Простой метод ДНК флуоресценции На месте Гибридизация, чтобы раздавил хромосом

Краткое содержание

Здесь мы представляем простой метод проведения флуоресцентной гибридизации ДНК in situ (DNA ISH) для визуализации повторяющихся гетерохроматических последовательностей на хромосомах, установленных на слайде. Метод требует минимального количества реагентов и универсален для использования с короткими или длинными зондами, различными тканями, а также для детектирования с помощью флуоресцентных или нефлуоресцентных сигналов.

Аннотация

ДНК гибридизация (ДНК МОГ) является широко используемым методом для отображения последовательности в конкретных регионах хромосом. Этот подход особенно эффективен при картографических высоко повторяющихся последовательностей в гетерохроматических регионах, где вычислительные подходы сталкиваются с непреодолимыми трудностями. Здесь мы опишем обтекаемый протокол для ДНК ISH, что обходит формамида моет, которые являются стандартными шаги в других протоколах ДНК ISH. Наш протокол оптимизирован для гибридизации с зондами коротких одиночных нитей ДНК, которые несут флуоресцентные красители, которые эффективно отмечают повторяющиеся последовательности ДНК в пределах гетерохроматических участков хромосом в целом ряде различных типов насекомых ткани. Тем не менее, приложения могут быть расширены для использования с большими зондов и визуализации последовательностей одна копия (не повторяющихся) ДНК. Мы демонстрируем этот метод отображения нескольких различных повторяющихся последовательностей раздавленных хромосом дрозофилы нервные клетки и Nasoniavitripennis сперматоциты. Мы показываем образцы гибридизации как для небольших, коммерчески синтезируемых зондов и для большого зонда для сравнения. Эта процедура использует простые лабораторные принадлежности и реагенты, и идеально подходит для исследователей, которые имеют небольшой опыт работы с выполнением ДНК ISH.

Введение

ДНК гибридизация (ДНК МОГ) является широко используемым методом для отображения последовательности в конкретных регионах хромосом. Зондов для отдельных регионов копию в эухроматином могут быть получены через нескольких подходов, в том числе ник-трансляции или в конце маркировки сортового проката ДНК ^1,2 и включение deoxygenin (DIG) -attached нуклеотидов и их признания в рамках широкого спектра Группа-сопряженных антитела ^1-3. Визуализация эухроматиновых последовательностей в нескольких или одного числа копий требует использования либо один большой зондов с высокой удельной активностью или коктейль из нескольких меньших зондов, которые в совокупности повышают сигнал.

В отличие от этого, часто повторяющихся последовательностей, обнаруженных в гетерохроматина, такие как спутниковые ДНК, являются легкой мишенью для ДНК ISH, потому что они нормально существовать как десятки и тысячи повторов, сгруппированных в отдельных регионах хромосом называются блоками. Мобильных элементов может бытьнайти в большом числе копий на отдельных хромосомные локусы ^2. В этих случаях, одиночные датчики с низкой удельной активностью могут эффективно маркировать гетерохроматиновые последовательности из-за их гибридизации в нескольких местах. Зонды для повторяющихся последовательностей могут быть синтезированы в продаже в виде коротких олигонуклеотидов (30-50 п.н.) и химически конъюгированный с любым из нескольких различных флуоресцентных групп. Отображение повторяющихся последовательностей внутри гетерохроматина с помощью генома секвенирования технологий затруднено из-за проблем, возникших в здании лесов на территории очень повторяющихся спутниковых блоков ^4-6,7. В настоящее время ISH выступает в качестве наиболее эффективного способа отображения этих последовательностей на уровне суб-хромосомы. Эта стратегия имеет важное значение для отображения большого числа повторяющихся последовательностей, которые вскрываются в текущих генома и транскриптомный секвенирования исследований.

