Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Полиакриламидные Гели для Invadopodia и тяговое усилие Анализы на клетках рака

12.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52343

⸱

4 января 2015 г.

 , 
1Department of Otolaryngology, Vanderbilt University Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

Механическая жесткость в опухоли микроокружения играет решающую роль в стимулировании злокачественной поведение, увеличивая invadopodia деятельность и актомиозин сократимость. Использование гелей полиакриламида (ЧУК), invadopodia и тяговое усилие анализы могут быть использованы для изучения инвазивных и сократительные свойства раковых клеток в ответ на матрицу жесткости.

Аннотация

Жесткие ткани опухоли были сильно вовлечены в регулирование миграции раковых клеток и вторжения. Инвазивные миграции через сшитых тканей способствует актин-богатых выступов, называемых invadopodia, что протеолитически ухудшают внеклеточный матрикс (ВКМ). Invadopodia деятельность было показано, что в зависимости от жесткости ECM и сократительных клеток рака сил, предполагая, что жесткость сигналы могут регулировать эти субклеточные структуры, посредством актомиозинового сократительной. Инвазивные и сократительные свойства раковых клеток может быть связано в пробирке с использованием invadopodia и тяговое усилие анализы, основанные на полиакриламидном геле (ЧУК) различных жесткости. Инвазивные и сократительные свойства раковых клеток может быть связано в пробирке с использованием invadopodia и тяговое усилие анализы, основанные на полиакриламидном геле (ЧУК) различных жесткости. В то время как некоторые различия между двумя анализов существуют, протокол, представленные здесь относится к способу создания Paas йна может быть использован в обоих анализах и легко адаптируются к конкретным биологических и технических потребностей пользователя.

Введение

Жесткость опухолеассоциированному ECM была определена в качестве важного фактора в движении злокачественной поведение, увеличивая актомиозина сократимость 1-3. В то время как этот эффект, прежде всего, было продемонстрировано с клетками рака молочной железы, матрица жесткости было обнаружено, чтобы изменить свойства инвазивных клеток, полученных из различных видов рака 4-8 предположить, что жесткость опухоли может играть роль в других типов рака. Чтобы проникнуть сшитых тканей при инвазивной миграции, раковые клетки используют актин-богатых клейкие выступы, известные как invadopodia, что локализовать протеиназ в очаговым ухудшить ECM 9. Invadopodia рассматриваются признаком инвазивных клеток и участвуют в инвазии клеток опухоли и метастазов 10,11. Предыдущая работа показала, что матрица жесткости может регулировать число invadopodia и связанные с деградацией ECM 4,12 через миозина II деятельности и механочувствительных белков 12. УчитываяКорреляция между плотностью опухоли и рак агрессивности 13,14, эти результаты показывают, механизм, с помощью которого раковые клетки могут реагировать на жестких тканей опухоли для управления инвазию и метастазирование через актомиозинового сократимости.

В пробирке ECM жесткости и в естественных плотности ткани, как было показано, чтобы регулировать инвазивной поведение раковых клеток 1,15-17. В то время как актомиозин сократимость представляется важным в этом процессе, в настоящее время исследования конфликтов, чтобы метастатического потенциала коррелирует ли увеличение или уменьшение сократительной силы 6,18-20. Кроме того, остается неизвестным, являются ли эти силы непосредственно посредником invadopodia деятельность 21. Мы недавно обнаружили, что клетки рака сократительные силы зависят от матрицы жесткости и были прогнозирования деградации ЕСМ invadopodia 5. Эти результаты показывают, что сотовые силы могут играть важную роль в прогрессировании рака по посреднические invadopodia переменного токательность в ответ на механические свойства микроокружения опухоли.

Для того, чтобы соотнести инвазивных и сократительные свойства раковых клеток 5, мы изменили протокол для создания PaaS с различной жесткостью, который ранее использовался для исследования жесткости в зависимости от invadopodia деятельность 4,12,22. К химическим сшиванием человеческого фибронектина в плазме в течение всего ЧУК эти модифицированные гидрогели могут быть использованы в качестве основы для обоих invadopodia и тяговое усилие анализов, чтобы гарантировать, что клетки испытывали те же жесткость в обоих экспериментах 5. В invadopodia анализов, фибронектин обеспечивает естественный связывающий домен желатина, чтобы связать наложенное ЕСМ в ЧУК, чтобы обнаружить деградации матрицы. В силу тяги анализов, фибронектин обеспечивает лиганд для прямого клеточной адгезии, чтобы обнаружить микросфер смещения, используемые для расчета сотовой тяговые силы. Этот метод приводит к тому, что мы назвали мягкий, твердый,и жесткие ЧУК, которые связаны с стеклянным дном посуды и имеют модули упругости Е, из 1023, 7307 и 22692 Па 5, которые охватывают диапазон механических свойств, представленных за нормальными и раковыми тканями 23.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка покровные стекла для ЧУК

