Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Summary

Здесь мы представляем экономически эффективный метод определения химико-генетических взаимодействий в почковающихся дрожжах. Этот подход основан на фундаментальных методах молекулярной биологии дрожжей и хорошо подходит для механистического исследования небольших и средних коллекций химических веществ и других сред.

Abstract

Определение механизма действия биологически активных химических веществ, представляет интерес для широкого круга ученых, фармацевтической и промышленных учреждений. Saccharomyces Cerevisiae или почкованием дрожжи, является модель эукариот, для которых полная коллекция ~ 6000 делеции гена мутантов и Гипоморфные основного гена мутанты являются коммерчески доступными. Эти сборники мутантов может быть использован для систематического выявления химико-гена взаимодействий, т.е. гены, необходимые, чтобы переносить химического вещества. Эта информация, в свою очередь, сообщает о вероятном механизме действия этого соединения. Здесь мы опишем протокол для быстрой идентификации химико-генетических взаимодействий у почкующихся дрожжей. Показано, метод с использованием химиотерапевтического агента 5-фторурацил (5-FU), который имеет четко определенный механизм действия. Наши результаты показывают, что ядерная TRAMP РНК экзосома и ферментов репарации ДНК необходимы для пролиферации в присутствии 5-ФУ, который согласуется с предыдущими мicroarray штрих-кодированием химические генетические подходы и знания, что 5-FU негативно влияет как на РНК и ДНК обмен веществ. Необходимые протоколы проверки этих экранов с высокой пропускной способностью, также описаны.

Introduction

Генетические инструменты и доступные в модельной организма Saccharomyces Cerevisiae ресурсы позволили масштабные функциональной геномики исследований, которые в совокупности обеспечивают новое понимание того, как гены функционируют как сети для выполнения требований биологических систем. Краеугольным камнем этих инструментов была совместная создание полного набора незаменимых генов удалений всех открытых рамок считывания в дрожжах ^1,2. Поразительным наблюдением было то, что только ~ 20% генов дрожжей, необходимые для жизнеспособности при выращивании в гаплоидов в стандартных лабораторных условиях. Это подчеркивает способность клетки к буфера против геномных возмущений за счет использования альтернативных биологических путей. Генетические мутанты, которые являются жизнеспособными индивидуально, но смертельным в сочетании сигнала, подключенных или конвергентные параллельных биологические пути и создавать сети генетического взаимодействия, которые описывают биологическую функцию. С развитием условного Теmperature-чувствительные и гипоморфные аллели важных генов технология не ограничивается изучением несущественных генов ^3,4. Эта концепция была применена в геномной шкале производить объективную карту генетического взаимодействия, иллюстрирующий, как гены, участвующие в подобных клеточных процессов кластер вместе ^5.

Химические возмущения генных сетей мимические генов делеции (Рисунок 1) ^6. Запрос ингибирующее рост соединений против высокой плотности множества штаммов удалений гиперчувствительности идентифицирует профиль химико-генетического взаимодействия, т.е. список генов, которые требуется переносить химическую нагрузку. Как генетических взаимодействий, крупномасштабные экраны химических библиотек, показали, что соединения с аналогичной способ действия кластера вместе ^7. Таким образом, путем создания химико-генетический профиль взаимодействие соединения механизм действия, могут быть установлены путем сравнения его с LARGE масштаб синтетический генетических и химических генетического взаимодействия наборы данных ^8,9.

Крупномасштабные химико-генетический экраны, где множество соединений, опрошенные, были выполнены конкуренции штрих-код анализов. При таком подходе Объединенные коллекции штаммов с делецией выращивают в массе в течение нескольких поколений в небольшом объеме среды, содержащей химическое вещество. Поскольку каждый мутант с делецией таит в себе уникальную генетическую штрих-код, жизнеспособность / рост отдельных мутантов в бассейне штаммов удаление отслеживается микрочипов или высокой пропускной последовательности ^10.