Эффективность и простота отображения повторяющихся последовательностей на слайд-смонтирован хромосом будет GREатлы усиливается упрощенной протокола ДНК ISH. Например, существующие протоколы для ДНК ISH включать в себя несколько стирок гибридизован- тканей в формамиде решения ^2,8, добавляя тем самым существенный вклад в нужном для последовательностей отображения, а также получения больших количеств химических отходов этой дорогостоящей реагента. Здесь мы опишем пересмотренный метод ДНК ISH, что обходит необходимость формамидных моет и использует основную лабораторного оборудования и реагентов. Этот метод был первоначально разработан для быстрого отображения часто повторяющимися последовательностями ДНК в гетерохроматине дрозофилы личинок нейробластах с помощью коммерчески синтезируемых олигонуклеотидов, которые сопряженные с флуоресценции красителей. Тем не менее, этот способ также работает для отображения повторяющихся последовательностей с помощью более крупных зондов, синтезированных с помощью других средств ^9,10 и через нескольких различных тканей и хромосомных типов. Кроме того, этот метод может быть использован для отображения эухроматиновые последовательности, используя больше или мнле, коротких зондов в пределах эухроматиновые интерес последовательности.

Протокол

1. рассечения тканей и фиксация (60 мин)

1. Для мозга дрозофилы, место ^3-й возрастной стадии личинки в капле 1x PBS (фосфатный буферный солевой раствор). Выберите большой ^3-й возрастной стадии личинки, которые активно ползать из флаконах или бутылках, которые не переполнены.
   1. Используйте один ультратонкий пинцет пару, чтобы схватить рот крючки и еще пару пинцет, чтобы захватить 2/3 вниз длины тела (рис 1а, б). Аккуратно потяните рот крючки, чтобы разоблачить мозга, вентральной ганглии, слюнных желез и часть личинок желудочно-кишечного тракта. Используйте пинцет, чтобы отделить мозга и вентральный ганглиев (рис 1а, б) из других тканей и место в капле 1x PBT (фосфатный буферный физиологический раствор, содержащий твин) на пластиковой чашку Петри.
2. Для Nasonia яичка вскрытия, выберите мужской 3-дневных куколки (желтый тела с красными глазами). Мужчина Nasonia имеют небольшие длины крыла площадку по отношению к Females во время стадии куколки (рис 1в).
   1. Держите куколки в верхней части живота у грудного отдела с одним пинцет пары, и, используя другую пинцет пару, возьмите очень дистальный конец живот и вытащить слезоточивый каплевидные яички (они будут окружены жира орган, который может быть слегка встряхивают прочь; Рисунок 1D). Снять любые внешние части тела от семенников, которые будут препятствовать надлежащей выжимании, и место в капле 1x PBT на пластиковой чашку Петри.
3. Для каждого слайда, анализировать в общей сложности четыре или пять образцов ткани (т.е.., Drosophila личиночных мозги или Nasonia яичек).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Более пяти образцов приведет к перенаселенности ядер и хромосом.
4. При желании, для достижения некоторого разделения сестринских хроматид в эухроматиновых регионов митотических хромосом, лечения ткани с гипотонического раствора: передать мозги от 1x PBT к падению 0,5% цитрата натрия в течение 5-10 (не более 10) мин.
   Примечание: Колхицин (ингибитор митотической) могут быть полезны для увеличения числа митозов на стадии метафазы ^11. Тем не менее, его использование является необходимым, если очень большой здоровый личинки используются, и даже нежелательно, потому что это может негативно повлиять на разрешение хромосом, распространение и морфология.
5. Поместите каплю (~ 20 мкл) фиксирующего раствора (2,5% параформальдегида в 45% -ной уксусной кислоты) на поверхности чистой Sigmacote обработанной покровным.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, фиксирующий решение свежими каждый день использования. Фиксирующие растворы, начиная от 1.8-3.7% параформальдегида в 45% -ной уксусной кислоты дает наилучшие результаты для рыбы. Использование других мозгов или яички ткани, или адаптации этого протокола для иммуно-FISH может потребовать экспериментировать с различными фиксаторами (для списка различных фиксаторов, см ^12).
6. Тщательно передачи каждого образца ткани из рассекает буфера (1x PBT) в закрепляющего капли с ультрадисперсных пинцетом, минимизациюЗин передачу рассекает буфера в закрепляющего раствора. Поместите образцы ткани таким образом, чтобы они равномерно разнесены друг от друга в пределах фиксирующего капли. Инкубируйте ткани в фиксаторе в течение 4 мин при комнатной температуре.
7. Осторожно положите поли-лизин покрытием слайд лицевой стороной вниз на ткани и крышкой скольжения. Не давить на данный момент, но вместо того, чтобы позволить два контактировать слегка так, что покровное стекло прилипает на нижней стороне ползуна. Обратить слайд, чтобы покровное сверху.
8. Бутерброд скольжения слайд / ткани / покрытие внутри сложенный листок фильтровальной бумаги. На ровной поверхности, используя большой палец, нажмите очень твердо вниз на положении непосредственно над покровным. Будьте осторожны, чтобы избежать бокового скольжения покровного стекла (это может привести к размытию ткани).
9. Погрузитесь слайдов / ткани / крышка скольжения в жидком азоте (см аппарат в фиг.1Е, F), и дайте постоять, пока Азот не прекращает кипеть (больше IS FINE). Удалить слайд и сразу обрывать покровное со свежим лезвием бритвы, щелкая угол покровным в восходящем направлении (не поцарапать фиксированной ткани с бритвой).
   1. Предварительное охлаждение слайд / ткани / покровное на блоке сухого льда, крышка ошибиться, в течение 1-2 мин до погружения в жидкий азот поможет предотвратить слайды из трещин.
10. Сразу же место слайд с ткани в банку Коплин заполнены на 100% этанола при комнатной температуре и дать постоять в течение не менее 5 мин (это время может быть дольше, если необходимо).
    Примечание: Холодный 100% этанола и может быть использован.
11. Удалить слайд с тканью, фитиль от избытка этанола с Kimwipe (не касаясь фиксированной ткани), и оставить слайд высохнуть на воздухе в течение 1 часа.
    1. Перейдем непосредственно к шагу 2 или хранения слайдов сухие в условиях низкой влажности воздуха или в высыхании камеры в течение нескольких недель до даже месяцев, прежде чем выполнять гибридизации.

