Измерение гладких мышцах функции в выделенную ткань баня приложений к фармакологии исследований

Краткое содержание

Этот протокол описывает измерение изометрического сокращения в изолированном препарате гладких мышц с использованием изолированной системы тканевой ванны и компьютерного сбора данных.

Аннотация

Анализы изолированной тканевой ванны являются классическим фармакологическим инструментом для оценки соотношений концентрация-реакция в мириадах сократительных тканей. Несмотря на то, что этот метод используется уже более 100 лет, универсальность, простота и воспроизводимость этого анализа помогают ему оставаться незаменимым инструментом как для фармакологов, так и для физиологов. Системы тканевых ванн доступны в широком спектре форм и размеров, что позволяет ученому оценивать образцы как маленькие, как мышиные брыжеечные артерии, так и такие большие, как свиная подвздошная кишка, если не больше. Центральное место в анализе изолированной тканевой ванны занимает возможность измерения зависящих от концентрации изменений изометрического сокращения, а также того, как можно манипулировать эффективностью и активностью сократительных агонистов путем увеличения концентраций антагонистов или ингибиторов. Несмотря на то, что общие принципы остаются относительно схожими, последние технологические достижения обеспечивают еще большую универсальность анализа в тканевых ваннах за счет использования компьютерного программного обеспечения для записи и анализа данных. В этом видео будет продемонстрирована функция изолированной тканевой ванны для измерения изометрического сокращения изолированной гладкой мускулатуры (в данном случае колец грудной аорты крысы), а также будут представлены типы знаний, которые могут быть получены с помощью этой техники. Включены подробные описания расслоения и подготовки аортальной ткани, размещения аортальных колец в тканевой ванне и надлежащего выравнивания тканей перед экспериментом, тестов жизнеспособности тканей, планирования и реализации эксперимента, а также количественного определения данных. Аорта будет подключена к изометрическим силовым преобразователям, данные с которых будут собираться с помощью коммерчески доступного аналого-цифрового преобразователя и мостового усилителя, специально разработанного для использования в этих экспериментах. Сопутствующее программное обеспечение этой системы будет использоваться для визуализации эксперимента и анализа полученных данных.

Введение

Дисциплина фармакологии использовал изолированную систему ткани бане в течение более чем 150 лет. Универсальность этой системы позволили ученым во всем мире, чтобы охарактеризовать рецепторы и рецепторного сигнала трансдукции, с этим знанием, являющимся основанием для лечения, которые лечили миллионы людей с заболеваниями или расстройствами, такими как гипертония, сердечная недостаточность, сахарный диабет, желудочно-кишечные заболевания, мочевого пузыря дисфункции, астму, и глотания, чтобы назвать только некоторые из них. По сей день, ткани ванны изолированные остается важным аспектом разработки лекарственных препаратов и фундаментальных исследований, так как позволяет ткани, чтобы функционировать как ткань. В этом ей-богу урока, формальный протокол поделился продемонстрировать визуальный и виртуальный эксперимент, использующий данные из изолированной ткани ванны эксперимента, который измеряет изометрическое сокращение, которое позволяет рецепторов характеристику.

Основным преимуществом этого метода является то, что ткани живетой функции в целом ткани с физиологической исхода (сужения или релаксации), которая имеет отношение к телу. Это синтез шагов (взаимодействия наркотиков рецепторов, передачи сигнала, второго поколения посланник, изменения в гладкой возбудимости мышц, и изменения в функции ткани). В то время как другие методы позволяют исследование каждой из этих стадий (например, радиоактивный лиганд связывания на сродство препарата, измерения вторичных мессенджеров), изолированные методика ткани ванны обеспечивает интеграцию всех этих шагов ^1. Еще одним преимуществом является то, что сохранение функции ткани позволяет вычисление важных фармакологических переменных, которые являются более значимым в ткани против клеточной установки; Что касается ближе к тому, как наркотики, рассмотренные будет работать в организме в целом.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры, описанные в этой статье, осуществляются в соответствии с руководящими принципами, установленными уходу и использованию комитета за животными (IACUC) Мичиганского государственного университета по.

