Методическая статья

Выделение и Иммортализация пациента, полученных клеточных линий мышечной биопсии для моделирования заболеваний

DOI:

10.3791/52307

⸱

18 января 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, UT Southwestern Medical Center, 2National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institute of Health, 3Division of Pediatric Pathology, Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical College of Wisconsin, 4Division of Genetics and Genomics, Boston Children's Hospital

В этой статье

Уведомление об исправлении

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает методы выделения живых клеток и первичного культивирования миогенных и фибробластных клеточных линий из мышечной или кожной ткани. Также описана техника иммортализации этих клеточных линий. В целом, эти протоколы представляют собой надежный инструмент для создания и сохранения клеток, полученных от пациента, для последующего применения.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Генерация специфических для пациента клеточных линий представляет собой бесценный инструмент для диагностических или трансляционных исследований, и эти клетки могут быть собраны из ткани кожи или мышечной биопсии, доступной во время диагностического обследования пациента. В этом протоколе мы описываем метод выделения живых клеток из небольшого количества мышечной или кожной ткани для первичной клеточной культуры. Кроме того, мы предлагаем метод иммортализации миогенных клеточных линий и клеточных линий фибробластов из первичных клеток. Как только клеточные линии будут увековечены, может быть достигнуто значительное увеличение количества клеток, полученных от пациентов. Иммортализованные клетки поддаются многим последующим применениям, включая скрининг лекарств и коррекцию генетической мутации in vitro. В целом, эти протоколы представляют собой надежный инструмент для создания и сохранения клеток, полученных от пациента, для последующего применения.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Молекулярная диагностика претерпела значительные изменения за последние 20 лет. Геномная ДНК в настоящее время обычно выделяется из мокроты или мазка из щеки, в то время как в прошлом для этого требовался забор крови. Благодаря быстрому времени выполнения и простоте секвенирования генов, многие мутации заболевания регулярно выявляются без необходимости дополнительного тестирования. В случае диагностики мышечных заболеваний идентификация десятков новых генов за последнее десятилетие, ответственных за мышечную дистрофию или миопатию, резко изменила способы диагностики этих заболеваний. В настоящее время существуют десятки генов, которые были идентифицированы как причины мышечной дистрофии и врожденной миопатии, хотя механизмы, с помощью которых многие из этих генов вызывают заболевание, остаются неясными. В частности, редкие заболевания представляют собой проблему из-за небольшого размера популяции пациентов. Для этих случаев, а также для более распространенных заболеваний крайне желательно создание стабильных инструментов, облегчающих изучение механизма патогенеза и скрининг терапевтических препаратов.

Несмотря на значительный прогресс в диагностике ДНК, биопсия мышц все еще проводится для установления первичного диагноза у многих пациентов, у которых подозревается первичное метаболическое или мышечное заболевание. Когда биопсия мышц необходима, она дает возможность для дополнительного диагностического и исследовательского сбора тканей с минимальным риском дополнительной заболеваемости для пациента. Поскольку существует ряд применений для каждого образца ткани, крайне желательно разработать методы первичного культивирования клеток с использованием хирургической ткани, которые являются простыми, эффективными и требуют минимального количества ткани. Надлежащая сортировка биопсий мышц или кожи необходима для максимальной изоляции первичных клеток от тканей и длительного хранения живого материала. Кроме того, исследования стволовых клеток и скрининг лекарств имеют большие перспективы для разработки методов лечения многих заболеваний с использованием клеточных анализов 3,4.

Здесь мы описываем методы выделения первичных клеток из биопсии мышц или кожи человека. Кроме того, мы включили протокол иммортализации миогенных клеток, который полезен для получения большого количества клеток от человека. Эти клетки могут быть использованы для последующих применений, таких как специализированный скрининг лекарств, которые в противном случае недостижимы при общем небольшом количестве клеток, полученных из первичной ткани.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Протоколы для сбора ткани человека должны быть рассмотрены и одобрены комиссией Институциональная IRB. Коллекция отбрасываются, обезличенной человеческой ткани был одобрен больницы Бостона детей и Brigham и женской больницы IRB комитетов. Способы, описанные ниже, были применены для выделения клеток из миогенными де-определены, отбрасываются ткани. Описанные методы применимы к ткани, собранной из согласие материала пациента.