Рисунок 1: () ^3-й возрастной стадии Drosophila личинка (справа), с позиций, указанных для того, где захватить рот крючки (обозначается *) и 2/3 пути вниз личинок разбираются мозги; (Слева) схематическое изображение личинки в одной и той же стадии развития, изображающие относительное положение мозга в личиночной головы. (B) мозга и ганглии вентральной рассекали от ^3-й возрастной стадии личинки Drosophila (справа) и схематическое изображение этом ткани (слева). (C) 3-дневных Nasonia куколки в желтое тело-красный этапе полета. (D) пара семенников расчлененный от 3-дневного возраста Nasonia мужской куколки (справа) с позиций указывает, где захватить куколки на заднем живота (обозначается *) и на середине тела; (Слева) схематическое изображение мужского и женского пола былр куколки; мужчина куколки можно отличить по крыльев, которые не распространялись за сагиттальной профиля (черная стрелка), в отличие от женщин, у которых крылья, которые расширяют мимо профиля; относительное положение пары семенников показано в мужском куколки. (Е) Устройство-строка скрепки-метода и (F), используемых для погружения слайдов в сосуде с жидким азотом. Несколько строк степлеры могут быть использованы для одновременного погружения несколько слайдов.

2. В гибридизация (30 мин на 1 день, 1 час, 2,5 часа для длинных зондов-2 в день)

