Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Электропорация функциональных бактериальных эффекторов в клетках млекопитающих

9.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52296

⸱

19 января 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biological Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory, 2Environmental Molecular Science Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory, 3Structural Proteomics Group, Ontario Center for Structural Proteomics, University of Toronto, 4Center for Bioproducts and Bioenergy, Washington State University

В этой статье

Краткое содержание

Электропорация была использована для введения очищенных бактериальных эффекторных белков вирулентности непосредственно в живые эукариотические клетки. Локализацию белка контролировали с помощью конфокальной иммунофлуоресцентной микроскопии. Этот метод позволяет проводить исследования транспорта, функции и белок-белковых взаимодействий с использованием активных экзогенных белков, избегая необходимости гетерологичной экспрессии в эукариотических клетках.

Аннотация

Изучение белковых взаимодействий в контексте живых клеток может генерировать критическую информацию о локализации, динамики и взаимодействующих партнеров. Эта информация особенно ценна в контексте хозяин-патоген взаимодействий. Многие белки патогена функционировать в клетках-хозяевах в различных образом, такого как, позволяя уклонения от иммунной системы хозяина и выживание в пределах внутриклеточного среды. Для изучения этих патогенов-белковых взаимодействий клетки-хозяина, несколько подходов обычно используются, в том числе: в естественных условиях заражения штаммом, выражающей с тегами или мутантный белок, или введение генов возбудителя через трансфекции или трансдукции. Каждый из этих подходов имеет свои преимущества и недостатки. Мы стремились средство непосредственно ввести экзогенные белки в клетки. Электропорации обычно используется, чтобы ввести нуклеиновых кислот в клетки, но был значительно реже применяется к белкам, хотя биофизических основанием является точно такой же.Стандартный Электропоратор был использован для введения сродством с метками бактериальных эффекторы в клетки млекопитающих. Человеческие эпителиальные и мыши макрофагов Клетки культивировали традиционными методами, удаленные, и помещают в 0,4 см зазор электропорации кюветы с бактериальным патогеном экзогенного белка, представляющего интерес (например, Salmonella Typhimurium GtgE). После электропорации (0,3 кВ) и короткие (4 ч) периода восстановления, внутриклеточный белок был проверен флуоресцентно маркировки белка с помощью своей аффинной метки и изучения пространственное и временное распределение с помощью конфокальной микроскопии. Электропорации белок также показали, чтобы быть функциональным в клетке и способный правильной субклеточном торговли и белок-белкового взаимодействия. В то время как экзогенные белки, как правило, накапливаются на поверхности клеток, электропорации образцы имели значительное увеличение внутриклеточной концентрации эффектор по отношению к инкубации в покое. Протокол является простым и достаточно быстро, чтобы быть сделано в арarallel моды, что позволяет с высокой пропускной характеристике патогенов белков в клетках-хозяевах, включая субклеточном адресности и функции вирулентности белками.

Введение

Многие грамотрицательные бактерии используют специализированные системы секреции вводить вирулентности связанных белков (так называемые эффекторами) непосредственно в клетках-хозяевах 1-5. Эти эффекторы имеют широкий спектр биологических функций, включая: подавление иммунитета хозяина, изменения цитоскелета, изменение внутриклеточного транспорта и сигнализации, транскрипции изменений, и хозяин протеасомных изменений 6-9. Функции некоторых эффекторов известны, однако хозяева цели и биохимическое действие (ы) и многие другие еще предстоит определить. При сравнении дикого типа и рекомбинантных бактериальных инфекций является действительным подход к изучению внутриклеточных эффекторных механизмов вирулентности, часто выгодно вводить индивидуальный эффектор в клетку-хозяина. Таким образом, простые способы введения и характеризующие бактериальных белков эффекторные в контексте клетках-хозяевах является весьма желательным.