Выведение пригодность мониторинга размеры колоний физически Arrayed мутантов, выращенных на агара, содержащего биологически активного соединения также эффективный метод, чтобы идентифицировать химические-генетических взаимодействий ^11,12. Такой подход обеспечивает экономичную альтернативу к конкурсу на основе отбора и хорошо подходит для опробования небольших библиотек химических веществ.Изложенные здесь просто методология составления перечня химико-генетических взаимодействий в S. Cerevisiae, что не зависит от молекулярной биологии манипуляции или инфраструктуры. Она требует лишь сбор дрожжей удаление, робота или вручную фиксации в аппарат, и свободно доступного программного обеспечения для анализа изображений.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Общая схема этой процедуры указаны на рисунке 2.

1. Определение ингибирующее рост дозы

1. Подготовка дрожжей ночной культуры
   ПРИМЕЧАНИЕ: дрожжи-экстракт-пептон-декстроза рост массовой информации (YEPD) используется в данном протоколе является стандартным рецептом ^13.
   1. Серия из BY4741 (Мата his3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) клеток на YEPD агаром и инкубировать в течение 48 ч при 30 ° С или до видимые колонии образуют.
   2. Подготовка ночных культур путем инокуляции 5 мл жидкой среды YEPD в стерильной культуральной судна с одной колонии. Инкубируют в течение ночи при 30 ° C при непрерывном вращении или встряхивании. Культура, как правило, достигают насыщения к утру (~ 2 × 10 ⁸ клеток / мл).
2. Твердый препарат агаровых средах, содержащих различные химические дозы
   1. Подготовка несколько запасыхимический быть испытана на 100x желаемой конечной концентрации в соответствующем растворителе.
      Примечание: Эффективные концентрации будет зависеть от химических, и должно быть определено эмпирически. Поэтому желательно, чтобы сначала проверить широкий спектр конечная концентрация, то есть от низкой мкМ до высокой мМ.
   2. Для каждой концентрации химических, подлежащих испытанию, аликвоту 3 мл расплавленного агара YEPD к нескольким стерильной культуральной трубки. Место в C водяной бане 55 °, чтобы не укрепляя.
   3. Для каждой концентрации химических веществ, подлежащих испытания добавить 30 мкл 100x соединения расплавленных сред, вихревых 2-3 сек для смешивания и пипетки 1 мл в каждой паре одинаковых скважин в 12-луночного планшета. Не забудьте включить в транспортное средство только контроль. Разрешить пластин для установки в течение ночи при комнатной температуре. Откажитесь от любого дополнительного средства массовой информации.
3. Распространение покрытие клетки
   1. Привить 10 мл жидких сред YEPD с 2 мкл насыщенного дрожжевой культуры, выращивали в течение ночи, как в шаге 1.1.2.
   2. Пластина 25 мкл разведенной культуры дрожжей в хорошо и равномерно распределяется с помощью стерильных стеклянных шариков или стержень, и позволяют пластины для сушки под огня. Инкубируют планшет при 30 ° С в течение 48 ч.
   3. Оценка рост дрожжей (общее количество и размер колоний) на пластины. Выбор сублетальный концентрацию соединения, которая не ингибирует рост, больше, чем 10% -15% для выполнения экрана.

