Методическая статья

Подготовка и характеристика SDF-1α-хитозан-Декстрансульфат наночастиц

DOI:

10.3791/52323

⸱

22 января 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School, 2Laboratory for Biomaterials and Drug Delivery, Department of Anesthesiology, Division of Critical Care, Boston Children's Hospital

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Целью этого протокола является включение SDF-1α, фактора наведения стволовых клеток, в наночастицы декстрана сульфат-хитозана. Полученные частицы измеряются по их размеру и дзета-потенциалу, а также по содержанию, активности и скорости высвобождения in vitro SDF-1α из наночастиц.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хитозан (CS) и сульфат декстрана (DS) являются заряженными полисахаридами (гликанами), которые при смешивании в соответствующих условиях образуют наночастицы на основе полиэлектролитного комплекса. Наночастицы гликана являются полезными переносчиками белковых факторов, которые облегчают доставку белков in vivo и поддерживают их удержание в целевой ткани. Полиэлектролитные комплексы гликана также идеально подходят для доставки белков, так как встраивание осуществляется в водный раствор, что снижает вероятность инактивации белков. Белки с гепарин-связывающим сайтом легко адгезируются к сульфату декстрана и, в свою очередь, стабилизируются связыванием. Эти частицы также менее воспалительны и токсичны при введении in vivo. В описанном ниже протоколе SDF-1α (фактор стромальных клеток-1α), фактор самонаведения стволовых клеток, сначала смешивают и инкубируют с сульфатом декстрана. В смесь добавляют хитозан для образования комплексов полиэлектролитов, а затем сульфат цинка для стабилизации комплексов с цинковыми мостиками. Полученные частицы SDF-1α-DS-CS измеряются по размеру (диаметру) и поверхностному заряду (дзета-потенциалу). Определяют количество инкорпорированного SDF-1α с последующим измерением скорости его высвобождения in vitro и его хемотаксической активности в форме, связанной с частицами.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Декстрансульфат (DS) и хитозан (CS) являются полисахариды с несколькими замещенных отрицательно заряженных групп сульфат (в DS), или положительно заряженные аминогруппы (деацетилируется CS). При смешивании в водном растворе, два полисахариды образуют полиэлектролитных комплексов путем электростатических взаимодействий. Полученные комплексы могут образовывать крупные агрегаты, которые будут фазовое разделение из водного раствора (выделений), или мелкие частицы, которые диспергируемые в воде (коллоиды). Конкретные условия, которые способствуют этих результатов были тщательно изучены, и были обобщены и подробно показано на недавнем обзоре 1. Среди этих условий, два основных требования для получения диспергируемые в воде частицы являются противоположно заряженные полимеры должны 1) имеют существенно различные молекулярную массу; и 2) можно смешивать в не-стехиометрическом соотношении. Эти условия позволят заряд, нейтральный образующего комплекса полимерных сегментов, генерируемых бесплатноНейтрализация отделить и образуют ядро частицы, а избыток полимера с образованием внешнюю оболочку 1. Гликан частицы, описанные в этом протоколе предназначены для доставки в легкие, и предназначены для чистой заряжены отрицательно, и нанометровых размеров. Отрицательный поверхностный заряд снижает вероятность клеточного захвата частиц 2,3. Частицы размерности нанометров облегчения прохождения через дистальных дыхательных путях. Для достижения этой цели, количество DS, используемый в этом препарате превышает CS (массовое соотношение 3: 1); и высокой молекулярной массой DS (средневзвешенный МВт 500000) и низкой молекулярной массой CS (диапазон MW 50-190 кДа, 75-85% деацетилированный) используются.