Упрощение анализа экспериментальных Wiй сингл эффектор имеет решающее значение, как и другие эффекторы могут иметь противоположные или избыточных функций. Для достижения этой облегчение, исследователи введенный ранее макромолекул в клетки различных методов, в том числе вирусной трансдукции 10, микроинъекции 11, загрузка путем соскоба 12,13, слияние клеток с химически индуцированного микроинъекции 14, фирменная белок "трансфекции" реагентов 15, фосфат кальция осадков 16 и 17-20 электропорации. Введенные в диапазоне от молекулы нуклеиновых кислот, включая виды ДНК, РНК, и RNAi в белках, клеточных непроницаемый красителей, и антитела для внутриклеточных мишеней 21,22. Некоторые методы имеют ограничения в том числе типа макромолекулы, которые могут быть введены, и конкретные вниз по течению анализ может быть ограничено из-за высокой клеточной токсичности, повреждений механизмами действия, низкой эффективности или эффективности внедрения. Трансфекцию, ofteн-используемый метод для выражения бактериальных генов в клетках млекопитающих, также страдает тем ограничением, что некоторые соответствующие виды клеток-хозяев, таких как макрофаги и первичных клеток, особенно устойчивы к трансфекции. Помимо этого, трудно контролировать уровни бактериального белка, полученного при введении чужеродной ДНК.

Большая работа была создана электропорации нуклеиновых кислот в обоих клетках бактерий и млекопитающих, как общая техника, лаборатории; Однако, проводятся исследования в лучших методов для доставки белков в клетки в физиологических условиях. Отчеты о белковой трансфекции являются перспективными, но требуют дорогостоящих реактивов и оптимизации. Желание ввести потенциально токсичные эффекторы бактериальных в самых разнообразных клеточных мишеней с минимальными затратами привели нас к рассмотрению электропорации в качестве способа для изучения этих белков в естественных условиях.

Белок электропорации 23-25 ​​является встретилHOD ввести белки в живых клетках с помощью electropermeabilization, также известный как электро-трансфекции или электро-инъекции 26. Эта методика использует высокой интенсивности электрических импульсов для создания пор в клеточных мембранах. Эти обратимые поры позволяют макромолекулы, которые обычно исключаются из внутриклеточного пространства проникнуть в клетку. После удаления внешнего электрического поля, мембрана может запечатать, позволяя клетке, чтобы сохранить молекул, которые прошли через поры 27,28.

Стандартный Электропоратор был использован в данном исследовании последовательно ввести бактериальных эффекторы в обоих мыши макрофагами, как клетки и эпителиальные клетки человека. Способ быстрой, эффективной и недорогой, без заметного снижения жизнеспособности клеток. Введенные белки могут быть визуализированы с помощью иммунофлюоресценции микроскопии или используется для функциональных анализов. Это было продемонстрировано использованием зеленого флуоресцентного белка (GFP) в качестве нетоксичного стандарта, а такжедва Salmonella эффекторные белки, SspH1 и GtgE. Мы предлагаем белка электропорации в качестве дополнительного инструмента в репертуаре для изучения бактериальных белков вирулентности и их функций в эукариотических клетках-хозяевах.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. подготовить заранее

  1. Теплый стерильный фосфатный буферный солевой раствор (PBS) до 37 ° С.
  2. Модификация Теплый Дульбекко из среде Игла (DMEM) и минимальной поддерживающей среде (MEM), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 МЕ / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина до 37 ° С. Примечание: Они представляют нормального роста массовой информации (NGM) для сырья и HeLa клеток соответственно.