  1. Чистые 12 мм покровные с низким салфетки волокна.
  2. Пламя мм покровные 12 и 14 мм покровное в микролунку каждого 35 мм со стеклянным дном блюдо, пропуская их через пламени горелки Бунзена с помощью пинцета.
  3. Обработать лунки 200 мкл 0,1 N NaOH в течение 5 мин при комнатной температуре.
  4. Отберите и воздух сухой микролунки в течение 30 мин.
  5. Обработать лунки с 50-100 мкл 3-аминопропилтриметоксисилан в течение 10 мин при комнатной температуре в вытяжном шкафу. Это химическое вещество вступает в реакцию с пластиком; Поэтому, использовать стеклянные пипетки и не заполнять лунки полностью, чтобы избежать контакта с блюдом пластика.
  6. Вымойте лунки с особо чистой воды в течение 10 мин до 3-аминопропилтриметоксисилан не станет ясно.
  7. Промыть лунки сверхчистой водой в два раза с использованием бутыли.
  8. Вымойте лунки с 2 мл сверхчистой воды апри комнатной температуре трет на качалке, установленной на средней скорости (~ 1 Гц) в течение 10 мин.
  9. Отберите и воздух сухой микролунки в течение 30 мин.
  10. Обработать лунки с 2 мл 0,5% раствора глутаральдегида при комнатной температуре на качалке, установленной на средней скорости (~ 1 Гц) в течение 30 мин.
  11. Промыть лунки с 2 мл сверхчистой воды при комнатной температуре на качалке, установленной на средней скорости (~ 1 Гц) в течение 10 мин. Повторите еще два раза в общей сложности 30 мин.
  12. Сухие лунки под крутым углом (60 ° или более) в течение 30 мин.
    Примечание: Блюда могут быть сохранены в течение 2 месяцев в эксикаторе.

2. Подготовка ЧУК для Invadopodia Анализы

  1. Для 1 мл раствора мягкого ПАК (8% акриламида и 0,05% BIS), объединить 200 мкл 40% акриламида, 25 мкл 2% BIS и 574 мкл сверхчистой воды (таблица 1).
  2. Для 1 мл раствора на жестком ПАК (8% акриламида и 0,35% BIS), объединить 200 мкл 40% акриламида, 175 & #181; л 2% БИС, и 409 мкл сверхчистой воды (таблица 1).
  3. Для 1 мл раствора твердого ПАА (12% акриламида и 0,60% BIS), объединить 300 мкл 40% акриламида, 300 мкл 2% BIS и 169 мкл сверхчистой воды (таблица 1).
  4. Дега решения в течение 15 мин. Добавить 200, 215, и 230 мкл 1 мг / мл человеческого фибронектина плазмы в особо чистой воды для мягких, жестких и жестких решений ПАК, соответственно. Для всех решений, добавить 1 мкл 10 мг / мл акриловой кислоты N-гидроксисукцинимида (NHS) эфир, 5 мкл 100 мг / мл персульфата аммония в и 2 мкл N, N, N ', N'-тетраметилэтилендиамина (TEMED ; таблица 1). Смешать с осторожно пипеткой и избежать образования пузырьков в растворах.

ПАК
(1 мл) 		40%
А.А.
(Мкл) 		2%
BIS
(Мкл) 		Ultrapure
Вода
(Мкл) 		1 мг / мл
FN
(Мкл) 		10 мг / мл
NHS эфир
(Мкл) 		100 мг / мл
APS
(Мкл)
TEMED
(Мкл) 		Эластичный
Модуль
(Па)
Мягкий 200 25 574 200 1 5 2 1023
Жесткий 200 175 409 215 1 5 2 7307
Жесткий 300 300 169 230 1 5 2 22692

Таблица 1: Ингредиент VoluМЧС и в результате упругих модулей для мягких, жестких и твердых ЧУК, используемых в invadopodia анализов. AA = акриламид, FN = фибронектин, APS = персульфат аммония.