SDF-1α является фактором самонаведения стволовых клеток, который оказывает функцию самонаведения через его активности хемотаксиса. SDF-1α играет важную роль в самонаведения и обеспечения гемопоэтических стволовых клеток в костном мозге, и найма PROGEnitor клетки к периферической ткани для ремонта травма 4,5. SDF-1α имеет сайт гепарин-связывающей в его последовательности белка, что позволяет белок связывается с гепарином / гепарансульфата, образуют димеры, быть защищены от протеазы (CD26 / DPPIV) инактивации и взаимодействуют с клетками-мишенями через рецепторы клеточной поверхности 6-8. DS имеет аналогичные структурные свойства, как гепарин / гепарансульфата; Таким образом, связывание SDF-1α в DS будет похож на своих природных полимерных лигандов.

В следующем протоколе мы описываем получения наночастиц SDF-1α-DS-CS. Процедуры представляют собой один из составов, которые были ранее изученных 9. Протокол изначально приспособлены из исследования VEGF-DS-CS наночастиц 10. Небольшой подготовки масштаб описано, которые могут быть легко расширены с тех же исходных растворов и условий приготовления. После подготовки, частицы характеризуются бу исследуя их размер, дзета-потенциал, степень SDF-1α регистрации, в пробирке время выпуска и деятельность объединенной SDF-1α.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка SDF-1α Glycan наночастиц

В связи с целью доставки в естественных условиях, стерилизовать все контейнеры, пипетки, а также советы, использованных при подготовке.

  1. Подготовьте следующие растворы измерении воды: 1% сульфата декстрана; 1 М NaOH (стерильно фильтруют через мембрану PES); 0,1% хитозана в 0,2% ледяной уксусной кислоты (фильтр через 0,8 и 0,22 мкм фильтры последовательно и регулировать рН до 5,5 с помощью NaOH после); 0,1 M ZnSO 4; 15% маннита; и 0,92 мг / мл SDF-1α (хранили в аликвотах при 80 ° С, и выдерживают при 4 ° C После оттаивания).
  2. Стерилизовать растворы через фильтр 0,22 мкм мембраны. Оценка уровня эндотоксина в приготовленном растворе с Лаймулус amebocyte лизат (LAL) гель сгустка анализа. Убедитесь, что уровни <0,06 EU / мл.
  3. Добавить 0,18 мл сверхчистой воды в стекл нный сосудик на 1,5 мл, содержащую магнитную мешалку. Установите скорость перемешивают при 800 оборотах в минуту. Добавить 0,1 мл 1%сульфат декстрана и перемешивают в течение 2 мин. Добавить 0,08 мг SDF-1α (0,087 мл 0,92 мг / мл SDF-1α раствор) и перемешивали в течение 20 мин.
  4. Добавить 0,33 мл 0,1% хитозана по каплям и перемешивают в течение 5 мин. Изменение скорости перемешиванием до максимума и добавить 0,1 мл 0,1 М ZnSO 4 медленно с 0,1 мл шприца (более 1 мин).
  5. Возвращение скорости перемешиванием 800 оборотов в минуту и ​​перемешивали в течение 30 мин. Добавить 0,4 мл 15% маннита и перемешивали в течение 5 мин. Передача реакционной смеси в 1,5 мл пробирке. Центрифуга при 16000 х г при 4 ° С в течение 10 мин.
    Примечание: Наличие маннита способствует рефиксацией частиц после центрифугирования. В зависимости от компактности гранул, концентрации маннита может изменяться от 0% до 5%. Полное ресуспендирования частиц центрифугированием после каждого очень важно, чтобы избежать агрегатов в конечной суспензии.
  6. Отберите супернатант и использовать пипетку, чтобы удалить последние капли жидкости медленно. Добавить 0,2 мл 5% маннита. Приостановить осадок с 0,5 мл, 29 г урожденнаяDLE шприц. Добавить 1 мл 5% маннита. Центрифуга при 16000 х г в течение 15 мин.
  7. Повторите шаг 1,6.
  8. Аспирата супернатант. Ресуспендируют осадок в 0,2 мл 5% маннита. Хранить суспензии частиц при 4 ° С.
    Примечание: Суспензия частиц также может быть сохранена в замороженном виде при -80 ° С или лиофилизируют. В том числе 5% маннита в суспензии важно, чтобы предотвратить агрегацию частиц после замораживания и оттаивания или после лиофилизации и регидратации. Маннит может быть удален центрифугированием суспензии после хранения.