2. Подготовка клеток

  1. Растут RAW 264.7 клетки 70-90% слияния в НГО.
    1. Поддержание клеток при 37 ° С в увлажненной 95% воздуха / 5% CO 2 атмосфере.
  2. Расти HeLa клеток 70-90% слияния в НГО.
    1. Поддержание клеток при 37 ° С в увлажненной 95% воздуха / 5% CO 2 атмосфере.
  3. Перед коллекции, мыть клеточный монослой один раз стерильной PBS.
  4. Сбор предварительной сливной клетки в стерильные конические пробирки.
    1. Аккуратно очистить RAW клеткис резиновым полицейского в PBS, с повторным пипетированием для разгона клеточные скопления.
    2. Снять HeLa клеток с 0,25% раствором трипсина, пока визуальное обследование не показывает диссоциации с поверхности культуры. Например, можно использовать от 2 до 3 мл на Т-75 колбу. Регулировка громкости соответственно для обеспечения раствор трипсина охватывает всю поверхность роста.
      1. Гасят реакции диссоциации с НГМ, содержащей 10% FBS.
      2. Используйте по крайней мере в два раза объем НГО трипсином, при повторном пипетки, чтобы разогнать клетки агрегаты.
  5. Слегка осаждения клеток центрифугированием при 900 х г в течение 4 мин.
  6. Ресуспендируют в том же объеме, как трипсин / охлаждения раствора с использованием стерильного PBS.
  7. Граф клеток с использованием гемоцитометра или счетчика частиц.
  8. Слегка осаждения клеток центрифугированием при 900 х г в течение 4 мин.
  9. Ресуспендируют в надлежащем объеме PBS в течение 5,5 × 10 6 до 6,0 × 10 6 клеток / мл. Примечание: Например, один Т-75 колбу даст approximленно 7,5 х 10 6 клеток 29.
  10. Держите клеточной суспензии на льду до электропорации.

3. Подготовка к Электропорация

  1. Pre-охлаждающие электропорации кюветы (0,4 см GAP) на льду.
  2. Включите электропорации аппарата и установить напряжение до 0,3 кВ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: емкости и сопротивления не было регулируемых параметров на нашем электропоратора (по умолчанию установлено 10 мкФ и 600 Ω производителем).
  3. Заполните восстановления пластин с НГО и уравновешивают в увлажненной 95% воздуха / 5% СО 2 атмосферы при 37 ° С

4. Электропорация

  1. Поместите 400 мкл клеточной суспензии в предварительно охлажденной кювете и добавить 20 мкг белка, выбранного в кювете (50 мкг / мл).
  2. Флик кювета мягко ~ 10 раз перемешать, не повреждая клетки. Примечание: кювета может быть несколько раз перевернуть, чтобы хорошо перемешать, но не пипетки вверх и вниз или вихрь, чтобы избежать повреждения клеток.
    3. сухим снаружи кюветы с бумажным полотенцем или другой стеклоочистителя, чтобы избежать электрического искрения в электропоратора.
  3. Электропорации образец на 0,3 кВ для 1,5-1,7 мс. Примечание: Это было типично для данного исследования.
  4. Сразу после электропорации Флик кювете осторожно ~ 10 раз тщательно перемешать.

5. Покрытие из клеток

  1. Магазин кювета с электропорации клеток на льду до готовности положите в восстановительных пластин.
  2. Для большинства последующих анализов, мыть клетки 1x с подогретого НГО, чтобы удалить посторонние белок эффекторной.
    1. Удалить ячейки для анализа и приостановить в 3-5 мл NGM.
    2. Гранул клетки центрифугированием при 900 х г в течение 4 мин.
    3. Ресуспендируют в адекватном объеме НГО для нужного размера пластины (например, 2 мл для 35-мм блюдо).
  3. Удалить соответствующее количество клеток для последующего анализа.
    1. Пример 1: тарелка в стеклянным дном посуды для анализа микроскопии.
    2. Пример 2: пластина INTO культуры клеток из пластика для анализа белков, таких как сродства очисток.
  4. Разрешить клетки для восстановления в уравновешенную пластин в увлажненной атмосфере 95% воздуха / 5% CO 2 атмосфере при 37 ° С в течение по меньшей мере 4 ч.