  1. Пипетировать 8,48 мкл раствора ПАА на центр каждого микролунку.
    Примечание: Этот объем теоретически дает ПАК 75 мкм в толщину.
  2. Осторожно опустите пылали сторону 12 мм покровного стекла капельке в микролунку с помощью пинцета.
  3. Разрешить зажатой решение ПАК для полимеризации в течение 15-30 мин. Проверьте полимеризации путем проверки остатки раствора.
  4. Добавить 2 мл 1x PBS в каждую чашку и удалить 12 мм покровные с помощью пинцета.
    Примечание: 10x PBS, выполнен в лаборатории и состоит из 0,011 М КН 2 РО 4, 1,54 М NaCl, и 0,056 М Na 2 HPO 4.
  5. Промыть лунки с 2 мл 1x PBS при комнатной температуре в течение 5 мин. Повторите еще два раза в общей сложности 15 мин.

3. Pвозмещение ЧУК для Тяговое усилие Анализы

  1. Для 1 мл раствора мягкого ПАК (8% акриламида и 0,05% BIS), объединить 200 мкл 40% акриламида, 25 мкл 2% BIS и 566 мкл сверхчистой воды (таблица 2).
  2. Для 1 мл раствора на жестком ПАК (8% акриламида и 0,35% BIS), объединить 200 мкл 40% акриламида, 175 мкл 2% BIS и 401 мкл сверхчистой воды (таблица 2).
  3. Для 1 мл раствора жесткой ПАК (12% акриламида и 0,60% BIS), объединить 300 мкл 40% акриламида, 300 мкл 2% BIS и 161 мкл сверхчистой воды (таблица 2).
  4. Дега решения в течение 15 мин. Добавить 200, 215, и 230 мкл 1 мг / мл плазмы человека фибронектина в мягких, жестких и жестких решений ПАК, соответственно. Ультразвук 8 мкл 200 нм красный флуоресцентный микросфер (возбуждение / выбросов из 580/605 нм) в течение 30 сек. Для каждого решения, добавить 8 мкл 200 нм красный флуоресцентный микросфер,1 мкл 10 мг / мл акриловой кислоты NHS эфира, 5 мкл 100 мг / мл персульфата аммония в и 2 мкл TEMED (таблица 2). Смешать с осторожно пипеткой и избежать образования пузырьков в растворах.

ПАК
(1 мл) 		40%
А.А.
(Мкл) 		2%
BIS
(Мкл) 		Ultrapure
Вода
(Мкл) 		1 мг / мл
FN
(Мкл)
Микро-сферы
(Мкл) 		10 мг / мл
NHS эфир
(Мкл) 		100 мг / мл
APS
(Мкл)
TEMED
(Мкл) 		Эластичный
Модуль
(Па)
Мягкий 200 25 566 200 8 1 5 2 1023
Жесткий 200 175 401 215 8 1 5 2 7307
Жесткий 300 300 161 230 8 1 5 2 22692

Таблица 2:. Объемы ингредиента и в результате упругих модулей для мягких, жестких и твердых ЧУК, используемых в Тяговое усилие анализов AA = акриламид, FN = фибронектин, APS = персульфат аммония.

  1. Пипетировать 8,48 мкл раствора ПАА на центр каждого микролунку.
    Примечание: Этот объем теоретически дает ПАК 75 мкм в толщину.
  2. Осторожно опустите пылали сторону гоE 12 мм покровное на капли в микролунку с помощью пинцета.
  3. Разрешить зажатой решение ПАК для полимеризации в течение 15-30 мин. Проверьте полимеризации путем проверки остатки раствора.
  4. Добавить 2 мл 1x PBS в каждую чашку и удалить 12 мм покровные с помощью пинцета.
  5. Промыть лунки с 2 мл 1x PBS при комнатной температуре в течение 5 мин. Повторите еще два раза в общей сложности 15 мин.