1. Выделение клеток

  1. Диссоциация мышечной биопсии и очистки миогенных клеток
    1. Предварительно весить 10 см планшета для культуры ткани в культуре ткани капот биологической безопасности, а затем повторно взвешивают пластину, содержащую мышечной биопсии, чтобы рассчитать количество ткани, чтобы быть отделены.
    2. Использование стерильных скальпелей, пропустить через мясорубку мышечной ткани мелко и добавить несколько капель стерильного 1x HBSS, чтобы предотвратить ткани от высыхания.
    3. Добавить 3,5 мл каждого из диКосмических II и коллагеназы D на грамм мышечной ткани переваривается. Внесите фарш ткани и ферментного раствора через стерильный 25 мл пипетки несколько раз. Инкубируют планшет в инкубаторе тканевых культур при 37 ° С с 5% СО 2 в течение 15 мин и переварить ткань до тех пор, пока суспензия легко проходит через стерильный 5 мл пипетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ткани диссоциации обычно достигается путем ферментативного расщепления в 45-90 мин. Пожалуйста, обратитесь к разделу "Представитель Результаты" для получения дополнительной информации.
    4. Добавить 2 объемами стерильной среды роста на диссоциированного ткани, фильтр через 100 мкм сито клеток свыше 50 мл коническую трубку и гранул клеток в течение 10 мин при 329 х г (~ 1100 оборотов в минуту), комнатной температуры. Пожалуйста, обратитесь к таблице Материалы для состава массовой информации.
    5. Ресуспендируют осадок в 1 объеме стерильной среды роста и добавить 7 томов красный раствор лизиса клеток крови. Фильтр раствора через клеточный фильтр 40 мкм, затем гранул тон клеток в течение 10 мин при 329 мкг, комнатной температуры.
    6. Количество клеток в гемоцитометра и ресуспендирования клеток в 1x HBSS 0,5% BSA в концентрации 1 × 10 6 клеток / 100 мкл. Установите в сторону ~ 250000 клеток в одной пробирке, которые будут использоваться в качестве (неокрашенной) управления отрицательным. Отложите дополнительные одноцветных окрашенных управления трубы для пропидийиодидом и для CD56, которые необходимы для правильного стробирования CD56-положительных клеток по FACS сортировки. Пожалуйста, обратитесь к сортировки клеток руководства или проконсультируйтесь с FACS сортировки экспертов основной комплекс для обеспечения надлежащего контроля включены.
    7. Пятно клетки должны быть отсортированы с 5 мкл / 10 6 клеток анти CD56 антител. Выдержите все образцы (в том числе управления) на льду в течение 30 мин.
    8. Образцы стирка в 10 мл 1х HBSS и гранул клетки в течение 10 мин при 329 х г (~ 1100 оборотов в минуту) в охлаждаемой центрифуге, 4 ° C температуре.
    9. Добавить пропидийиодидом в конечной концентрации 1 мкг / мл в образце, чтобы быть SorТед для исключения мертвых клеток. Очищают миогенные CD56-положительных клеток от не-миогенных клеток с использованием флуоресцентного активирована сортировщик клеток.
  2. Диссоциация биопсии кожи
    Примечание: дермальных фибробластов могут быть выделены из пуансона кожи от пациентов при биопсии мышц отсутствуют. Дермальных фибробластов могут быть использованы в качестве биоматериала в течение многих исследований, в том числе трансдукции с MyoD генерировать миогенные клеток. Кроме того, кожные фибробласты могут быть использованы для создания плюрипотентных клеток, которые могут быть дифференцированы в различные типы клеток для дальнейшего исследования.
    1. Транспорт биопсии кожи в лабораторию в транспортной среде. После того, как образец будет получена, выполнить первичную культуру, как можно скорее. Если основной культуры не может быть установлена ​​в тот же день, хранить образцы при комнатной температуре в течение ночи.
    2. Передача биопсии кожи в стерильную 35 мм чашки Петри в колпаке с ламинарным потоком.
    3. Промойте биопсию кожи в чашке Петри со стерильной 1х PBS, чтобы удалить кровь и грязь. Удалить жировой ткани стерильным скальпелем.
    4. Добавить 2 мл раствора коллагеназы и фарш ткани с скальпелем, инкубировать при 37 ° С в течение 45 мин до 1 ч, в зависимости от размера ткани.
    5. Передача переваренной ткани на 15 мл коническую трубку, промыть в чашку Петри с 2 мл питательной среды фибробластов в два раза, и собирать среды в той же трубе.
    6. Гранул клетки при 200 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
    7. Жидкость над осадком сливают и промывают осадок с 3 мл среды фибробластов, чтобы удалить коллагеназы, затем гранул клетки снова. Пожалуйста, обратитесь к таблице Материалы для состава массовой информации.
    8. Повторите шаг 1.2.7 еще один раз.
    9. Повторное приостановить осадок в 5 мл фибробластов средних и пластинчатых клеток на Т25 стерильного тканевой культуральной колбы. Инкубируйте колбы при 37 ° C с 5% CO 2.
    10. Оценить культуры для крепления фибробластов и рост в течение ближайших 1-3 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые мелкие кусочки ткани также может приложить к плите и фибробласты мигрируют из этих тканей штук.
    11. Поддержание культуры в тех же условиях до тех пор, пока фибробласты выращивали до приблизительно 80% слияния.
    12. Сбор фибробласты трипсинизацией и передать на свежие культуры колбах для дополнительного расширения. Выполните трипсинизации промывкой культур 3 раза в 1X PBS бесплатно Са ++ и Mg ++. Добавить трипсин-ЭДТА (см материалы таблица) к клеткам (2 мл / Т25 колбы) в течение 2 мин при 37 ° С.
    13. Сплит отдельные клетки в дополнительные колбы. Если некоторые кусочки ткани остаются прикрепленными к оригинальным колбы Т25, добавить 5 мл свежей культуральной средой в эту колбу и больше фибробласты мигрируют постоянно.
      Примечание: расширен культуре фибробластов могут быть заморожены вниз, как Р1 и хранили в жидком азоте для будущих экспериментов.