2. Измерение размера частиц и дзета-потенциал

Размер частиц и дзета-потенциал анализируют с помощью динамического рассеяния света и электрофоретического рассеяния света, соответственно, с помощью анализатора частиц указанного в списке материалов.

  1. Настройте следующие параметры для измерения размера частиц: временами накопления: 70; Повторите раз: 4; Температура: 25 ° С;Разбавитель: вода; Регулировка интенсивности: авто.
  2. Развести образец SDF-1α-DS-CS водой (10-кратным разбавлением). Загрузка 100 мкл образца к одноразовому УФ кювету, такие как кюветы Эппендорфа. Вставьте кювету в держатель клеток. Подождите для регулировки интенсивности, чтобы достичь «Оптимум» (~ 10 000 гц). Начните сбор данных.
  3. После окончания измерения, записи кумулянтов результаты диаметра (нм) и индекс полидисперсности. Нормальное результаты, полученные от каждого из 4 повторных показаний и расчета стандартного отклонения.
  4. Нагрузка 500 мкл 10-кратного разбавленного образца частиц в проточной кювете на дзета-потенциал измерения. Настройте следующие параметры для измерения: раз накопления: 10; Повторите раз: 5; Температура: 25 ° С; Разбавитель: вода; Регулировка интенсивности: авто. Запишите результаты дзета-потенциал (мВ). Среднее значение полученного результата от каждого из 5 повторных чтениях, и вычислить стандартное deviatioп.

3. Количественная оценка SDF-1α в частицах

  1. Развести в свободной форме SDF-1α в концентрации 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, и 0,05 мг / мл в 1,3 раза Laemmli буфера для образцов. Развести 6 мкл образцов SDF-1α-DS-CS с 40 мкл 1.3x Лэммли буфера для образца. (Подготовка 4x Laemmli запаса буфер, содержащий 0,25 М Трис-HCl, рН 7,5, 8% SDS, 40% глицерина, 0,05 мг / мл бромфенолового синего, и 8% 2-меркаптоэтанола. Разделить маточного раствора в виде небольших аликвот и держать при температуре от -20 ° C для одноразового использования.)
  2. Тепло образцов при 100 ° С в течение 10 мин. Vortex образцы в два раза (на 10 секунд при максимальной скорости) в течение 10 мин время нагрева для того, чтобы отделить частицы полностью. Охладить образцы до комнатной температуры в течение 2 мин. Центрифуга на 10000 мкг в течение 0,5-1 мин, чтобы сбить водный конденсат. Vortex снова хорошо перемешать.
    Примечание: В этот момент раствор образца должно быть ясно, без каких-либо видимого осадка настоящее время.
  3. Загрузить еще 10 &# 181; л образца / хорошо 4-20% SDS гель. Запуск электрофореза на 200 V в течение 20 мин. Пятно гель с голубым Кумасси белков пятно.
  4. Проверьте плотность полосы белка SDF-1α с помощью молекулярной тепловизором и анализа денситометрия программного обеспечения. Рассчитать количество SDF-1α в частицах по сравнению со стандартной кривой, построенной с бесплатными SDF-1α стандартам.

4. В пробирке Пробирной релиз

  1. Смешайте SDF-1α гликанов частицы с фосфатным буферным солевым раствором Дульбекко без кальция и магния (D-PBS) в соотношении 1: 1 (объем / объем).
  2. Разделите суспензии частиц в 0,05 мл аликвоты в 1,5 мл пробирки. Загрузка образцов в нижней части трубы. Избегать введения пузырьков воздуха или нарушения поверхности жидкости. Печать в верхней части трубки с парафильмом.
    Примечание: В этом жидкость будет оставаться в нижней во время последующей верхней до нижней вращения на смеситель трубки.
  3. Поворот трубы на 37 и# 176; C на вращающемся Micro-Тюбе Mixer. Удалить аликвот из труб на установленное время и сразу же центрифуги образцов при 16000 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
  4. Отдельные супернатанты и гранул, и восстановить гранул с 0,05 мл D-PBS. Хранить образцы при -20 ° С. После того как все образцы собирали, рассмотрим супернатанты и гранул на геле SDS, как описано выше.