2. Систематическое Химическая генетический скрининг

1. Обслуживание удаления мутантных массива (DMA) и Подготовка источника плиты
   1. Для более подробного описания по строительству на удаление массивов мутантных из запасов глицерина, пожалуйста, обратитесь к Барышникова и др. ^14. После того, как мутанты с делецией были выстроены при плотности 384 колоний на чашку, DMA могут быть сохранены в течение нескольких месяцев при 4 ° С. Репликация на YEPD агар, содержащий 200 мкг / мл G418, который необходим для предотвращения колонии от выращивания другвсе остальные.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько последовательных репликаций следует избегать, чтобы предотвратить потерю медленно растущих штаммов и свести к минимуму появление супрессоров мутантов. Это особенно актуально, если сохранение коллекции, как гаплоидов.
   2. Выполните все шаги реплик обшивки с помощью микробного выстроив роботизированной системы. Кроме того, управлять одел колонии с помощью ручного инструмента пиннинга.
      Примечание: В сборник дрожжевого удаление доступен как гаплоидов и диплоидов из нескольких коммерческих источников, и обычно поставляется в виде запасов глицерина в 96-луночных планшетах.
2. Конденсаторные массив удаление мутантный
   1. Подготовьте 250 мл YEPD агаровой среде, содержащей 200 мкг / мл G418. Эффективная концентрация G418 может изменяться, и каждая серия должна быть проверена эмпирически.
   2. Подготовьте пять YEPD агаром путем заливки 50 мл YEPD агаре, содержащем 200 мкг / мл G418 на пластине. Сделайте это за один день до конденсации массив и позволяют пластины для охлаждения при комнатной температуретературы ночь на плоской ровной поверхности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Четыре пластины будут необходимы для сбора при плотности 1536-деформированное состояние, пятая пластинка выливали в виде дополнительно.
   3. Удалите 16 чашек Петри, содержащих мутантный коллекцию удалить при плотности 384 колоний на чашку и позволяют достичь комнатной температуры (~ 1 ч).
   4. Сотрите конденсата, образовавшуюся на крышке каждой пластины с использованием деликатная задача уничтожить. Невыполнение этого требования может привести к каплями воды осаждается на массиве и перекрестного загрязнения, выстроенных мутантов.
   5. Использование микроорганизмов массива закрепления робота, уплотнять DMA с плотностью 384 колоний на чашку (16 чашек Петри) в 1536 колоний на чашку (4 чашках Петри). Выполните это так, что ^1-й колонии из пластин 1 штифтов грести 1 столбец 1 конденсированного массива, ^1-й колонии пластины 2 в строке 1 колонки 2, ^1-й колонии пластины 3 в строке 2 и столбце 1, и ^1-й колонии пластины 4 в строке 2колонка 2.
   6. Выдержите сводный массив на 30 ° С в течение ночи.
   7. Осмотрите массив для обеспечения равномерного переноса колоний из исходных пластин. Там будет несколько пустых позиций, специально включены в массив, которые служат в качестве руководства для обеспечения DMA были сокращены правильно (рис 4а).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это будет источником пластины для реплик на среде, содержащей исследуемое соединение. Один источник пластина может быть использован для нескольких pinnings. Кроме того, многие роботы будут иметь компенсирующее функцию, которая будет обеспечивать одинаковое число дрожжей, передаются каждый раз.
3. Реплика пластины массив удаление мутант
   1. Подготовка 700 мл управления (машина только) и 700 мл экспериментальной информации (химико-содержащих). Этого достаточно для проведения анализа в трех экземплярах (12 пластин в состоянии, плюс два экстра).
   2. Налейте 50 мл YEPD агар, содержащий химически испытание или контроль за тарелку. Разрешить пластин TO остыть при комнатной температуре в течение ночи на плоской ровной поверхности.
   3. Использование робота реплики пластины, инокуляции DMA на трех наборов пластин, содержащих химические вещества в экспериментально определенной концентрации, а также тремя наборами пластин, содержащих управления транспортным средством. Планшеты инкубируют при комнатной температуре в течение 24-48 ч.

3. рентгенографические пластины и анализ данных

1. Удалить пластины из инкубатора и позволяют им прийти к комнатной температуре (~ 1 час) до изображений. Это позволит предотвратить образование конденсата во время визуализации пластины.
2. Изображение пластины 24 и 48 ч по снятия крышки и размещение лицевой стороной вниз на плоскую сканера постели. Захват изображений с разрешением не менее 300 точек на дюйм. Кроме того, использовать цифровую камеру для захвата изображений. Если этого поместите пластины лицевой стороной вверх на темном фоне и удалить крышки к изображению.
   ПРИМЕЧАНИЕ: формат и позиционирование пластин будет зависеть от программы количественного используется. </li>
3. Выполните количественной оценки и сравнения массивов размеров колонии, используя один из нескольких программ с открытым исходным кодом, в том числе Balony ^15, SGAtools ^16, и ScreenMill ^17.