4. Подготовка контроллера ЭСУД на Invadopodia Анализы

  1. Нагреть раствор желатина (1% желатина и 1% сахарозы) до 37 ° С.
  2. Обработать Paas с 150 мкл раствора желатина в течение 1 мин, затем тщательно аспирата из нижней части лунки при проведении со стеклянным дном тарелки под углом 45 °.
  3. Сушат оставшийся тонкий слой желатина на ЧУК в лунки под крутым углом (60 ° или более), чтобы оптимизировать сушку в течение 60 мин.
  4. Обработать лунки с 2 мл охлажденного 0,5% раствора глутаральдегида на Iсе в течение 15 мин с последующим комнатной температуре в течение 30 мин.
  5. Вымойте лунки с 2 мл 1x PBS в течение 5 мин. Повторите еще два раза в общей сложности 15 мин.
  6. Обработать лунки с 2 мл раствора боргидрида натрия в течение 1 мин. Слегка постучите блюда на скамейке, чтобы удалить пузырьки, которые образуют на поверхности желатина.
  7. Отберите и мыть лунки с 2 мл 1x PBS в течение 5 мин. Повторите еще два раза в общей сложности 15 мин.
  8. Развести в FITC-меченого человеческого фибронектина в плазме решение 50 мкг / мл с 1x PBS и центрифуге при 175000 х г при 4 ° С в течение 15 мин. Либо приобрести имеющийся в продаже с надписью фибронектин или обозначить его следующим образом:
    1. Растворите 5 мг фибронектина в 10 мл боратного буфера (тетрагидратом метабората 170 мм натрия и 40 мМ NaCl) и место в диализной трубке.
    2. Этикетка фибронектин, поместив трубку в 200 мл боратного буфера, содержащего 6 мг растворенного FITC при комнатной температуре с помощью магнитной мешалкиустановлен на минимальное значение в течение 1,5 ч в темноте.
    3. Диализировать с 500 мл 1x PBS с помощью магнитной мешалки, установленной на самом низком уровне в течение 3 дней в темном холодном помещении (4 ° С) с двумя тома меняет день.
    4. Рассчитать FITC-меченного концентрации фибронектина на основе оптической плотности разбавленных аликвоты (1: 200) на длине волны 280 нм и 493 нм в качестве [OD 280 - (0,36 х OD 493)] / 1,4 раза коэффициент разбавления в 200 раз 2 (на долю которого приходится для концентрирования глицерина фибронектин на следующей стадии), в результате чего мг / мл единиц.
    5. Диализировать в течение ночи в 50% -ном растворе глицерина с помощью магнитной мешалки, установленной на самом низком уровне в течение ночи в темном холодном помещении при 4 ° С.)
  9. Обработать лунки с 150 мкл FITC-меченного фибронектина растворе при комнатной температуре в течение 60 мин в темноте.
  10. Тщательно аспирата FITC-меченного фибронектина решение от нижней части лунки при проведении стеклянным дном блюда вугол 45 °, а затем заполнить стеклянным дном блюда с 70% -ным раствором этанола при комнатной температуре в течение 10 мин в темном капот культуре клеток для стерилизации. Также заполнить стеклянным дном тарелки крышки или протрите низких салфеток нибудь вкусненькое, пропитанные 70% этанола.
  11. Вымойте со стеклянным дном блюда, заполняя их с 1x PBS в течение 5 мин. Повторите еще два раза с 2 мл 1x PBS в общей сложности 15 мин.

5. Подготовка и обработка изображений в Invadopodia Анализы

  1. Добавить 25000 раковых клеток в 2 мл среды invadopodia (1: 1 DMEM и RPMI 1640 с 5% сыворотки с низким содержанием белка, 10% фетальной бычьей сыворотки и 20 нг / мл свеже добавленной эпидермального фактора роста) к стеклянным дном посуды и инкубировать в течение ночи.
  2. Аспирируйте и лечения лунки с 2 мл 3,7% раствора параформальдегида при комнатной температуре в темноте в течение 20 мин, чтобы зафиксировать клетки.
  3. После двух быстрых промывок 2 мл 1x PBS, относиться к лунки с 2 мл 0,1% Тритон Х-100 в растворе при комнатной Tempeратура в темноте в течение 5 мин до клетки проницаемыми.
  4. После одной промывки быстрого 2 мл 1x PBS, относиться к лунки с блокирования 3% бычьего сывороточного альбумина раствор при комнатной температуре в темноте в течение 60 мин, чтобы блокировать клетки.
  5. Инкубируйте лунки с 150 мкл мышиного анти-cortactin антитела (1: 750) в блокирующем растворе при комнатной температуре в темноте в течение 60 мин.
  6. Промыть лунки с 2 мл 1x PBS в течение 5 мин. Повторите еще два раза в общей сложности 15 мин.
  7. Инкубируйте лунки со 150 мкл козьего антитела против мышиных антител 633 (1: 500) и 546 фаллоидином (1: 750) в блокирующем растворе при комнатной температуре в темноте в течение 60 мин.
  8. Промыть лунки с 2 мл 1x PBS в течение 5 мин. Повторите еще два раза в общей сложности 15 мин.
  9. Добавьте шесть капель монтажа среды, чтобы заполнить каждый микролуночные и накрыть 22 х 22 покровные.
  10. Cortactin изображений и актина, чтобы определить invadopodia с помощью возбуждения и эмиссии фильтры 632/647 нм и556/570 нм, соответственно, с использованием масляной иммерсии объектив высокой числовой апертурой, 40X на широкого поля инвертированного микроскопа. Кроме того, изображение фибронектин, чтобы определить деградации ECM с помощью возбуждения и испускания фильтр 492/518 нм.