2. Иммортализация миогенных клеток

  1. Пластина 5000000 Феникс экотропного упаковки клетки (PE) в течение ночи в 10 см стерильной планшет для тканевых культур в среде DMEM и среды 199 в соотношении 4: 1, с добавлением 10% сыворотки теленка.
  2. Кормовые клетки 30 мин до трансфекции с 5 мл свежей средой с добавлением 10 мМ кофеина.
  3. Однородный смесь 2 мкг плазмидной ДНК из миди преп (CDK4 или hTERT плазмиды) и PolyJet и инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин, в соответствии с рекомендациями производителя.
  4. Добавить плазмиды / POLYJET смесь на PE клеток ночь.
  5. Поток клетки свежей средой (DMEM, и среда 199 в соотношении 4: 1, с добавлением 10% сыворотки теленка). Двенадцать часов спустя, собрать вирус, содержащий супернатант и фильтровать ее через фильтр размер 0,45 мкм пор.
  6. Использование 1 мл собранной супернатант заразить в течение ночи PA317 амфотропный упаковка клеточной линии 5 и получить стабильный вируса-продуцирующих клеток линии после выбора либо с 0,5 мг / мл неомицина (G418) для CDK4 или 0,5 мг / мл гигромицину для hTERT.
  7. Подготовка рабочих вирусные супернатанты путем выращивания устойчивых упаковочных клеток почти до слияния, затем уборки супернатант каждое утро и вечером, и утром в течение трех урожаев.
  8. Фильтр вирусные супернатанты и либо сразу использовать или разделить их на 1 мл аликвоты и хранят при -80 ° С для последующего использования. Обратите внимание, что вирусная супернатант теряет 50% эффективности инфекции с каждым замораживания-оттаивания. Помните, чтобы отбелить стирка, прежде чем выбросить все, что коснулся вирусные частицы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: стабильная PA317 вирус-продуцирующих клеточная линия может быть заморожен и выдерживают при -150 ° C для постоянного хранения (замораживание среды составляет 10% ДМСО; 90% сыворотки).
  9. Пластина FACS-очищали миогенные клетки (как описано в шагах 1,1-1,9) при плотности 5 х 10 4 клеток / лунку в 6-луночных планшетах, покрытых 0,1% желатином. Убедитесь, что клетки прикреплены к пластине, прежде чем приступить к вирусной инфекции.
  10. Добавить 400 мкл фильтруется, Freshly производится вирусный супернатант или замороженные аликвоты для каждого шесть-луночного планшета в течение ночи (держать 2 скважин в качестве контроля).
  11. Изменение среды путем подачи клетки с 2,5 мл / лунку свежим мышечной информации (4: 1, модифицированного Дульбекко среде Игла (DMEM), и среды 199, дополненной 15% фетальной бычьей сыворотки; 0,02 М HEPES буфера, 1,4 мг / л витамина В12; 0,03 мг / л ZnSO4, 0,055 мг / л дексаметазона, 2,5 мкг / л фактора роста гепатоцитов и 10 мкг / л Основной фактор роста фибробластов). Откажитесь от средств массовой информации и пипетки, содержащие вирусные частицы в хлорной тары. Оставьте клетки в той же среде в течение 3 дней, чтобы восстановиться после инфекции, затем обрабатывают для выбора с использованием либо 400 мкг / мл неомицина (CDK4 инфекции) или 300 мкг / мл гигромицина (hTERT инфекции).
  12. Поддерживать клетки под выбора препарата до клеток в контрольной блюдо умереть (1-2 недели).
  13. Прохождение клетки, прежде чем они становятся сливной (60-80% слияния, использование 0,05% трипсина ЭДТА), даже во время Selectiна период. Replate клетки в несколько 10см блюд со свежими миобластов среды (как описано в 2,11), с добавлением выбора препарата. Поддержание увековечили выбранные ячейки представляют собой гетерогенную популяцию или клонировать, чтобы получить полностью однородную генетический фон (те же вставки трансгена в каждой клетке).
  14. Выполните клонов выбор, используя следующие шаги:
    1. Семенной клетки с низкой плотностью (например, от 300 до 500 клеток в 10 см чашки) и поддерживать их в течение приблизительно двух недель, пока небольшие колонии не образуются (10-20 клеток).
    2. Удалить большинство среде в этой точке, оставляя лишь тонкую пленку, чтобы предотвратить клетки от высыхания.
    3. Поставьте клонирования кольцо (с одним концом, смоченной в силиконовой вакуумной смазки) по каждой нужной клона и добавить несколько капель трипсина / ЭДТА.
    4. Урожай клетки, когда они округляется тщательно аспирации клеток с использованием наконечника 1 мл или пипетки Пастера и передачи их наименьшим доступным многоямного плаTE (96 или 48, 24 или 12-луночные планшеты).
    5. Expand клонов, сколько необходимо для предотвращения местного слияния.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рисунок 1 иллюстрирует некоторые из основных шагов при диссоциации первичной ткани: Точное количество ткани, взвешивают в стерильной культуре ткани чашках Петри (1А, Б). Затем ткань тонко измельченного с помощью стерильных скальпелей, пока ткань суспензию получают (фиг 1С, D). После добавления пищеварения ферментов, первичной мышечной ткани диссоциации обычно достигается путем ферментативного расщепления течение 45-90 мин. Прогрессирование ткани пищеварения, как правило...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клетки как полезный ресурс