4. Проверка экрана

ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе несколько дрожжей делеции мутанты набрать как индивидуальной непереносимости химического вещества. Эти химические, генетические взаимодействия должны следующий раз будет подтверждено двумя способами. Во-первых идентичность чувствительных штаммов должно быть подтверждено с помощью ПЦР. Во-вторых, химической чувствительности должны быть независимо забил. Изложенные ниже краткий протокол для выполнения пятнистость анализы для проверки натяжения гиперчувствительность, технику распространены в дрожжевой биологии.

1. Серия из лучшего (повышенной чувствительностью) мутанты с делецией сбора дрожжей на YEPD агаре, содержащем 200 мкг / мл G418. Выдержите при 30 ° С до колонии не образуют. Проверка генотип штамма с помощью диагностического ПЦР с праймерами соответствии спротоколу производителя.
2. Посев 5 мл YEPD жидкости для каждого штамма и инкубировали в течение ночи при 30 ° С с вращением или встряхиванием.
3. Измерьте наружный диаметр ₆₀₀ и разбавить каждого штамма, чтобы OD ₆₀₀ = 1 в стерильной дН ₂ O. Они теперь нормированные культуры дрожжей.
4. Распределить 100 мкл нормированной дикого типа дрожжей (BY4741) культуры хорошо A1 96-луночного планшета. Распределить 100 мкл до семи дополнительных штаммов скважин B1-H1.
5. Используйте многоканальной пипетки обойтись 90 мкл стерильной дН ₂ O в лунки A2-H2 через А6-H6. Наконец, подготовить серию 1:10 разведения нормированных культур дрожжей. Сначала серийно пипетки 10 мкл из колонки 1 в колонку 2 с помощью многоканальной пипетки и продолжают по 96-луночного планшета до шести разведений не производится (т.е. 10 ⁰ до 10 ^-5).
6. Трансфер 2-5 мкл разбавленного дрожжевых культур в сетке, используя многоканальныйпипеттор на YEPD твердых средах, содержащих химические и транспортных средств контроля. Планшеты инкубируют при соответствующей температуре в течение 24-48 ч.
7. Проверьте пластины и сравнить чувствительность некоторых мутантов к химическому (по отношению к BY4741 управления). Изображение пластины 24 и 48 ч, как и в шаге 3.2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При идентификации нескольких сверхчувствительных штаммов со связанными онтологий генов или функций придает уверенность в справедливости экрана, трансформация гиперчувствительной удаления штамма плазмиды, содержащей дикого типа копии гена необходимо официально установить, что геном удаление интерес (и не скрытые мутации второй сайт) вызывает лекарственной чувствительности.

Representative Results

Discussion

Изложенные здесь подход для создания химико-генетических профилей взаимодействия. Метод прост: путем сравнения размеров колонии каждого из штаммов в полных коллекций делеции гена в присутствии и в отсутствие химической, все гены, необходимые, чтобы переносить химическую инсульт определены. Анализ обогащение Краткое полученного списка чувствительных штаммов могут быть использованы, чтобы дать представление о режиме химических веществ действий. В то время как этот протокол был оптимизирован для начинающих дрожжи, оно также может быть адаптирован для использования с другими одел микробных коллекций удаление, таких как E. палочка Кейо коллекции, которая была успешно использована для исследования сотни сотовой возмущений ^26,27.