1. Система Подготовка и настройка

1. Сделать 5 мкл физиологического солевого раствора (PSS), который является количество, необходимое для сжатия ткани ванны эксперимента, который использует до 50 мл тканевых ваннах; В таблице 2 приведена PSS рецепту. Вычислить общую требуемого объема путем умножения количества тканевые ванны раз превышает объем ванны, а затем умножением на количество требуемых промывок ткани.
   1. Используйте таблицу 2 в качестве руководства для принятия PSS. Растворения солей приблизительно в 4 л воды. ПРИМЕЧАНИЕ: ВЭЖХ - Тип I воду рекомендуется
   2. Добавить 8 мл 1 М раствора CaCl ₂ (147 г / л при использовании дигидрата соли) в растворе, так что конечный раствор 1,6 мМ кальция.
   3. Quantum sufficit PSS решение 5 л
   4. Предварительный нагрев системы ткани бане до 37 ° С при включении рециркуляции баню, нагретую воды. Важнейший шаг: Каждый компонент системы является водяной рубашкой, чтобы они были соединены в последовательный друг с другом. Направление потока является критическим - обеспечивать, чтобы вода течет в каждом компоненте по самой низкой колючей связи и на самом высоком колючей связи.
   5. Включите систему сбора данных. Включение силовых преобразователей, по крайней мере за 15 мин до эксперимента, чтобы уравновесить температуру.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство преобразователей силы используют тензодатчики, которые чувствительны к изменениям температуры и проявляют температурный дрейф первоначально после включения питания.
   6. Запуск программное обеспечение сбора данных и обеспечить связь с системой сбора данных. Пожалуйста, следуйте инструкциям производство для обеспечения записи данных.
   7. Убедитесь, что сила преобразователи калибруются перед ткани помещают в ткани ванны и перед началом записи данных началась; FOllow инструкции производителя для калибровки.
   8. Подключите систему ткани бане до 95% O _2/5% СО газового баллона ₂ медицинского назначения и убедитесь в отсутствии утечек газа, а затем давление в системе.
   9. Заполните ткани ванны резервуары с PSS и позволяют время решения, чтобы достичь оптимальной температуры. Премьер-системы и удалить все пузырьки воздуха в системе и труб.
   10. Проверьте ткани ванны аэраторы для обеспечения последовательного решения аэрации, которая оксигенирует буфер PSS и обеспечивает броуновское движение распространять наркотики, которые будут введены в тканевой ванне во время эксперимента. Убедитесь в том, аэрация / пузырьки не вызывает движение ткани, которая будет разрушать записи данных; уменьшить расход газа по мере необходимости.
       ПРИМЕЧАНИЕ: ткань для ванны и система сбора данных теперь готовы приступить к эксперименту.

