Механическая жесткость в опухоли микроокружения играет решающую роль в стимулировании злокачественной поведение, увеличивая invadopodia деятельность и актомиозин сократимость. Использование гелей полиакриламида (ЧУК), invadopodia и тяговое усилие анализы могут быть использованы для изучения инвазивных и сократительные свойства раковых клеток в ответ на матрицу жесткости.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Полиакриламидные Гели для Invadopodia и тяговое усилие Анализы на клетках рака
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Жесткие ткани опухоли были сильно вовлечены в регулирование миграции раковых клеток и вторжения. Инвазивные миграции через сшитых тканей способствует актин-богатых выступов, называемых invadopodia, что протеолитически ухудшают внеклеточный матрикс (ВКМ). Invadopodia деятельность было показано, что в зависимости от жесткости ECM и сократительных клеток рака сил, предполагая, что жесткость сигналы могут регулировать эти субклеточные структуры, посредством актомиозинового сократительной. Инвазивные и сократительные свойства раковых клеток может быть связано в пробирке с использованием invadopodia и тяговое усилие анализы, основанные на полиакриламидном геле (ЧУК) различных жесткости. Инвазивные и сократительные свойства раковых клеток может быть связано в пробирке с использованием invadopodia и тяговое усилие анализы, основанные на полиакриламидном геле (ЧУК) различных жесткости. В то время как некоторые различия между двумя анализов существуют, протокол, представленные здесь относится к способу создания Paas йна может быть использован в обоих анализах и легко адаптируются к конкретным биологических и технических потребностей пользователя.
Введение
Жесткость опухолеассоциированному ECM была определена в качестве важного фактора в движении злокачественной поведение, увеличивая актомиозина сократимость 1-3. В то время как этот эффект, прежде всего, было продемонстрировано с клетками рака молочной железы, матрица жесткости было обнаружено, чтобы изменить свойства инвазивных клеток, полученных из различных видов рака 4-8 предположить, что жесткость опухоли может играть роль в других типов рака. Чтобы проникнуть сшитых тканей при инвазивной миграции, раковые клетки используют актин-богатых клейкие выступы, известные как invadopodia, что локализовать протеиназ в очаговым ухудшить ECM 9.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка покровные стекла для ЧУК
- Чистые 12 мм покровные с низким салфетки волокна.
- Пламя мм покровные 12 и 14 мм покровное в микролунку каждого 35 мм со стеклянным дном блюдо, пропуская их через пламени горелки Бунзена с помощью пинцета.
- Обработать лунки 200 мкл 0,1 N NaOH в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Отберите и воздух сухой микролунки в течение 30 мин.
- Обработать лунки с 50-100 мкл 3-аминопропилтриметоксисилан в течение 10 мин при комнатной температуре в вытяжном шкафу. Это химическое вещество вступает в реакцию с пластиком; Поэтому, использовать стеклянные пипетки и не заполнять лунки полностью,....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В invadopodia анализа, invadopodia, как правило, определены колокализации маркеров, таких как актина и cortactin на точечных структур в теле клетки (рисунок 1). Оба активно деградирует и не унижающие invadopodia можно подсчитать и дифференцируются в зависимости от того, эти структуры локализуются с черными районах, где отсутствует флуоресцентный сигнал в FITC-меченого фибронектина (рис 1). Invadopodia вручную пересчитать, и деградация ECM в клетки определяется вручную пороговой эти черн.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Мы представляем способ изготовления PaaS, которые могут быть использованы в качестве основы для invadopodia и тяговое усилие анализов коррелируют с инвазивными и сократительные сотовой поведения. В то время как ЧУК уже давно привык смотреть на жесткость воздействия на клетки и рассчитать тяговые силы 18,24,27, этот протокол является первым для разработки параллельных анализов, основанных на ЧУК с теми же жесткости соотнести инвазивных и сократительные сотовой поведения в ответ на матрице механические свойства.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Эта работа была поддержана Национальным институтом рака Национального института здоровья в рамках премии номер K25CA143412 (Parekh). Мы хотели бы признать, что дополнительная поддержка была оказана кафедры отоларингологии. Содержание исключительно ответственности авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института здоровья.