Выделение и культивирование миогенных клеточных популяций является чрезвычайно полезным при установлении заболевания фенотипа или в пробирке моделей болезни. Миогенного процедура изолятор описано здесь, дает возможность изолировать миобластов и фибробластов из скелетных мышц образцов, которые затем могут быть размножены, дифференцированных или сразу анализировали. Миобластов структура и функция может быть оценена с помощью микроскопического исследования, о...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта публикация финансируется через Cure CMD, грант Association Contre Les Myopathies (AFM) (проект 16297), и Национальные институты здравоохранения (номера грантов K08 AR059750, L40 AR057721 и 2R01NS047727).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Оборудование
Tissue   культурный колпак биобезопасностиBaker Company, Inc.Модель SterilGuard Hood
Настольная центрифуга, такая как Beckman Model Beckman CoulterModel Allegra 6RЕсли производится сортировка клеток, то предпочтительна центрифуга с охлаждением
МикроскопNikonModel Eclipse TS100
Инкубатор для культуры тканей, подключенный к CO2 источникForma Scientific Серия II
Флуоресцентно-активируемый сортировщик клеток (FACS)Becton DickinsonModel Aria
Реагенты для выделения первичных миобластов из ткани
Dispase IIRoche Applied Science#04942078001Приготовьте раствор носка 2,4 ед/мл в DMEM
Collagenase D Roche Applied Science#088882001Приготовьте исходный раствор 10 мг/мл
1x Sterile Hank' s Сбалансированный солевой раствор (HBSS), не содержащий кальция и магнияGIBCO Life Technologies#14185-052
Бычий сывороточный альбумин, фракция VSigma#05470Приготовьте стерильный раствор 1X HBSS 0,5% BSA для сортировки FACS
Стерильная питательная среда для миобластов: Dulbecco' s Модифицированный Eagle' s Среда (DMEM) с высоким содержанием глюкозы (4,5 г) с добавлением 30% фетальной бычьей сывороткиGIBCO Life Technologies11965-092Содержит L-глутамин
раствор лизисаRBC Qiagen158904
Йодид пропидиума 10мг/млSigmaP4170Приготовьте исходный раствор путем разведения порошка в стерильной дистиллированной воде
Antihuman CD56 антитела для проточной цитометрииBiolegend318310APC-конъюгированное антитело, другие метки доступны
Реагенты для иммортализации первичных миобластов
Экотропная упаковка клеточная линия PECell BiolabsRV-101
Амфотропная упаковка клеточная линия PA3174Cell BiolabsRV-102
Желатин свиной кожиSigmaG1890-500гПриготовьте бульонный раствор из 0,1% желатина в воде. Смажьте блюдо раствором при температуре 37°С; C в течение одного часа. Удалите раствор и добавьте среду.
PolyJet SignagenSL100688
G418Fisher345812
HygromycinEMD Biosciences400051
pBabe плазмиды, содержащие mCDK4 и hTERTне доступныStadler et al, 2013
Qiagen plasmid midiprep kitQiagen12143
Medium 199Life Technologies Medium 199 (31150022)
Dulbecco' s модифицированная среда Eagle (DMEM)Life Technologies DMEM (11965-092)Mix 4:1 DMEM:199