   2. Подготовка ткани

   1. В идеале, рассекают ткани от животного непосредственно перед использованием и поместите непосредственно яNto PSS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые ткани могут быть сохранены в PSS в течение ночи при 4 ° С, но соответствующие органы управления должны быть сделано, чтобы проверить функцию ткани после длительного хранения; см раздел 6.
   2. Используйте грудной аорты, как ткани в этом упражнении.
   3. Обезболить крысу в соответствии с ведомственным руководящим принципам и поместите крысы спинной стороной вниз. Подтвердите обезболивания с помощью схождения крайнем случае и утрате рефлекторной реакции этой болезненной раздражитель.
      Примечание: Этот протокол использует 70 мг / кг пентобарбитала поставляемого с помощью внутрибрюшинной инъекции. Институциональные рекомендации по грызунов анестезии может отличаться.
   4. Создание пневмоторакс, создавая разрез ножницами вдоль диафрагмы в нижней части грудной клетки. Тогда, по-прежнему разрез в нижней части грудной клетки к грудине и пополам.
   5. Отсечь или разместить в стороне те органы, которые находятся на верхней части позвоночника и найдите аорты, которая лежит непосредственно вдоль позвоночного столба.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот SТЭП обеспечивает четкое рабочее пространство, чтобы рассекать из аорты.
   6. Север все соединения с аортой; от пищевода, легких, и т.д., и сократить аорты перпендикулярно к позвоночнику на уровне диафрагмы.
   7. Придерживая аорты с пинцетом и ножницами рассекают аорты от позвоночника. Начните рассечение в нижней части диафрагмы, прилегающей к позвоночнику и работать в направлении сердца. Убедитесь, принять дополнительные меры предосторожности, чтобы не тянуть или перетягивание на ткани аорты, которые могут повредить ткань.
   8. Сразу же место аорты в подготовленную рассечение блюдо с PSS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рассечение аорты в кольцах лучше всего делать в анатомическом театре блюдо, которое имеет черный фундамент силастиковых. Это дает возможность использования проводов, которые могут быть использованы для иглу аорты и быть прикреплены к чашке, обеспечивая стабильность, а в рассечение блюдо. Черный фон обеспечивает контраст, который помогает рассечение. Следует проявлять осторожность при использовании cannulating проводов, как эндотелиционного слой клеток могут быть удалены с избыточным трением проволоки против просвета сосуда.
   9. Возьмем проволоку и сделать небольшой 90 ° угол на одном конце и толкать под углом конец в силиконовой основания для крепления к направляющей проволоки. Поместите все аорту в рассечение блюдо.
   10. Удерживая конец направляющей проволоки с пинцетом, а затем осторожно нить провод в просвет аорты.
   11. Используйте пинцет, и сдвиньте аорты на проволоку. Когда свободный конец направляющей проволоки видно, кривая плавно проволоки и поместите свободный конец в силиконовой основания тарелки для стабилизации ткани.
   12. Использование малых Vännäs ножницы и пинцет, удалите периваскулярной жировой ткани и все другие посторонние ткани, сгустки крови и т.д., пока грудной аорты не появится белый и несколько волокнистым.
   13. Удалить очищенный аорты из проволоки и использовать ножницы, чтобы вырезать аорты в кольцах, которые примерно 3-5 мм в ширину.
   14. Разместить аорты кольцо на одном из пары TiСГУП крючки, удерживая крючок и с помощью щипцов, чтобы аккуратно сдвиньте кольцо на крючок. Повторите этот процесс со второй крючок. Следите за тем, крючки не клубок; Рисунок 3.
   15. Убедитесь, что каждый крючок имеет другой шелковой нити прилагается. Убедитесь, что один крюк имеет малый узлами петлю из шелка, что позволяет для крепления к стеклу или стержня из нержавеющей стали, в то время как другой представляет собой 10-4 см в длину кусок шва, что будет вручную привязан к датчику силы; Рисунок 3.
       Примечание: После того, как аорта прикреплен к крючкам, ткань готова для установки в ткани ванны; Рисунок 3.
   16. Повторите этапы 2.14-2.15, чтобы смонтировать второй аорты кольцо во второй камере ткани ванны.

   3. Ткань Размещение в ванной

   1. Следует отметить, что в этой системе, ткань сами ванны являются стационарными. В это время заполнить ткани ванны с подогретой, газобетона PSS и позволяют решение приехать в TEMPERATURе.
   2. С шелковой нитью, связать один из крючков по подготовке тканей к колышку на стержне из нержавеющей стали. Поместите этот конец в ткани ванны камеры. Подключите стержня в кольцевом основании и поместите другой конец При окрашивании блюдо, заполнены с PSS, чтобы ткань погружается в буфер; Рисунок 3.
      1. Поместите стержень и ткани в ткани ванны камеру и убедитесь, что ткань полностью погружен в PSS и стержень находится в безопасности; Рисунок 3.
      2. Свяжите другой шов с преобразователем силы и не забудьте оставить провисание шва между тканью и датчика силы.
         Примечание: Этот провисание будет удален путем регулировки микрометра; Рисунок 3.
   3. Повторите эти действия для второго кольца аорты и ткани ванны камеры.

   4. Установка пассивный Напряжение

   Примечание: В каждом ткань имеет длину (Lo), при котором клетки гладких мышц реагировать оптимумыLLY. Предварительные эксперименты для определения оптимального растяжения напряжение, которое достигает эта длина должна быть выполнена для каждого типа ткани должны быть рассмотрены. Крыса грудной аорты имеет оптимальную пассивного растяжения напряжение 4 г.

   1. Используйте микрометр / реечной усилить напряженность в 2 г и ждать ткани, чтобы достичь плато. После того, как плато достигается, усилить напряженность еще 2 г и ждать ткани на плато.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В кольцах аорты, после начальное натяжение 2 г поставлена ​​и плато достигается, ткань должна затем расслабиться в ~ 1,6 г. Второе применение 2 г приведет ткани до ~ 3,6 г, из которого ткань снова отдохнуть и напряжение будет уменьшаться. Таким образом, после добавления 4 г общего напряжения, программное обеспечение должно быть указано приблизительно 3,2 г напряженности.
   2. Повторите эти действия для второго кольца аорты и ткани ванны камеры.