6. Подготовка и обработка изображений силы тяги Анализы

  1. Добавить 15000 раковых клеток в 2 мл среды invadopodia к стеклянным дном посуды и инкубировать в течение ночи.
  2. Аспирируйте среды в стеклянным дном посуды и заменить 2 мл L-15 среды с аналогичными добавками (5% сыворотки с низким содержанием белка, 10% фетальной бычьей сыворотки и 20 нг / мл свеже добавленной эпидермального фактора роста), предварительно -warmed до 37 ° С.
  3. Выдержите стеклянным дном блюда в климатическую камеру на инвертированный микроскоп, предварительно уравновешенную 37 ° C с высокой влажностью в течение 1 часа.
  4. Возьмите четыре наборов изображений с использованием высокой Н.А., 40X объектив на широкоугольный поле инвертированного микроскопа с автоматизированной стадии, чтобы отметить сотовой позиции:
    1. Клетки изображение на кР ЧУК с использованием фазового контраста ("фаза" изображения).
    2. Изображение флуоресцентные микросферы с помощью возбуждения и излучения фильтров 560/645 нм не фокусировки слегка под клеток пока первый слой микросфер в верхней части ЧУК входит в центр ("подчеркнуто" изображение).
    3. Кроме того, фокус на нижней части ЧУК (с использованием микросфер в качестве маркеров) и принимают изображение ("нижний" изображение). Примечание: Цель этого образа для записи Z-позицию, чтобы получить фактическую толщину ПАК в каждом положении для расчетов сила тяги, как описано в представительных результатов.
    4. После того как эти изображения были приобретены в нескольких положениях, осторожно перемешать в 220 мкл 10% Triton-X раствором, чтобы удалить клетки. Микросферы изображение в верхней части ЧУК в каждом положении, как описано выше ("нулевой" изображения).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В invadopodia анализа, invadopodia, как правило, определены колокализации маркеров, таких как актина и cortactin на точечных структур в теле клетки (рисунок 1). Оба активно деградирует и не унижающие invadopodia можно подсчитать и дифференцируются в зависимости от того, эти структуры локализуются с черными районах, где отсутствует флуоресцентный сигнал в FITC-меченого фибронектина (рис 1). Invadopodia вручную пересчитать, и деградация ECM в клетки определяется вручную пороговой эти черн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мы представляем способ изготовления PaaS, которые могут быть использованы в качестве основы для invadopodia и тяговое усилие анализов коррелируют с инвазивными и сократительные сотовой поведения. В то время как ЧУК уже давно привык смотреть на жесткость воздействия на клетки и рассчитать тяговые силы 18,24,27, этот протокол является первым для разработки параллельных анализов, основанных на ЧУК с теми же жесткости соотнести инвазивных и сократительные сотовой поведения в ответ на матрице механические свойства...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Эта работа была поддержана Национальным институтом рака Национального института здоровья в рамках премии номер K25CA143412 (Parekh). Мы хотели бы признать, что дополнительная поддержка была оказана кафедры отоларингологии. Содержание исключительно ответственности авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института здоровья.