Среда роста Myoblast: 4:1 Dulbecco' s модифицированные Eagle medium (DMEM) и Medium 199 с добавлением 15% фетальной бычьей сыворотки; 0,02 М буфер HEPES; 1,4 мг/л витамина В12; 0,03 мг/л ZnSO4, 0,055 мг/л дексаметазона, 2,5 мг; г/л фактор роста гепатоцитов и 10 μ г/л фактора роста бета-фибробластов.Технология жизни (DMEM, F199); Atlanta Biological (FBS); Инвитроген (Хепес); Фишер (цинксульфат); Сигма (Vit.B12, Дексаметазон); Chemicon international (HGF); Биопионер (betaFGF) #15630-080 (Hepes); #Z68-500 (ZnSO); #V2876.#D4902 (Vit.B12, Dex); GF116 (HGF); HRP-0011 (bFGF). Приготовьте среду и исходный раствор Vit. B12 (20мг/мл); Сульфат цинка (60&микро; г/мл); Dex (55&микро; g/µ м) отдельно для удобства использования. Стоковое решение HGF (5&микро; г/мл) и FGF (20&микро; г/мл) следует добавлять в свежем виде каждую неделю при окончательной рабочей концентрации.
TrypLE expressGIBCO Life Technologies12605-010
Антитела с тяжелой цепью миозина для иммуноокрашиванияБанк гибридомразвития MF20Клон MF20
Desmin Антитела для иммуноокрашиванияThermo ScientificMS-376-S0Клон D33
Лошадиная сывороткаInvitrogen26050-088
Реагенты для выделения первичных фибробластов кожи
Транспортная среда: RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 0,2% пенициллина/стрептомицинаRPMI среда RPMI 1640: GIBCO Life Technologies11875-093
Первичная культуральная среда фибробластов человека: RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллина/стрептомицинаФетальная бычья сыворотка: Thermo ScientificSH30071.03
Раствор коллагеназы: Коллагеназа типа 2 (100 мг) ресуспендирована в 12,5 мл питательной среды фибробластов и стерилизована фильтромWorthington4176
Sterile 1X Phosphate Buffer Saline (PBS) без кальция и магния Lonza17-516F
Материалы для выделения первичных миобластов
50 мл и 15 мл стерильные конические пробиркиGeneMate/BioexpressС-3394-4 (50 мл); C3394-1 (15 мл))Стерильные
скальпелиAspen Surgical372610
ГемоцитометрHausser Scientific1492
Стерильные пипетки 5, 10 и 25 млBellco glass1226-05010 (5 мл); 1200-10010 (10 мл) ; 1228-25050 (25 мл)Многоразовые пипетки перед использованием моют, закупоривают ватой и автоклавируют
Стерильные пластиковые посуды, обработанные культурой тканей (10 см)BD Falcon353003
Стерильные нейлоновые клеточные ситечки (100 & микро; м и 40 & микро; размер m)BD Falcon352340 (40&микро; m); 352360 (100&микро; м)
  Материалы для иммортализации
Стерильный 0,45 & микро; m фильтрыMilliporeSLHV013SL
Кольца для клонированияCorning#3166-8Для очистки и автоклавирования до и после использования
Материалы для клеточных линий фибробластов 
Стерильные 35 мм пластиковые чашки, обработанные культурой тканейGreiner bio-one628160
Стерильные скальпелиDeRoyalD4510A
Стерильные колбы для культуры тканей T25Techno Plastic Product, TPP90026продаются в США компанией MIDSCI
TrypLE expressGIBCO Life Technologies12605-010
на рынке миобласта