   5. Сбалансированность и медикаментов Изготовление

   1. Равновесие ткани дляЧерез 60 мин после нанесения пассивный напряжение в ткани.
   2. В равновесной фазы, мыть ткани каждые 15-20 мин. Слейте тканей ванну и заменить PSS с PSS с подогреваемой водохранилища.
      Примечание: В течение этого времени, ткань будет релаксировать, что указывает на потерю пассивного напряжения.
   3. В течение этого времени подготовки препаратов для эксперимента, которые должны быть, по крайней мере в 1000 раз более концентрированным, чем фактическое концентрации в ванне, так что только небольшой объем запасов лекарственного необходима для достижения желаемой концентрации.

   6. Исходное вызов

   1. В конце периода уравновешивания, мыть ткани в последний раз, за ​​исключением данных, и RE-ZERO все входы.
   2. Выберите агониста (соединение, которое вызовет активное сокращение), к которому ткань реагирует.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В крысы грудной аорты, артериальная гладкая мышца активно контракт на агонист альфа-адренорецепторов рецепторов из-за иннервацииткань симпатической нервной системы. Адренергические агонисты, не были бы полезны в кишечных тканей при условии, что адренергические агонисты вызывают релаксацию. В этом случае агонист рецептора, такой как ацетилхолин (холинергической рецептора) могут быть использованы. Альтернативой как фенилэфрин и ацетилхолина является использование агонистов не-рецептора, таких как высокая калия (K), что и первый вызов. В гладких мышцах, высокой K работает косвенно кальциевые каналы открыты, и, таким образом, рассматривается в качестве общего показателя целостности гладких мышц.
      1. Выполнение первого вызов или пробуждения вызов путем добавления 10 ^-5 М фенилэфрин к тканевой ванне. Для достижения этой концентрации в 50 мл ткани ванной, добавить 50 мкл раствора фенилэфрина 10 ^-2 М.
         Примечание: 50 мкл в 50 мл PSS является разведение 1/1000, так что конечная концентрация составляет менее чем 1,000x наличии или 10 ^-5 М. Знание объема и последовательно поддержания объема ткани в ванне сhamber имеет решающее значение для определения окончательной концентрации лекарственного средства.
   3. Добавить 10 ^-5 М фенилэфрин, чтобы ткани ванны и позволяют сжатие до пика, а затем плато, когда наклон данных становится равной нулю. Убедитесь, что для записи каждого экспериментального события, чтобы помочь после экспериментального анализа.
   4. После плато, мыть агонист из тщательно опорожнения и заправки ткани ванны камеру с новой PSS. Убедитесь в том, чтобы записать эти события, а также.
      ПРИМЕЧАНИЕ: эмпирическое правило, что концентрация агониста в ванне снижается в 10 раз с каждой стирки. Хотя, более 3-4 промывки может быть необходимым довести ткань обратно к равновесному базового тона (натяжение).
   5. Пусть тканей отдохнуть в базовом тон в течение ~ 10 мин, прежде чем продолжить.

   7. Эксперимент

   ПРИМЕЧАНИЕ: Prazosin, альфа адренергических рецепторов антагонист, будут введены в ткань ванны камере переложить концентрации соотвonse кривую фенилэфрина (PE); это очевидный антагонизм.