1. Добавить 1 мкл (100 нг) от каждого датчика к 20 мкл буфера для гибридизации 1.1x. Внесите зонд / гибридизации буфер на поверхности неподвижного ткани (не прикасаясь к ткани).
2. Осторожно положите покровное непосредственно на буфер зонд / гибридизации, убедившись, что покровное сосредоточена непосредственно на ткани. Буфер должен перейти на гоэлектронной внешний край покровного стекла, не оставляя воздушных пузырей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: мелкие пузырьки, которые не контактируют ткани не представляют никаких проблем в порядок. Удалить большие пузыри, осторожно поднимая угол скольжения крышкой и тщательно положив его обратно на слайде.
3. Поместите листок слайд / ткани / крышка на поверхности блока предварительно нагревают до 95 ° C (крышка ошибиться). Обложка с большой кусок алюминиевой фольги, чтобы предотвратить воздействие света. Пусть слайд инкубировать при 95 ° С в течение 5 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: типичный тепловой блок с отверстиями для труб можно перевернуть, чтобы обеспечить плоскую поверхность, на которой можно разместить слайд / ткань / покровное.
4. Удалить слайд, позволяя ему немного остыть, пока он не нагреется. Тщательно оберните кусок натянутой парафильмом вокруг покровным, чтобы запечатать жидкость под ним.
5. Поместите запечатанный слайд внутри камеры влажности и помещают в камеру в инкубатор, предварительно нагретую до 30 ° C. Инкубируют при 30 ° С в течение 4 ч в течение ночи.
   1. Создать камеру влажности из пустого ящика наконечника или закрытой крышкой Tupperware контейнер с влажными Kimwipes или бумажными полотенцами, размещенных в нижней части.
      Примечание: одноцепочечной ДНК олиго зондов были разработаны, чтобы быть 28-33 основы для достижения теоретическую температуру плавления (Т _м) 45-47 ° C. Эти длины и _т и диапазоны отражают тот факт, что многие повторяющиеся последовательности, что мы изучили находятся на богатых и, следовательно, имеют очень низкое содержание GC. Более длинные зонды, скорее всего, имеют более высокие _т значений Т; это может привести к более высокой фоновой гибридизации при стандартной температуре гибридизации 30 ° С. Таким образом, некоторые Устранение неполадок при температуре гибридизации могут быть необходимы для достижения наилучших результатов. Чтобы найти лучший температура гибридизации, увеличение (или уменьшение) температуры на 5 ° С, постепенно.
6. Осторожно снимите парафильм от понижения, а затем осторожно снимите крышку скольжения, медленно поднимая один угол. ВашингтонSH слайд-три раза за 15 минут каждый Стирать в 0.1x SSC буфера. Накройте банку Коплин с алюминиевой фольгой во время мытья, чтобы свести к минимуму воздействие света.
7. Если вы не используете длинный биотинили- зонд, перейдите к шагу 2.8.
   1. При использовании долго биотинилированного зонда, высушите область вокруг ткани с Kimwipe, будьте осторожны, чтобы не прикоснуться к самой ткани. Поместите 100 мкл блокирующего раствора на ткани и покрыть осторожно покровное, заботясь, чтобы избежать прилипания пузырьков. Обертка скользить по покровным парафильмом и место при 37 ° С в течение 30 мин.
   2. Осторожно снимите покровное и промокните вокруг ткани с Kimwipe. Внесите 100 мкл родамина-авидин разбавленный 1: 1000 в SBT по ткани и крышка мягко, с покровным, заботясь, чтобы избежать захвата пузырьков. Обертка скользить по покровным парафильмом и место при 37 ° С в течение 30 мин.
   3. Осторожно снимите покровное и мыть Слайд 3 раза в течение 5 минут в каждом из 4-кратным получателями, а затем3 раза по 5 минут в каждом 0.1x SSC.
      Примечание: Слайды можно мыть в течение более длительных периодов времени.
8. Удалить слайд и пятно вокруг ткани с сухой Kimwipe, чтобы удалить лишнюю буфера (не прикасаясь к ткани). Разместите сторону слайд ткани в темном месте в течение 10-15 мин или до влажности полностью рассеивается.
9. Внесите 11 мкл Vectashield монтажной среды (с 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол-DAPI) на ткани. Аккуратно положите чистую покровным (не обработанный Sigmacote) непосредственно над центром монтажного среды и ткани. Монтажный среда должна мигрируют медленнее наружу по направлению к краям покровным стеклом.
   Примечание: Если монтажные среднего не достигает край покровным стеклом со всех сторон, то дополнительный 1-2 мкл монтажной среды могут быть применены к одной позиции на краю покровного стекла, чтобы заполнить необходимого объема. В этом случае, убедитесь, чтобы вытереть излишки среды из поверхности скольжения доуплотнение.
10. Печать края покровного стекла с лаком для ногтей. Избегайте красить лак для ногтей по образцу ткани.
11. Поместите слайд в вертикальном положении в темном месте и не позволяйте лак для ногтей сухой, пока полностью трудно (как правило, 30 мин и более). В этот момент, изображения ткани или хранить при -20 ° С в течение до 1 недели для последующего визуализации.