5. Миграция Пробирной

Этот анализ измеряет активность хемотаксиса из SDF-1α. Взаимодействие SDF-1α с его рецептором (CXCR4) на поверхности клетки вызывает миграцию клетки в направлении SDF-1α градиента. В этом анализе клетки загружают в верхнюю лунку (разделенные полупроницаемой мембраной из нижней а) и SDF-1α раствора в нижнюю лунку.

  1. Развести SDF-1α (бесплатно или частиц связаны, образуют) с миграцией буфера (RPMI-1640, содержащей 0,5% бычьего сывороточного альбумина) в 3-FOLD последовательного разведения до конечных концентраций 100, 33, 11, 3,7, 1,2, 0,41, 0,14, и 0,05 нг / мл.
  2. Добавить 0,6 мл разбавленного раствора SDF-1α или миграции буфер, только (отрицательный контроль), чтобы хорошо в 24-луночного планшета. Добавить 0,57 мл миграции буфера в лунку (входного контроля клетки). Инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин. Поместите проницаемую вставку для культивирования клеток, таких как Transwell (размер пор 5 мкм, диаметр 6,5 мм) в верхней части ниже, а также. Добавить 0,1 мл Jurkat клетки (5 × 10 5) в Transwell вставить. Загрузка 0,03 мл клеток непосредственно в управления вводом клеток также. Инкубируйте планшет при 37 ° С в течение 2 ч в 5% CO 2 инкубаторе.
  3. Снимите вставки Transwell. Передача клетки, которые мигрировали к нижней лунки в 4 мл полистирола трубки. Граф мигрировавших клеток с цитометром потока.
  4. Рассчитать миграции в процентах от числа входных клеток (количество клеток в контроле клеточной и входного х 100/30) после вычитания чисел в negatив управления (клетки мигрировали в лунках, содержащих только буфер миграции).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Размер и дзета-потенциал подготовленных частиц SDF-1α-DS-CS определяются с помощью анализатора частиц. На рисунке 1 представлен анализ измерения размера. Из результатов, полученных в кумулянтов четыре повторных измерений, средний гидродинамический диаметр частиц SDF-1α-DS-CS является 661 ± 8,2 (нм) и полидисперсность 0,23 ± 0,02. Результат измерения дзета-потенциал показано на фиг.2. Из этих пяти повторных измерений, дзета-потенциал частиц SDF-1α-DS-CS является -24,8 ± 0,5 мВ. Как упоми...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Как упоминалось выше, наночастицы DS-CS сформированы с помощью нейтрализации заряда между полианиона (DS) и поликатиона (CS) молекул. Поскольку взаимодействие заряда происходит легко при молекулярном столкновения, концентрация полимерных растворов и перемешивание скорости во время смешивания имеет решающее значение для размера получаемых частиц. Общая тенденция состоит в том, что более разбавляют DS и CS решения 15 и более высокий результат скорости перемешивания в более мелкие частицы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана NIH гранты: HL671795, HL048743 и HL108630.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Декстран сульфатFisherBP1585-100
Хитозан, низкомолекулярный Sigma448869
Гептагидрат сульфата цинкаSigma204986
D-MannitolSigmaM9546
UltraPure water Инвитроген 10977-023
SDF-1αПодготовлено в соответствии со ссылкой 8.
Шприцевой фильтр, мембрана PES 0,22  μ mMilliporeSLGP033RS
магнитные микромешалки (2  х  7  mm)Fisher 14-513-63
Набор стеклянных флаконов; САН-Фишер14-823-182
Анализатор частиц Delsa Nano C Backman Coulter
Eppendorf UVette CuvetsEppendorf952010069
4– 20% Mini-PROTEAN TGX GelBio-Rad456-1096
GelCode Blue Safe Protein StainFisher PI-24592
Молекулярный имидж-сканер VersaDoc MP 4000 SystemBioRad170-8640
Corning Transwell Проницаемые опорыCorning3421
Accuri C6 Проточный цитометрBD Biosciences
Dulbecco' s фосфатный буферный солевой раствор SigmaD8537
Pyrogent plus kitFisherNC9753738