   1. Для одной ванны, добавить транспортное средство (Н ₂ О), в которой растворяют празозин. К другому, добавить соответствующее концентрации празозина. В этом случае, добавить 25 мкл транспортного средства на один бане и 25 мкл 10 ^-5 М концентрации празозина к другому, чтобы достичь 5 х 10 ^-9 М или концентрации 5 нМ в ванне.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При добавлении автомобиля кажется ненужным в данном примере, необходимо сделать так при использовании других транспортных средств, которые имеют потенциал, чтобы быть сосудоактивный (например, ДМСО, этанол, этилацетат). Добавьте соответствующее транспортное средство, даже если мало доказательств существует для того, чтобы быть сосудоактивный.
   2. Оставьте автомобиль / празозин в банях и не мыть ткани в течение 1 часа.
      1. В то время как ткани уравновешивания, подготовить несколько концентрации агониста (PE). Включают в себя широкий диапазон концентраций, от концентрации не добилась ответа (например, </ EM> 10 ^-9 M PE) в концентрациях, которые превосходят максимальную реакцию (например, 10 ^-4 M PE). С кривые концентрация-ответ логарифмической природы, сделать шесть отдельных исходных растворов PE (10 ^-6 -10 ^-1 М) с помощью серийных разведений от 10 ^-1 М раствора. Убедитесь, что объем необходим для каждой концентрации немного больше, чем тройной общего объема, необходимого для всех ванн (т.е.> 300 мкл).
   3. Перейдем к добавлением агониста, как описано в таблице 1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот эксперимент будет генерировать кумулятивной кривой отклика концентрация в PE; каждая итерация учитывает количество вещества, уже добавленный в ванну. Дополнения происходить до тех пор, больше не увеличивают сокращение, или вся кривая плато.
      1. Добавить каждой концентрации лекарственного средства по отдельности, пока порог ткани пока не будет достигнута.
      2. Если не происходит никаких изменений, добавьте следующий концентрацию вСерия; табл 2.
         ПРИМЕЧАНИЕ: времени из этих дополнений зависит от агониста используется. Например, норадреналина и сжатие фенилэфрин быстро развивается, и следует плато в течение нескольких минут. С другой стороны, эндотелин-1 сокращение развивается медленно и не может плато в течение почти 45 минут. Другое экспериментов можно сделать на ткани после построения кривой, такие как этот, так долго, как (1) вещество вымывает; и (2) можно показать, что ткань возвращается к нормальной сократительной поведения и не зависит от предыдущих раздражений.

   Анализ 8. Данные

   1. Убедитесь в том, чтобы сохранить данные непосредственно до и после вмешательства (например, проснуться или полный кривая).
   2. Найти и установить тканей Базовый уровень для каждой камеры / канала ввода ткань баня, которая поможет в анализе данных.
   3. После того, как базовый установлен, найти максимальный ответ для каждой концентрации и записывать чанGE сравнению с исходным. Последовательно перемещения по каждой из концентраций и записывать сдвига базовой линии.
   4. Graph полученные данные. Сделайте это в любой программе, графический.
      ПРИМЕЧАНИЕ: График Pad Prism предназначен для фармакологов, и это идеально подходит для типа эксперимента, представленного здесь.

Результаты

В терминах агонизма, относительная эффективность _(Е макс) и активность (ЕС ₅₀₎ агониста в данной ткани может быть вычислена и по сравнению с ответами других агонистов в той же ткани ^1. В нашем эксперименте крыс грудной аорты инкубировали либо с транспортного средства или α ₁ адренергической антагониста рецептора празозина (5 нМ) в течение одного часа перед добавлением α ₁ адренергическим агонистом фенилэфрин, чтобы ткани ванны и генерации сжатие (рисунок 1).

Рисунок 2 представляет модифицированный результаты рисунке 1. Зеленые ответы отметили максимальное сокращение достигается за счет PE помечается как Мах ½ максимального сокращения обозначена как таковая, а затем, связанной с концентрацией PE, что причиной того, что ответа. Определение этих значений с указанием эффективного концентрации агониста, которая достигает половину макс (50%) ответ или ЕС _50.

В генерации и интерпретации этих результатов, важно использовать как низкие и высокие концентрации агониста, чтобы создать кривую концентрация-ответ. Без достаточно очков, чтобы показать стабильный базовый и максимальный плато, EC ₅₀ и E _MAX может быть оценена только. Это было сделано в графическом в этом примере. Компьютерное программное обеспечение, которое использует логистические функции для сигмоидальных кривых можно использовать для аппроксимации кривой и расчете Значения ЕС _50.

Фигура 1:. Ткань Ванна Схема мультфильмов, представляющие кольцо ткани помещают в двойной стенкой, с вод ной рубашкой ба тканитыс. Приток буфера и отток регулируются 3-полосная стекла краном, интегрированного в основании камеры. О ₂ / СО ₂ барботировали через аэратор, который уплотнен прокладкой, чтобы предотвратить утечку PSS или газа. Вход рециркуляции ниже выхода для поддержания надлежащего рециркуляции и предотвратить образование воздушных карманов, которые могут вызвать температурный дисрегуляция.

Рисунок 2:. Крыса грудной аорты + эндотелия рисунке выше изображен четыре отдельных экспериментов (различных животных и сделали разными исследователями на разных множество окон в лице разных цветов), чтобы проверить способность празосином переложить сокращение PE-индуцированной. Prazosin (5 нМ) явно сместился PE-индуцированной кривой сжатия вправо параллельным способом.