Благодарности

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
3-АминопропилтриметоксисиланSigma-Aldrich281778
Акриламид (40%)Bio-Rad161-0140
Акриловая кислота NHS эфирSigma-AldrichA8060готовить свежий в вытяжном шкафу 10 мг/мл в ДМСО
Alexa Fluor 546 фаллоидинLife TechnologiesA22283также можно использовать родамин
персульфат аммонияBio-Rad161-0700приготовить свежий 10% раствор в 1x PBS
Aqua Poly/MountPolysciences18606использовать 6 капель для заполнения микролунок
BIS (2%)Bio-Rad161-0142
Бычий сывороточный альбуминRPIA30075сделать 3% для блокирующего раствора в 1x PBS и хранить в 4 °
C Покровные стекла (12 мм)Fisher Scientific12-545-80
диализная трубкаSigma-AldrichD9777предварительно уравновешивает в боратном буфере на 15 - 30 мин
DMEMCellgro10-013-CVиспользуется для получения инвадоподии среды
DMSOSigma-AldrichD8418используется для получения раствора эфира акриловой кислоты NHS
Эпидермальный фактор ростаLife ТехнологииPHG0311использования для получения инвадоподия среды
ЭтанолPHARMCO-AAPERE200разбавляют сверхчистой водой до 70%
FBSThermo ScientificSH30070.03используют для получения инвадоподии среды
FITCSigma-AldrichF7250защиты от света
ЖелатинPolysciences00639обычно делают 10 мл 1% раствора сахарозы/1% желатина в PBS и хранят при температуре 4°С; C (предварительно нагрейте PBS для легкого растворения желатина)
Стеклянные посуды со дном (покровные стекла 35 мм)MatTekP35G-0-14-Cпокрывающие стекла представляют собой непокрытый
глутаральдегид (25%)Polysciences01909разбавить 1x PBS до 0,5%
Козий антимышиный Alexa Fluor 633 антителоLife TechnologiesA21050
Фибронектин плазмы человекаLife Technologies33016-015Добавьте 5 мл ультрачистой воды, чтобы получилось 1 мг/мл; аликвота в объемах в зависимости от использования для предотвращения чрезмерных циклов замораживания и размораживания
KH2PO4EMD MilliporePX-1565-1использовать для изготовления 10x PBS stock
Мышиный антикортактин 4F11 антителоEMD Millipore05-180
Na2HPO4EMD MilliporeSX-0720-1использовать для изготовления 10x PBS stock
NaClRPIS23020использовать для приготовления 10x PBS бульонного и боратного буфера
NaOH (1 N)Sigma-AldrichS2770разбавить ультрачистой водой до 0,1 Н
Nu-сыворотки (сыворотки с низким содержанием белка)BD Biosciences355500использовать для получения инвадоподии среднего
параформальдегидаAcros416785000обычно делают 10% бульона в 1x PBS, готовят в вытяжном шкафу и добавляют несколько мл крепкого NaOH для легкого растворения параформальдегида, а затем возвращают к pH 7,4 с сильным HCl)
PBS (стерильный)Cellgro21-040-CVиспользуют для клеточной культуры
RPMI 1640Cellgro10-040-CVиспользуют для приготовления инвадоподийной среды
боргидрид натрияSigma-Aldrich452882готовят в свежем виде в вытяжном шкафу 1 мг/мл в 1x PBS
Тетрагидрат метабората натрияSigma-AldrichS0251использовать для приготовления боратного буфера
СахарозуRPIS24060обычно делают 10 мл 1% раствора сахарозы/1% желатина в PBS и хранят при 4 °°; C (предварительно нагрейте PBS для легкого растворения желатина)
TEMEDBio-Rad161-0800
Triton X-100Alfa Aesar AesarA16046сделайте 10% запаса в 1x PBS и используйте как есть для удаления клеток в анализе силы вытяжения или разбавьте 1x PBS для окрашивания