Химическая-генетический профилирование в дрожжах и других организмов хорошо известно. Большинство из этих исследований опирались на соискание анализов, которые количественно объединенных делеционных мутантов с помощью анализа микрочипов или высокой пропускной sequencing уникальных генетических штрих-кодов. Такой подход оказался успешным в производстве надежных химико-генетических профилей больших химических библиотек. Методика описана здесь обеспечивает полезную альтернативу для химико-генетический анализ меньшим числом испытуемых соединений. Анализ обеспечивает простой считывание, которое меньше, чем стоимость непомерно высокой пропускной последовательности или анализа микрочипов и не страдают от смещения последовательности. В то время как протокол, как описано требует роботизированным инструментом для колонии манипуляции, такие системы становятся все более доступными и, поочередно протокол может быть скорректирована для использования с ручными инструментами закрепления, примеры которых были включены в список материалов.

Важно быть в курсе ограничений этого подхода и химической генетического профилирования в целом. Во-первых, соединение должно оказывать влияние на жизнеспособность в многообещающий дрожжей, или удельная организм быть использованы. В то время как многие фундаментальные биологические процессыи функции хорошо сохраняется среди эукариот, организм конкретные химические генетические взаимодействия могут варьироваться в широких пределах, так же как и поглощение химических веществ в клетки. Следует также отметить, что несколько штаммов удаление было обнаружено, что быть чувствительны к лекарственной терапии несколькими ^8. Они включают в себя гены, участвующие в оттоке наркотиков, вакуолярной функции и целостность мембраны. Важно учитывать множественной лекарственной устойчивости, когда делать выводы в отношении прямых и косвенных способов действия.

Экран, описанный здесь проводили с использованием гаплоидный набор удаление, общий подход к химико-генетического анализа в дрожжах. Есть теперь несколько сборников мутантах дрожжей, доступных для дальнейшей помощи в определении режима химическое соединение в действия. Это включает в себя не только полный гомозиготную и гетерозиготных диплоидных коллекции удаление, но также условные основного гена мутантов чувствительные к температуре, DecreAsed изобилии мРНК возмущений (влажной) дрожжей мутанта библиотекой, а также синтетического гистона H3 и H4 мутанта коллекции, которые могли бы быть использованы для исследования эпигенетических основе молекулярных методов лечения ^3,4,28, учитывая невероятную глубину из имеющихся инструментов, простота Методология, и ограниченный инфраструктуры, необходимой, этот подход обеспечивает доступной форме доступа богатый функциональную информацию относительно механизма химического состава.

Materials

Yeast Extract	BioBasic	G0961	For YEPD liquid/solid media add to 1% final concentration (w/v)
Tyrptone Powder	BD Biosciences	211820	For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v)
Dextrose	Anachemia	31096-380	For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) — do not autoclave. Prepare 20% stock solution, filter sterilize, and add to media after autoclaving.
Agar A	Bio Basic	FB0010	For YEPD solid media add to 2% final concentration (w/v)
G418	A.G. Scientific Inc.	G-1033	Prepare 1,000x stock at 200&nbsp;mg/ml in dH<sub>2</sub>O and filter sterilize.&nbsp;
12-well plate	Greiner Bio One	655180
5 ml culture tubes	Evergreen Scientific	222-2376-080
10 cm Petri Dish	VWR	25384-302
ROTOR HDA	Singer Instruments&nbsp;	ROT-001	high-throughput microbial array pinning robot
PLUSPLATE&copy; Petri Dish	Singer Instruments&nbsp;	PLU-001	Box of 200 dishes
384 Short-Pin RePad	Singer Instruments&nbsp;	RP-MP-384	Box of 1,000 pads
1536 Short-Pin RePad	Singer Instruments&nbsp;	RP-MP-1536	Box of 1,000 pads
Alternative Pinning Tools:
Fully Automated Robtic Systems	S&amp;P robotics	http://www.sprobotics.com	Several automated colony handling robitic and imagining systems available.
Manual Pinning Tools	V&amp;P Scientific	http://www.vp-scientific.com	Handheld replication tools and accessories.&nbsp;