Рисунок 3: Крыса грудной аорты + эндотелия Графический оценка EC ₅₀ значений для ПЭ в отсутствие (транспортного средства) и в присутствии (празозин) антагониста.. Зеленая линия (группа C) только обозначены.

Соль	МВт (г / моль)	5 литров	FINAL мМ
			(в граммах)
NaCl	58.45	37.99	130
KCl	74.56	1,75	4,7
KH2PO4	136,1	0,8	1.18
MgSO4• 7H20	246,5	1,45	1.17
NaHCO3	84.21	6,25	14,9
Декстроза	180,16	5	5,5
ЭДТА	380	0,05	0,03

Таблица 1: нормальный физиологический солевой раствор (PSS) Рецепт Содержание бикарбоната буфером PSS, используемой в этом эксперименте.. Включены молекулярные веса всех солей и количество добавляют к 5 л дН ₂ O, чтобы достичь желаемой концентрации.

Концентрация в ванной	Добавление агониста внесены бане
1 х 10 -9 М	50 мл 1 х 10 -6 М
3 х 10 -9 М	100 мл 1 х 10-6 М
1 х 10 -8 M	35 мл 1 х 10 -5 М
3 х 10 -8 M	100 мл 1 х 10 -5
1 х 10 -7 М	35 мл 1 х 10 -4 М
3 х 10 -7 М	100 мл 1 х 10 -4 М
1 х 10 -6 М	35 мл 1 х 10 -3 М
3 х 10 -6 М	100 мл 1 х 10 -3 М
1 х 10 -5 М	35 мл 1 х 10 -2 М
3 х 10 -5 М	100 мл 1 х 10 -2 М
1 х 10 -4 М	35 мл 1 х 10 -1 М

Таблица 2:. Ткань Ванна Добавка Концентрация агонист количество агониста быть добавлены в каждую ванну с проPerly построить кривые суммарной концентрации реагирования. Желаемой концентрации ванны достигается за счет того последовательных количеств возрастающих концентраций агониста. Каждое дополнение учитывает концентрацию агониста, уже присутствующего в ванне. Это делается, чтобы свести к минимуму увеличение объема в тканевой ванне, что бы в результате использования растущих объемов одной концентрации агониста.

Обсуждение

Измерение изометрической силы в качестве исследовательского инструмента составляет более 150 лет, но она по-прежнему прототип техника для рецептора характеристики сократительной ткани ^2. Сила этого метода в его простоте и универсальности: путем записи ответов, вызванных увеличением концентрации агониста в присутствии или в отсутствие антагониста, множество информации может быть получена о фармакологических характеристик каждого препарата рецептора и к которому он связывается ^3-5. Эксперименты такого типа также собрать информацию о конкурентоспособной по сравнению с не-конкурентный характер антагонистов, используемых, а также рецепторов неоднородность и неспецифические эффекты препарата ^6-8. Таким образом, с помощью простых перестановок в этом изолированном эксперимента ткани ванны, относительно полной фармакологический профиль рецепторов, которые опосредуют агонист-индуцированную сокращение мышц могут быть получены.

С точки зрения агонизма, йе относительной эффективности _(Е макс) и активность (ЕС ₅₀₎ агониста в данной ткани может быть вычислена и по сравнению с ответами других агонистов в той же ткани ^1. В нашем эксперименте крыс грудной аорты инкубировали либо с транспортного средства или α ₁ адренергической антагониста рецептора празозина (5 нМ) в течение одного часа перед добавлением α ₁ адренергическим агонистом фенилэфрин, чтобы ткани ванны и генерации сжатие. 2 представлены результаты модифицированного фиг.1. Зеленые ответы были отмечены максимального сокращения достигнутого PE помечается как максимум, ½ максимального сокращения отмечены, как таковые, а затем связано с концентрацией PE, что причиной того, что ответа. Определение этих значений с указанием эффективного концентрации агониста, которая достигает половину макс (50%) ответ или EC ₅₀ значения.

