: two-year results of a randomized pilot study. Ophthalmology. 106, 2082-2090 (1999).
  4. Rodanant, N., et al. Predictors of drusen reduction after subthreshold infrared (810 nm) diode laser macular grid photocoagulation for nonexudative age-related macular degeneration. American journal of ophthalmology. 134, 577-585 (2002).
  5. De Taboada, L., et al. Transcranial laser therapy attenuates amyloid-beta peptide neuropathology in amyloid-beta protein precursor transgenic mice. Journal of Alzheimer's disease : JAD. 23, 521-535 (2011).
  6. Grillo, S. L., Duggett, N. A., Ennaceur, A., Chazot, P. L. Non-invasive infra-red therapy (1072 nm) reduces beta-amyloid protein levels in the brain of an Alzheimer's disease mouse model. TASTPM. Journal of photochemistry and photobiology. B, Biology. 123, 13-22 (2013).
  7. Purushothuman, S., Johnstone, D. M., Nandasena, C., Mitrofanis, J., Stone, J. Photobiomodulation with near infrared light mitigates Alzheimer's disease-related pathology in cerebral cortex - evidence from two transgenic mouse models. Alzheimer's researc., & therapy. 6, 2(2014).
  8. Sommer, A. P., et al. 670 nm laser light and EGCG complementarily reduce amyloid-beta aggregates in human neuroblastoma cells: basis for treatment of Alzheimer's disease. Photomedicine and laser surgery. 30, 54-60 (2012).
  9. Moro, C., et al. Photobiomodulation preserves behaviour and midbrain dopaminergic cells from MPTP toxicity: evidence from two mouse strains. BMC neuroscience. 14, 40(2013).
  10. Peoples, C., et al. Photobiomodulation enhances nigral dopaminergic cell survival in a chronic MPTP mouse model of Parkinson's disease. Parkinsonis., & related. 18, 469-476 (2012).
  11. Shaw, V. E., et al. Neuroprotection of midbrain dopaminergic cells in MPTP-treated mice after near-infrared light treatment. The Journal of comparative neurology. 518, 25-40 (2010).
  12. Ying, R., Liang, H. L., Whelan, H. T., Eells, J. T., Wong-Riley, M. T. Pretreatment with near-infrared light via light-emitting diode provides added benefit against rotenone- and MPP+-induced neurotoxicity. Brain research. 1243, 167-173 (2008).
  13. Rajguru, S. M., et al. Infrared photostimulation of the crista ampullaris. The Journal of physiology. 589, 1283-1294 (2011).
  14. Chung, H., et al. The nuts and bolts of low-level laser (light) therapy. Annals of biomedical engineering. 40, 516-533 (2012).
  15. Desmet, K. D., et al. Clinical and experimental applications of NIR-LED photobiomodulation. Photomedicine and laser surgery. 24, 121-128 (2006).
  16. Huang, Y. Y., Chen, A. C., Carroll, J. D., Hamblin, M. R. Biphasic dose response in low level light therapy. Dose-response : a publication of International Hormesis Society. 7, 358-383 (2009).
  17. Rojas, J. C., Gonzalez-Lima, F. Low-level light therapy of the eye and brain. Eye and brain. 3, 49-67 (2011).
  18. Vranceanu, F., et al. Striated organelle, a cytoskeletal structure positioned to modulate hair-cell transduction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4473-4478 (2012).
  19. Johnson, K. R., et al. Separate and combined effects of Sod1 and Cdh23 mutations on age-related hearing loss and cochlear pathology in C57BL/6J mice. Hearing research. 268, 85-92 (2010).
  20. Tung, V. W., Di Marco, S., Lim, R., Brichta, A. M., Camp, A. J. An isolated semi-intact preparation of the mouse vestibular sensory epithelium for electrophysiology and high-resolution two-photon microscopy. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50471(2013).
  21. Kirby, J., Menzies, F. M., Cookson, M. R., Bushby, K., Shaw, P. J. Differential gene expression in a cell culture model of SOD1-related familial motor neurone disease. Human molecular genetics. 11, 2061-2075 (2002).
  22. Parry, S. N., Ellis, N., Li, Z., Maitz, P., Witting, P. K. Myoglobin induces oxidative stress and decreases endocytosis and monolayer permissiveness in cultured kidney epithelial cells without affecting viability. Kidney and Blood Pressure Research. 31, 16-28 (2008).
  23. Saee-Rad, S., et al. Analysis of superoxide dismutase 1, dual-specificity phosphatase 1, and transforming growth factor, beta 1 genes expression in keratoconic and non-keratoconic corneas. Molecular vision. 19, 2501-2507 (2013).
  24. Albert, E. S., et al. TRPV4 channels mediate the infrared laser-evoked response in sensory neurons. Journal of neurophysiology. 107, 3227-3234 (2012).
  25. Moro, C., et al. Photobiomodulation inside the brain: a novel method of applying near-infrared light intracranially and its impact on dopaminergic cell survival in MPTP-treated mice. Journal of neuroscience. 120, 670-683 (2014).
  26. Moreno, L. E., et al. Infrared neural stimulation: beam path in the guinea pig cochlea. Hearing research. 282, 289-302 (2011).
  27. Curthoys, I. S. A red thread as a guide in the vestibular labyrinth. The Journal of physiology. 589, 1241-1241 (2011).
  28. Chakrabarti, S., et al. Mitochondrial Dysfunction during Brain Aging: Role of Oxidative Stress and Modulation by Antioxidant Supplementation. Aging and disease. 2, 242-256 (2011).
  29. Petrosillo, G., De Benedictis, V., Ruggiero, F. M., Paradies, G. Decline in cytochrome c oxidase activity in rat-brain mitochondria with aging. Role of peroxidized cardiolipin and beneficial effect of melatonin. Journal of bioenergetics and biomembranes. 45, 431-440 (2013).
  30. Zhu, H., Sun, A., Zou, Y., Ge, J. Inducible metabolic adaptation promotes mesenchymal stem cell therapy for ischemia: a hypoxia-induced and glycogen-based energy prestorage strategy. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 34, 870-876 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

SOD 1

Похожие статьи