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Flanigan, K. M. The muscular dystrophies. Semin Neurol. 32, 255-263 (2012).
  2. Mercuri, E., Muntoni, F. Muscular dystrophies. Lancet. 381, 845-860 (2013).
  3. Sharples, A. P., Stewart, C. E. Myoblast models of skeletal muscle hypertrophy and atrophy. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 14, 230-236 (2011).
  4. Tran, T., Andersen, R., Sherman, S. P., Pyle, A. D. Insights into skeletal muscle development and applications in regenerative medicine. Int Rev Cell Mol Biol. 300, 51-83 (2013).
  5. Miller, A. D., Buttimore, C. Redesign of retrovirus packaging cell lines to avoid recombination leading to helper virus production. Mol Cell Biol. 6, 2895-2902 (1986).
  6. Schubert, W., Zimmermann, K., Cramer, M., Starzinski-Powitz, A. Lymphocyte antigen Leu-19 as a molecular marker of regeneration in human skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 307-311 (1989).
  7. Mechtersheimer, G., Staudter, M., Moller, P. Expression of the natural killer (NK) cell-associated antigen CD56(Leu-19), which is identical to the 140-kDa isoform of N-CAM, in neural and skeletal muscle cells and tumors derived therefrom. Ann N Y Acad Sci. 650, 311-316 (1992).
  8. Pavlath, G. K., Gussoni, E. Human myoblasts and muscle-derived SP cells. Methods Mol Med. 107, 97-110 (2005).
  9. Boldrin, L., Muntoni, F., Morgan, J. E. Are human and mouse satellite cells really the same. J Histochem Cytochem. 58, 941-955 (2010).
  10. Belles-Isles, M., et al. Rapid selection of donor myoblast clones for muscular dystrophy therapy using cell surface expression of NCAM. Eur J Histochem. 37, 375-380 (1993).
  11. Meng, J., Adkin, C. F., Xu, S. W., Muntoni, F., Morgan, J. E. Contribution of human muscle-derived cells to skeletal muscle regeneration in dystrophic host mice. PLoS One. 6, e17454(2011).
  12. Zhu, C. H., et al. Cellular senescence in human myoblasts is overcome by human telomerase reverse transcriptase and cyclin-dependent kinase 4: consequences in aging muscle and therapeutic strategies for muscular dystrophies. Aging Cell. 6, 515-523 (2007).
  13. Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skelet Muscle. 1, 34(2011).
  14. Sigmund, C. D., Stec, D. E. Genetic Manipulation of the Renin-Angiotensin System Using Cre-loxP-Recombinase. Methods Mol Med. 51, 53-65 (2001).
  15. Ludlow, A. T., et al. Quantitative telomerase enzyme activity determination using droplet digital PCR with single cell resolution. Nucleic Acids Res. 42, e104(2014).
  16. Jankowski, R. J., Haluszczak, C., Trucco, M., Huard, J. Flow cytometric characterization of myogenic cell populations obtained via the preplate technique: potential for rapid isolation of muscle-derived stem cells. Hum Gene Ther. 12, 619-628 (2001).
  17. Gharaibeh, B., et al. Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique. Nat Protoc. 3, 1501-1509 (2008).
  18. Qu, Z., et al. Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy. J Cell Biol. 142, 1257-1267 (1998).
  19. Choi, J., et al. MyoD converts primary dermal fibroblasts, chondroblasts, smooth muscle, and retinal pigmented epithelial cells into striated mononucleated myoblasts and multinucleated myotubes. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 7988-7992 (1990).
  20. Huard, C., et al. Transplantation of dermal fibroblasts expressing MyoD1 in mouse muscles. Biochem Biophys Res Commun. 248, 648-654 (1998).
  21. Lattanzi, L., et al. High efficiency myogenic conversion of human fibroblasts by adenoviral vector-mediated MyoD gene transfer. An alternative strategy for ex vivo gene therapy of primary myopathies. J Clin Invest. 101, 2119-2128 (1998).
  22. Park, J. I., et al. Telomerase modulates Wnt signalling by association with target gene chromatin. Nature. 460, 66-72 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Исправление

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling
Posted by JoVE Editors on 11/12/2016. Citeable Link.

A correction was made to the authors section in: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

One of the authors names was corrected from:

Stacy C. Cossette

to:

Stacy A. Cossette

Теги

FACSCDK4hTERT

Похожие статьи