К сожалению, с использованием агониста-зависимый параметрš в одиночку, чтобы определить связывание с рецепторами характеристики могут быть сложными ^9. В идеале, дополнительные эксперименты с использованием антагонистов рецепторов позволяет рассчитывать двух важных параметров, которые играют ключевую роль в определении взаимодействия между наркотиками и рецептора: -log ₁₀ антагониста константы диссоциации (рК _В) и -log ₁₀ молярной антагониста концентрацию, необходимую, чтобы вызвать двукратное сдвиг вправо в кривой концентрация-ответ (PA ₂₎ ^10. Оба K _Б и ПА ₂ усиления их полезность с тем, что они являются агонисты-независимыми значениями, и остаются неизменными даже между разными тканями ^11. Из данных на рис 2, ПК _B можно рассчитать, используя следующее уравнение и на основе ЕС ₅₀ значения, вычисленные в другом месте:

ЕС ₅₀ в отсутствие празозина = 2 х 10 ^-8 М
EC ₅₀ в предварительночувством празосином = 7 х 10 ^-6 М

Решить для K _B в следующем уравнении:
войти (DR-1) = авторизуйтесь [B] - войти K B
Где:
[В] = концентрации антагониста, или 5 х 10 ^-9 М. войти (5 х 10 ^-9 М) = -8,3
DR = соотношение доз ЕС ₅₀ значения в присутствии антагониста / EC ₅₀ в отсутствие. Если есть сдвиг вправо, то это значение будет больше, чем один. Таким образом:
DR = 7 х 10 ^-6 M / 2 х 10 ^-8 М или 700 х 10 ^-8 M / 2 х 10 ^-8 М = 700/2 = 350
Подставляя [B] и др:
войти (350-1) = -8 - войти K _B
2,54 = -8 - войти KB
рк _B = 10,54

Это значение для празосином согласуется со значениями, полученными при празозин взаимодействует с α ₁ адренергической Receptили ^12,13, предполагая, что адренергический рецептор посредником сокращение на фенилэфрин адренергических рецепторов α _1.

Несколько шагов имеют решающее значение для успеха этих экспериментов. Ткани должны оставаться в PSS после вскрытия, чтобы предотвратить потерю жизнеспособности ткани. Любой изометрической подготовка мышц имеет оптимальное соотношение длины натяжения, который генерирует максимальную силу против пассивного напряжения ^14,15. Для эксперимента, описанного в этом протоколе, оптимальное пассивное напряжение было ранее определено путем кратковременного добавление шагом 0,5 г пассивного напряжения на ткани. Ткань должна начинаться без тона, а затем через 30 мин уравновешивания, ткань вызов с максимальной концентрации KCl (80 мМ), который генерируется активный сигнал. Затем, ткань промывают и разрешили вернуться к исходному тоном. Через 15 мин в начале исследования, еще 0,5 г пассивного напряжения был помещен, и этот процесс повторяется до тех пор, платоактивное натяжение было достигнуто с дополнительной пассивной напряжения. В предварительных экспериментах, 4 г общего пассивного напряжения был определен для достижения максимального поколения активное натяжение в кольцах аорты и, таким образом, это общее количество напряжения находится на кольцах до уравновешивания. В процедурном, лучше к нулю предварительной заявке пассивного натяжения, но может быть сделано в любое время до эксперимента. За растяжения ткани, в любой момент эксперимента или вскрытия, негативно скажется на жизнеспособности тканей и экспериментальные результаты. Это наиболее важно при размещении ткани в ванне, а этот этап имеет самую высокую вероятность чрезмерного растяжения. Достаточное стиральная, в количестве и продолжительности требуется для воспроизводимых эффектов. Вторая задача слишком скоро после начального вызова, или до тканей вернулись к исходному напряженности, приведет к аномальным ответов. Если изучение обратимых антагонисты / ингибиторы, ткани не должны быть промыты до агонист того, в качестве inhibiКонцентрация Tor будет уменьшена.

Есть заметные преимущества и недостатки изолированных анализов тканей для ванны.

Недостатки: Ткани могут возникнуть различные степени повреждения во время хирургического удаления или помещения колец на крючки. С эндотелиальных клеток является внутренняя подкладка аорты кольца, необходимо позаботиться о размещении кольца на крючки таким образом, чтобы не повредить этот слой клеток. Ткани могут также иметь совершенно разные периоды времени, в котором они являются жизнеспособными в ткани ванны, и это должно быть определено; Не все ткани одинаковы. Вдоль этих линий, ткани могут изменить в своей отзывчивости в течение дня, так что контроль времени стать необходимый контроль для каждого эксперимента. Хорошим примером может служить трахеи морской свинки, который улучшает сократимости максимум на 100% при типичном эксперименте 8 ч. Препараты, которые плохо растворимы в воде, могут осаждаться в PSS. Наконец, совокупныйй некумулятивные добавки препарата, который является агонистом может привести к различным результатам, если рецептора десенсибилизации к агониста происходит; Ангиотензин II является одним из таких препаратов, который показывает быстрое тахифилаксии.