6. микроскопия Анализ

6.1) Фиксация / Иммунофлуоресценции Окрашивание

  1. Вымойте клетки 1x стерильной PBS после 4 ч восстановительного периода.
  2. Исправить клеток в 100% метаноле в течение 2 мин при комнатной температуре. Используйте достаточно метанола чтобы полностью покрыть клетки (например, 2 мл в течение 35 мм блюдо).
  3. Вымойте 3x стерильной PBS.
  4. Проницаемыми клеток с 0,4% Тритон Х-100 в PBS в течение 15 мин. Например, можно использовать 1 мл в течение 35 мм Диаметр пластины в.
    1. Регулировка длины проницаемости и прочности Triton X-100 в соответствии с эпитопом и местоположении целевого белка. Примечание: Наилучшие результаты должны быть определены эмпирически для каждой цели, однако вышеуказанные условия должны быть адекватны для большинства сytosolic целей.
  5. Блок 5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS в течение 1 ч при комнатной температуре. Например, можно использовать 1 мл в течение 35 мм Диаметр пластины в.
  6. Промыть 3 раза ЗФР.
  7. Инкубируйте первичного антитела в антитело связывания раствора (0,1% Тритон Х-100 и 1% BSA в PBS) в течение ночи при 4   ° C при осторожном качания. Например, можно использовать 0,5 мл для 35 мм Диаметр пластины в.
    1. Следуйте рекомендациям изготовителя для разведения антител. Примечание: Например, стрептавидин-связывающий пептид, метка (тэг САД) антитела были использованы в отношении 1: 1000 разведении, в то время как антитела PKN1 был использован в количестве от 1: 200 разбавлении.
  8. Промыть 4x с PBS.
  9. Инкубируют при соответствующей флуоресцентно конъюгированного второго антитела в антитело связывания раствора в течение 1 ч при комнатной температуре, в защищенном от света.
    1. Например, можно использовать Alexa 488 или Alexa 647 в течение 1 ч при комнатной температуре.
      1. Следуйте рекомендациям производителя по муравьяibody разбавления. (Например, приблизительно от 1: 1000 в данном исследовании).
    2. Добавить другие загрязнения при необходимости, например, 5 мкМ зародышей пшеницы agglutinnin (WGA), конъюгированный с Alexa 647 или DAPI в соответствии с рекомендациями производителя, в течение 1 ч при комнатной температуре.
  10. Промыть 5x с PBS и хранить при 4 ° С, не защищены от света до готовности к изображению.

6.2) конфокальной микроскопии и анализа изображений

  1. Образцы изображение на перевернутой конфокальной микроскопии с использованием 63x нефти погружения цели.
    1. Изображение зеленый канал при помощи 488nm линии аргонового лазера, с излучением полосы пропускания между 492-542 нм.
    2. Изображение красного канала с помощью диодного лазера 633 нм, с выделением полосы пропускания между 640-718 нм.
    3. Изображение синий канал, используя лазерный диод 405 нм, с выделением полосы пропускания между 407-453 нм.
    4. Убедитесь, что для канала множественного Z-стеки покрытия полноту сотовой объеме.
  2. Изображения процесса с соответствующим программным обеспечением для обработки изображений.