Ссылки

  1. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer cell. 8, 241-254 (2005).
  2. Jaalouk, D. E., Lammerding, J. Mechanotransduction gone awry. Nature. 10, 63-73 (2009).
  3. Paszek, M. J., Weaver, V. M. The tension mounts: mechanics meets morphogenesis and malignancy. Journal of mammary gland biology and neoplasia. 9, 325-342 (2004).
  4. Parekh, A., et al. Sensing and modulation of invadopodia across a wide range of rigidities. Biophysical. 100, 573-582 (2011).
  5. Jerrell, R. J., Parekh, A. Cellular traction stresses mediate extracellular matrix degradation by invadopodia. Acta biomaterialia. 10, 1886-1896 (2014).
  6. Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7, e32572(2012).
  7. Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. C. Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion. Biochemical and biophysical research communications. , (2014).
  8. Haage, A., Schneider, I. C. Cellular contractility and extracellular matrix stiffness regulate matrix metalloproteinase activity in pancreatic cancer cells. FASEB J. , (2014).
  9. Weaver, A. M. Invadopodia: specialized cell structures for cancer invasion. Clinical & experimental metastasis. 23, 97-105 (2006).
  10. Weaver, A. M. Invadopodia. Curr Biol. 18, R362-364 (2008).
  11. Bravo-Cordero, J. J., Hodgson, L., Condeelis, J. Directed cell invasion and migration during metastasis. Current opinion in cell biology. 24, 277-283 (2012).
  12. Alexander, N. R., et al. Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity. Curr Biol. 18, 1295-1299 (2008).
  13. Barlow, W. E., et al. Prospective breast cancer risk prediction model for women undergoing screening mammography. Journal of the National Cancer Institute. 98, 1204-1214 (2006).
  14. Chen, J., et al. Projecting absolute invasive breast cancer risk in white women with a model that includes mammographic density. Journal of the National Cancer Institute. 98, 1215-1226 (2006).
  15. Butcher, D. T., Alliston, T., Weaver, V. M. A tense situation: forcing tumour progression. Nature reviews. Cancer. 9, 108-122 (2009).
  16. Zaman, M. H., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10889-10894 (2006).
  17. Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Keely, P. J. Matrix density-induced mechanoregulation of breast cell phenotype, signaling and gene expression through a FAK-ERK linkage. Oncogene. 28, 4326-4343 (2009).
  18. Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical journal. 80, 1744-1757 (2001).
  19. Rosel, D., et al. Up-regulation of Rho/ROCK signaling in sarcoma cells drives invasion and increased generation of protrusive forces. Mol Cancer Res. 6, 1410-1420 (2008).
  20. Indra, I., et al. An in vitro correlation of mechanical forces and metastatic capacity. Phys Biol. 8, 015015(2011).
  21. Parekh, A., Weaver, A. M. Regulation of cancer invasiveness by the physical extracellular matrix environment. Cell adhesion & migration. 3, 288-292 (2009).
  22. Weaver, A. M., Page, J. M., Guelcher, S. A., Parekh, A. Methods in Molecular Biology in Adhesion Protein Protocols. Coutts, A. S. 1046, 3rd Edition, 171-189 (2013).
  23. Samani, A., Zubovits, J., Plewes, D. Elastic moduli of normal and pathological human breast tissues: an inversion-technique-based investigation of 169 samples). Physics in medicine and biology. 52, 1565-1576 (2007).
  24. Wang, J. H., Lin, J. S. Cell traction force and measurement methods. Biomechanics and modeling in mechanobiology. 6, 361-371 (2007).
  25. Dembo, M., Oliver, T., Ishihara, A., Jacobson, K. Imaging the traction stresses exerted by locomoting cells with the elastic substratum method. Biophysical journal. 70, 2008-2022 (1996).
  26. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical journal. 76, 2307-2316 (1999).
  27. Engler, A. J., Rehfeldt, F., Sen, S., Discher, D. E. Microtissue elasticity: measurements by atomic force microscopy and its influence on cell differentiation. Methods Cell Biol. 83, 521-545 (2007).
  28. Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in cell biology. 83, 29-46 (2007).
  29. Leach, J. B., Brown, X. Q., Jacot, J. G., Dimilla, P. A., Wong, J. Y. Neurite outgrowth and branching of PC12 cells on very soft substrates sharply decreases below a threshold of substrate rigidity. J Neural Eng. 4, 26-34 (2007).
  30. Zhou, J., Kim, H. Y., Wang, J. H., Davidson, L. A. Macroscopic stiffening of embryonic tissues via microtubules, RhoGEF and the assembly of contractile bundles of actomyosin. Development. 137, 2785-2794 (2010).
  31. Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. J Phys Condens Matter. 22, 194116(2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Анализы инвадоподиймиграция раковых клетокжесткость внеклеточного матриксафлуоресцентная микроскопияактивация стеклянных покровных стеколпокрытие фибронектиномсмещение микросфертолщина гидрогеля
Полиакриламидные Гели для Invadopodia и тяговое усилие Анализы на клетках рака
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.