Преимущества: Один из основных преимуществ тканей экспериментов ванны является то, что в режиме реального времени; можно увидеть эксперимент, как она разворачивается и может быстро делать выводы и планировать дальнейшие шаги, а также устранение неисправностей во время эксперимента. Эксперимент занимает день, чтобы сделать. Несколько ткани, как правило, могут быть получены из одного животного, таких, что животное может служить своим собственным контролем, и что повышает прочность к эксперименту. Можно также изолировать ткани от других факторов, с тем чтобы проверить относительно чистый реакцию ткани на препарат. Эксперименты в лабораторных, такие как системы ванны ткани также позволяют использовать небольшое количество препарата по сравнению с экспериментом в естественных условиях.

Основной опытно-конструкторских описанные здесь, могут бытьзначительно изменена, чтобы для записи дополнительных параметров или введение других внешних раздражителей. Например, добавление электродов позволяют электрического поля стимуляции нервов, иннервирующих ^16,17. С добавлением термических или рН зондов, влияние температуры и рН на сократительные реакции можно также измерить ^18,19. Кроме того, кислород может быть заменен полностью или частично с N ₂ для оценки гипоксии, индуцированные эффекты. Кроме того, одни и те же основные принципы изометрической измерения сократительной используемые в этом видео может быть использован для разработки систем, которые позволяют сопутствующей измерение развития изометрической натяжения и изменения внутриклеточного кальция ^20. Сигнал трансдукции также легко изучены, так как существуют системы, которые могут быстро заморозить образец ткани во время реакции, таким образом, что активность трансдукции системы путей распространения сигнала может быть проверена биохимически.

Изменение экввления, которые могут быть использованы, чтобы сделать это огромно. Вся эта система, либо рука построены или автоматизированная, можно приобрести из нескольких разных компаний. Тканевые бани и держатели ткани, используемые в настоящем протоколе были руки-выдувное (тканевые ванны) и ручные построен (держатели) по в доме Университет штата Мичиган механических мастерских.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Программное обеспечение LabChart	7.2
PowerLab (4 канала)	Кондиционеры	ML760
QuadBridge (4 канала)	Адаптер	ML112	ML112
Кабель-адаптер для травы		MLAC11	MLAC11 MLAC11
Датчик силы травы	Инструмент для травы Co	FT03	FT03
Кабель для датчика	травы Инструмент для травы Co	TAC-7 REV-1
Кабель	BNC на BNCADInstruments	MLAC01
IsoTemp 2100	Fisher Scientific		IC-2100
Тканевая ванна	несколькими источниками
Физиологический раствор			PSS
Плетеный шелковый шовный материал	Harvard Apparatus	51-7615	SP104
Кольцевая подставка	Humboldt MFG Co	H-2122 7
Препарирующая посуда	ручной работы с силиконовой
трубкой Tygon	VWR Scientific	63010-100	R-3603
Хомуты для шланга	Cole-Parmer Instrument Co	06832-08	SNP-8
50 мл Мышечная ванна	Eberhartglass	Blowing Custom
250 мл Согревающие камеры	Eberhartglass Blowing	Custom
трубка	Ace Glass	7202-06	7202-02
микрометр
Custom Stand
Трехконтактные зажимы	VWR International		Talon
S-образный разъем	VWR International		Talon
Тканевые крючки	ручной работы Сделано в домашних	условиях Нестандартное
рассечение
Leica Стереомикроскоп MZ6	Leica		10447254
Стереомастер Микроскоп Волоконно-оптический источник света	Fisher Scientific	12562-36	12562-36
Культура Чашка Петри	Pyrex		7740 Стекло
Силиконовый эластомер Sylgard	Dow Corning		Sylgard 170 Kit
Vannas Ножницы	George Tiemann & Co	160-150	160-150
Splinter & Фиксирующие щипцы	George Tiemann & Ко	160-55	160-55