7. Affinity Очистка

  1. Промыть электропорации клетки в два раза с 4 ° C PBS, после 4 ч восстановительного периода.
  2. Lyse с ~ 1,0 мл буфера для лизиса (1% Тритон Х-100 с коктейлем ингибиторов протеаз и ингибитора фосфатазы в PBS) на льду. Используйте ингибиторы соответствии с инструкциями производителя. Примечание: Например, оба фосфатазы и ингибиторы протеазы, использованные в данном исследовании, были поставлены на 100х, но и другие препараты должны работать одинаково хорошо.
  3. Оперативно очистить клетки с резиновым полицейского и собирать в конических труб.
  4. Lyse энергичным встряхиванием и ультразвуком. Примечание: Другие способы лизиса может работать одинаково хорошо, но эффективность нужно будет определена эмпирически относительно пригодности требований анализа.
    1. Разрушать ультразвуком 3 х 30 сек с прерывистым вортексе.
  5. Центрифуга при 10000 х г в течение 10 мин при 4 ° С для сбораклеточные обломки и нерастворимые агрегаты; сохранить супернатант.
  6. Зерноуборочный равные объемы (~ 1,0 мл) электропорации клеточного лизата с 50 мкл стрептавидин агарозном смолы суспензии при 4 ° С в течение ночи с конца поверх торцевой вращения. Примечание: Эта смола захватывает электропорации белок (и связанных с ними комплексов) через его стрептавидин-связывающий пептид аффинной метки.
  7. Центрифуга при 2500 х г в течение 2 мин и отбросить супернатант.
  8. Мыть два раза с 40 объемами слоя (~ 1 мл) PBS.
  9. Добавить 30 мкл 4х буфера для нанесения LDS (141 мМ Трис-основание, 2% СПД, 10% глицерина, 0,51 мМ ЭДТА, 0,22 мМ СЕРВА синий G, 0,175 мМ фенола красного, рН 8,5), 20 мкл DIH 2 O и 1 мкл 0,5 М трис (2-карбоксиэтил) фосфин (ТСЕР), что позволяет в течение некоторого объема оставаться в шариков.
  10. Нагревают при 95 ° С в течение 10 мин и охладили на льду.
  11. Спин> 10000 мкг при 4 ° С в течение 5 мин.
  12. Соберите супернатант.
  13. Выполните вестерн-блот, используя соответствующие антитела Примечание: ОнRe, анти-PKN1 первичное антитело используется.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В качестве первого доказательства концепции, очищенный зеленый флуоресцентный белок был успешно введены в клетки млекопитающих с использованием электропорации. GFP, приблизительное 27 кДа белок, молекулярная масса обычно вводится в клетках млекопитающих (как правило, выражается с плазмидной ДНК), в качестве молекулярной биологии инструмента без значительной клеточной токсичности. HeLa клетки инкубировали (фиг.1А) или электропорации (фиг.1В) с 25 мкг / мл GFP, а затем иммунофлюоресценции...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Секретируемые эффекторы от патогенных бактерий развивались функционировать в среде клетки-хозяина, и, таким образом, было бы полезно, чтобы изучить их на месте в узле. Введение конкретных эффекторов интерес в клетки-хозяева позволяет соответствующим патогеном-хозяева взаимодействия должны быть изучены в изоляции, без вмешательства со стороны других бактериальных белков. Цель в том, чтобы исследовать электропорации в качестве средства для внедрения бактериальных эффекторных белков в эукариотических клетках-хозяе...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана NIGMS, Национальными институтами здравоохранения (GM094623). Значительная часть этой работы была выполнена в Лаборатории молекулярных наук об окружающей среде, национальном научном объекте Министерства энергетики США/КОБ, расположенном в Тихоокеанской северо-западной национальной лаборатории (PNNL). PNNL эксплуатируется для Министерства энергетики компанией Battelle по контракту DE-AC05-76RLO1830.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,25% раствор трипсина-ЭДТАCellgro25-050-Cl
0,4 см Одноразовые электропорационные кюветыBio-Rad165-2088
100% метаноллюбойн/длегковоспламеняющийся, токсичный
бычий сывороточный альбумин (БСА)Sigma-AldrichA4919
Аппарат для подсчета клеток - гемоцитометр или счетчик КоултераBeckman CoulterМодель Z1
Инкубатор для клеточных культурлюбойн/дувлажненный 95% воздуха/5% CO<суб>2 атмосферы при 37° С 
Пластик для клеточных культурЛюбыен/дКолбы/планшеты для клеточных культур, пипетки, трубки, резиновые полицейские
Модификация Орла Дульбекко s Средний (DMEM)Cellgro10-013Теплый до 37 °°; С 
ЭлектропораторBio-RadE. coli Pulser
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Cellgro35-016-CV
Флуоресцентный конфокальный микроскоп Модель Ziess  LSM 710 
Стеклянные донные тарелки для микроскопииWilco WellsHBSt-3522
HALT Коктейль ингибитора протеазыПирс78430Коррозионный, токсичный
HeLa Cell LineATCCATCC CCL-2
LDS 4X Загрузочный буферInvitrogenNP0007
Minimal Essential Medium (MEM) Cellgro10-010Теплый до 37 градусов; С 
Другие флуоресцентные красители (WGA, DAPI) в сочетании с реагентом против выцветанияЛюбойN/A Пенициллин
/стрептомицинCellgro30-002-Cl
RAW 264.7 Клеточная линияATCCTIB-71
Первичное антитело против интересующей мишениЛюбоеN/A
вторичное антитело, конъюгированное с флуорофоромЛюбойN/A
Фосфатный буферный физиологический растворлюбойн/дохладить до 4 °°С; С 
Стерильный фосфатный буферный физиологический растворлюбойн/дтеплый до 37 °°; С 
[header]
Суспензия смолы Streptavidin Agarose Настольная20353
способная принимать конические трубки (предпочтительно качающееся ведро)Любойн/д
TCEPSigma-Aldrich646547коррозионный, токсичный
Triton X-100Sigma-AldrichT8585раздражающий, токсичный
центрифуга Pierce ,