Буфер / Рецепты Solution

10x PBS

• 80 г NaCl
• 2,0 г KCl
• 14,4 г Na ₂ HPO ₄
• 2,4 г KH ₂ PO ₄
• рН до 7,4, H ₂ O до 1 л

1x PBT

• 5 мл 10x PBS
• 45 мл Н ₂ О
• 0,1% Tween 20

20x SSC

• 175,3 г NaCl
• 88,2 г цитрата натрия
• в 800 мл H ₂ O
• рН до 7, H ₂ O до 1 л

4x SSCT

• 200 мл 20x SSC
• 799 мл H ₂ O
• 0,1% Tween 20

0,1 x SSC

• 5 мл 20x SSC
• 995 мл Н ₂ О

Гибридизация смеси (20 мкл; редактировался ¹¹⁾

• 10 мкл формамида
• 4 мкл 50% сульфата декстрана
• 2 мкл 20x SSC
• 4 мкл Н ₂ О

SBT ⁸ (10 мл)

• 2 мл 20x SSC
• 0,01 г бычьего сывороточного альбумина (БСА)
• 10 мкл Tween 20
• 7,9 мл H ₂ O

Блокирование раствор ⁸ (10 мл)

• 0,3 г BSA
• 10 мкл Tween 20
• 2 мл 20x SSC
• 8 мл H ₂ O

Фиксирующий раствор с параформальдегидом (1 мл)

• 393.75 мкл H ₂ O (добавить воду первый)
• 450 мкл ледяной уксусной кислоты
• 156.25 мкл 16% параформальдегид

Результаты

Чтобы продемонстрировать этот метод, мы гибридизовали набор небольших коммерчески синтезированных олигонуклеотидов, которые были химически модифицированы с люминесцентными конъюгатов (рисунок 2) и больше биотинилированного зонда (производится через нику перевода продукта ПЦР; фиг.2В), чтобы хромосом из нескольких различных тканей типа (таблица 1). Целевые последовательности включены спутниковые повторы, расположенные в прицентромерных (гетерохроматических) областях мито...

Обсуждение

ДНК ISH часто используется для отображения специфических последовательностей в хромосомах. Мы описали простой метод ДНК ISH оптимизированный для большое количество копий, гетерохроматических последовательностей. Вместо того чтобы использовать для промывки в растворе формамида, который является требованием в других существующих протоколов ISH ДНК, мы размещаем ткани-слайдов непосредственно на предварительно нагревают блока для денатурации ДНК. Этот метод обходит использование больших количеств формамида. Один важный шаг ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Предметные стекла с покрытием из поли-L-лизина (также можно использовать обычные предметные стекла)	Sigma Aldrich
(5 калибр)	Защитные стекла Dumont
22 x 22 мм	Fisher		Sigmacote путем погружения в течение 15 секунд, промокания насухо и стирания всех следов Sigmacote, чтобы защитное покрытие стало прозрачным
Sigmacote
			75 - 150 мм
Парафиновая бумага
Нагревательный блок с термометром
Сухой инкубатор
Лезвия
Влажностная камера			пустая коробка для наконечника пипетки или посуда Tupperware, выстланная смоченными бумажными полотенцами или
баночками			со скользящими пазами
Алюминиевая фольга
Пастеровские
1,5 мл микропипетки
Лак			прозрачный или цветной
P20 микропипетки и пластиковые наконечники
Скрепки			20 - 25 стандартных металлических скрепок, соединенных в форму chain
Реактивы
16% ЭМ класс параформальдегид	Электронная микроскопия Реактивы
Уксусная кислота	Сигма
Жидкий азот
100% этанол, химический <
Длинный биотинилированный зонд	Инвитроген; Альтернативные этапы 2.7.1-2.7.3		например, ник переведен и биотинилирован с помощью BioNick от Invitrogen
Rhodamine-Avidin	Roche; Альтернативные шаги 2.7.1-2.7.3		для обнаружения длинного биотинилированного зонда
Буфер для гибридизации	Рецепт выше
4x	SSCT Рецепт выше		цитрата солевого раствора + Tween
0,1x SSC	Рецепт выше		раствора блокирующего раствора цитрата натрия
	Рецепт выше
			SSC, бычий сывороточный альбумин, 1x
PBT	Рецепт выше		фосфатно-солевого буфера + Tween
1x PBS			фосфатно-солевой буферный
гипотонический раствор			0,5% цитрат натрия в H2O
формамид	Sigma Aldrich
Vectashield монтажная среда с DAPI	Vector Лаборатории