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Delair, T. Colloidal polyelectrolyte complexes of chitosan and dextran sulfate towards versatile nanocarriers of bioactive molecules. Eur J Pharm Biopharm. 78 (1), 10-18 (2011).
  2. Morachis, J. M., Mahmoud, E. A., Almutairi, A. Physical and chemical strategies for therapeutic delivery by using polymeric nanoparticles. Pharmacol Rev. 64 (3), 505-519 (2012).
  3. Yue, Z. G., et al. Surface charge affects cellular uptake and intracellular trafficking of chitosan-based nanoparticles. Biomacromolecules. 12 (7), 2440-2446 (2011).
  4. Ghadge, S. K., Muhlstedt, S., Ozcelik, C., Bader, M. SDF-1alpha as a therapeutic stem cell homing factor in myocardial infarction. Pharmacol Ther. 129 (1), 97-108 (2011).
  5. Sharma, M., Afrin, F., Satija, N., Tripathi, R. P., Gangenahalli, G. U. Stromal-derived factor-1/CXCR4 signaling: indispensable role in homing and engraftment of hematopoietic stem cells in bone marrow. Stem Cells Dev. 20 (6), 933-946 (2011).
  6. Sadir, R., Baleux, F., Grosdidier, A., Imberty, A., Lortat-Jacob, H. Characterization of the stromal cell-derived factor-1alpha-heparin complex. J Biol Chem. 276 (11), 8288-8296 (2001).
  7. Amara, A., et al. Stromal cell-derived factor-1alpha associates with heparan sulfates through the first beta-strand of the chemokine. J Biol Chem. 274 (34), 23916-23925 (1999).
  8. Sadir, R., Imberty, A., Baleux, F., Lortat-Jacob, H. Heparan sulfate/heparin oligosaccharides protect stromal cell-derived factor-1 (SDF-1)/CXCL12 against proteolysis induced by CD26/dipeptidyl peptidase IV. J Biol Chem. 279 (42), 43854-43860 (1074).
  9. Yin, T., et al. SDF-1alpha in glycan nanoparticles exhibits full activity and reduces pulmonary hypertension in rats. Biomacromolecules. 14 (11), 4009-4020 (2013).
  10. Huang, M., Vitharana, S. N., Peek, L. J., Coop, T., Berkland, C. Polyelectrolyte complexes stabilize and controllably release vascular endothelial growth factor. Biomacromolecules. 8 (5), 1607-1614 (2007).
  11. McCall, R. L., Sirianni, R. W. PLGA nanoparticles formed by single- or double-emulsion with vitamin E-TPGS. J Vis Exp. (82), 51015(2013).
  12. Carrillo-Conde, B. R., Roychoudhury, R., Chavez-Santoscoy, A. V., Narasimhan, B., Pohl, N. L. High-throughput synthesis of carbohydrates and functionalization of polyanhydride nanoparticles. J Vis Exp. (65), 3967(2012).
  13. Xu, J., Amiji, M. Therapeutic gene delivery and transfection in human pancreatic cancer cells using epidermal growth factor receptor-targeted gelatin nanoparticles. J Vis Exp. (59), e3612(2012).
  14. Lauten, E. H., et al. Nanoglycan complex formulation extends VEGF retention time in the lung. Biomacromolecules. 11 (7), 1863-1872 (2010).
  15. Schatz, C., Domard, A., Viton, C., Pichot, C., Delair, T. Versatile and efficient formation of colloids of biopolymer-based polyelectrolyte complexes. Biomacromolecules. 5 (5), 1882-1892 (2004).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

SDF 1SDF 1SDS

Похожие статьи