Ссылки

  1. Mota, L. J., Cornelis, G. R. The bacterial injection kit: type III secretion systems. Annals of Medicine. 37, 234-249 (2005).
  2. Galan, J. E., Collmer, A. Type III secretion machines: bacterial devices for protein delivery into host cells. Science. 284, 1322-1328 (1999).
  3. Hueck, C. J. Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 62, 379-433 (1998).
  4. Cornelis, G. R., Van Gijsegem, F. Assembly and function of type III secretory systems. Annual Review of Microbiology. 54, 735-774 (2000).
  5. He, S. Y. Type III protein secretion systems in plant and animal pathogenic bacteria. Annual Review of Phytopathology. 36, 363-392 (1998).
  6. Dean, P. Functional domains and motifs of bacterial type III effector proteins and their roles in infection. FEMS Microbiology Reviews. 35, 1100-1125 (2011).
  7. Espinosa, A., Alfano, J. R. Disabling surveillance: bacterial type III secretion system effectors that suppress innate immunity. Cellular Microbiology. 6, 1027-1040 (2004).
  8. Orchard, R. C., Alto, N. M. Mimicking GEFs: a common theme for bacterial pathogens. Cellular Microbiology. 14, 10-18 (2012).
  9. Galan, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5, 571-579 (2009).
  10. Ellis, B. L., et al. A survey of ex vivo/in vitro transduction efficiency of mammalian primary cells and cell lines with Nine natural adeno-associated virus (AAV1-9) and one engineered adeno-associated virus serotype. Virology Journal. 10, 74(2013).
  11. Sreelatha, A., et al. Vibrio effector protein, VopQ, forms a lysosomal gated channel that disrupts host ion homeostasis and autophagic flux. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 11559-11564 (2013).
  12. McNeil, P. L., Murphy, R. F., Lanni, F., Taylor, D. L. A method for incorporating macromolecules into adherent cells. The Journal of Cell Biology. 98, 1556-1564 (1984).
  13. Lafon, M., Lafage, M. Antiviral activity of monoclonal antibodies specific for the internal proteins N and NS of rabies virus. The Journal of General Virology. 68 (Pt. 12), 3113-3123 (1987).
  14. Kriegler, M. P., Livingston, D. M. Chemically facilitated microinjection of proteins into intact monolayers of tissue culture cells). Somatic Cell Genetics. 3, 603-610 (1977).
  15. Nossa, C. W., et al. Activation of the abundant nuclear factor poly(ADP-ribose) polymerase-1 by Helicobacter pylori. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19998-20003 (2009).
  16. Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: Optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Research. 24, 596-601 (1996).
  17. Winegar, R. A., Phillips, J. W., Youngblom, J. H., Morgan, W. F. Cell Electroporation Is a Highly Efficient Method for Introducing Restriction Endonucleases into Cells. Mutation Research. 225, 49-53 (1989).
  18. Cortes, F., Ortiz, T. Chromosome damage induced by restriction endonucleases recognizing thymine-rich DNA sequences in electroporated CHO cells. International Journal of Radiation Biology. 61, 323-328 (1992).
  19. Cortes, F., Ortiz, T. Induction of chromosomal aberrations in the CHO mutant EM9 and its parental line AA8 by EcoRI restriction endonuclease: electroporation experiments. Mutation Research. 246, 221-226 (1991).
  20. Baron, S., Poast, J., Rizzo, D., McFarland, E., Kieff, E. Electroporation of antibodies, DNA, and other macromolecules into cells: a highly efficient method. Journal of Immunological Methods. 242, 115-126 (2000).