Благодарности
Авторы не имеют ничего раскрывать.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 3-Аминопропилтриметоксисилан | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| Акриламид (40%) | Bio-Rad | 161-0140 | |
| Акриловая кислота NHS эфир | Sigma-Aldrich | A8060 | готовить свежий в вытяжном шкафу 10 мг/мл в ДМСО |
| Alexa Fluor 546 фаллоидин | Life Technologies | A22283 | также можно использовать родамин |
| персульфат аммония | Bio-Rad | 161-0700 | приготовить свежий 10% раствор в 1x PBS |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences | 18606 | использовать 6 капель для заполнения микролунок |
| BIS (2%) | Bio-Rad | 161-0142 | |
| Бычий сывороточный альбумин | RPI | A30075 | сделать 3% для блокирующего раствора в 1x PBS и хранить в 4 ° |
| C Покровные стекла (12 мм) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| диализная трубка | Sigma-Aldrich | D9777 | предварительно уравновешивает в боратном буфере на 15 - 30 мин |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | используется для получения инвадоподии среды |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | используется для получения раствора эфира акриловой кислоты NHS |
| Эпидермальный фактор роста | Life Технологии | PHG0311 | использования для получения инвадоподия среды |
| Этанол | PHARMCO-AAPER | E200 | разбавляют сверхчистой водой до 70% |
| FBS | Thermo Scientific | SH30070.03 | используют для получения инвадоподии среды |
| FITC | Sigma-Aldrich | F7250 | защиты от света |
| Желатин | Polysciences | 00639 | обычно делают 10 мл 1% раствора сахарозы/1% желатина в PBS и хранят при температуре 4°С; C (предварительно нагрейте PBS для легкого растворения желатина) |
| Стеклянные посуды со дном (покровные стекла 35 мм) | MatTek | P35G-0-14-C | покрывающие стекла представляют собой непокрытый |
| глутаральдегид (25%) | Polysciences | 01909 | разбавить 1x PBS до 0,5% |
| Козий антимышиный Alexa Fluor 633 антитело | Life Technologies | A21050 | |
| Фибронектин плазмы человека | Life Technologies | 33016-015 | Добавьте 5 мл ультрачистой воды, чтобы получилось 1 мг/мл; аликвота в объемах в зависимости от использования для предотвращения чрезмерных циклов замораживания и размораживания |
| KH2PO4 | EMD Millipore | PX-1565-1 | использовать для изготовления 10x PBS stock |
| Мышиный антикортактин 4F11 антитело | EMD Millipore | 05-180 | |
| Na2HPO4 | EMD Millipore | SX-0720-1 | использовать для изготовления 10x PBS stock |
| NaCl | RPI | S23020 | использовать для приготовления 10x PBS бульонного и боратного буфера |
| NaOH (1 N) | Sigma-Aldrich | S2770 | разбавить ультрачистой водой до 0,1 Н |
| Nu-сыворотки (сыворотки с низким содержанием белка) | BD Biosciences | 355500 | использовать для получения инвадоподии среднего |
| параформальдегида | Acros | 416785000 | обычно делают 10% бульона в 1x PBS, готовят в вытяжном шкафу и добавляют несколько мл крепкого NaOH для легкого растворения параформальдегида, а затем возвращают к pH 7,4 с сильным HCl) |
| PBS (стерильный) | Cellgro | 21-040-CV | используют для клеточной культуры |
| RPMI 1640 | Cellgro | 10-040-CV | используют для приготовления инвадоподийной среды |
| боргидрид натрия | Sigma-Aldrich | 452882 | готовят в свежем виде в вытяжном шкафу 1 мг/мл в 1x PBS |
| Тетрагидрат метабората натрия | Sigma-Aldrich | S0251 | использовать для приготовления боратного буфера |
| Сахарозу | RPI | S24060 | обычно делают 10 мл 1% раствора сахарозы/1% желатина в PBS и хранят при 4 °°; C (предварительно нагрейте PBS для легкого растворения желатина) |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| Triton X-100 | Alfa Aesar Aesar | A16046 | сделайте 10% запаса в 1x PBS и используйте как есть для удаления клеток в анализе силы вытяжения или разбавьте 1x PBS для окрашивания |
Ссылки
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer cell. 8, 241-254 (2005).
- Jaalouk, D. E., Lammerding, J. Mechanotransduction gone awry. Nature. 10, 63-73 (2009).
- Paszek, M. J., Weaver, V. M.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