  21. Lewis, R. Electroporation edges toward clinic for both gene therapy and drug delivery. Genetic Engineering and Biotechnology News. 17, (1997).
  22. Kotzamanis, G., et al. CFTR expression from a BAC carrying the complete human gene and associated regulatory elements. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13, 2938-2948 (2009).
  23. Chakrabarti, R., Wylie, D. E., Schuster, S. M. Transfer of monoclonal antibodies into mammalian cells by electroporation. The Journal of Biological Chemistry. 264, 15494-15500 (1989).
  24. Graziadei, L., Burfeind, P., Bar-Sagi, D. Introduction of unlabeled proteins into living cells by electroporation and isolation of viable protein-loaded cells using dextran-fluorescein isothiocyanate as a marker for protein uptake. Analytical Biochemistry. 194, 198-203 (1991).
  25. Wilson, A. K., Horwitz, J., De Lanerolle, P. Evaluation of the electroinjection method for introducing proteins into living cells. The American Journal of Physiology. 260, C355-C363 (1991).
  26. Prasanna, G. L., Panda, T. Electroporation: Basic principles, practical considerations and applications in molecular biology. Bioprocess Engineering. 16, 261-264 (1997).
  27. Weaver, J. C., Chizmadzhev, Y. A. Theory of electroporation: A review. Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 41, 135-160 (1996).
  28. Weaver, J. C. Electroporation theory. Concepts and mechanisms. Methods in Molecular Biology. 55, 3-28 (1995).
  29. McAteer, J. A., Douglas, W. H. Monolayer culture techniques. Methods in Enzymology. 58, 132-140 (1979).
  30. Ho, T. D., et al. Identification of GtgE, a novel virulence factor encoded on the Gifsy-2 bacteriophage of Salmonella enterica serovar Typhimurium. Journal of Bacteriology. 184, 5234-5239 (2002).
  31. Niemann, G. S., et al. Discovery of novel secreted virulence factors from Salmonella enterica serovar Typhimurium by proteomic analysis of culture supernatants. Infection and Immunity. 79, 33-43 (2011).
  32. Spano, S., Liu, X., Galan, J. E. Proteolytic targeting of Rab29 by an effector protein distinguishes the intracellular compartments of human-adapted and broad-host Salmonella. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 18418-18423 (2011).
  33. Haraga, A., Miller, S. I. A Salmonella type III secretion effector interacts with the mammalian serine/threonine protein kinase PKN1. Cellular Microbiology. 8, 837-846 (2006).
  34. Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O., et al. Quantitative colocalization analysis of confocal fluorescence microscopy images. Current Protocols in Cell Biology / Editorial Board, Juan S. Bonifacino ... [et al]. 4 (Unit 4.19), (2011).
  35. Kimple, M. E., Sondek, J., et al. Overview of affinity tags for protein purification. Current Protocols in Protein Science / Editorial Board, John E. Coligan ... [et al]. 9 (Unit 9.9), (2004).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Введение в изучение белковконфокальная микроскопиявестерн-блоттингвзаимодействия хозяина и патогенасубклеточная локализациябелок-белковое взаимодействиевысокопроизводительный скрининг
Электропорация функциональных бактериальных эффекторов в клетках млекопитающих
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.