Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Быстрая идентификация химических генетических взаимодействий в

9.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52345

⸱

5 апреля 2015 г.

 , 
1Department of Biochemistry and Microbiology, University of Victoria

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем экономически эффективный метод определения химико-генетических взаимодействий в почковающихся дрожжах. Этот подход основан на фундаментальных методах молекулярной биологии дрожжей и хорошо подходит для механистического исследования небольших и средних коллекций химических веществ и других сред.

Аннотация

Определение механизма действия биологически активных химических веществ, представляет интерес для широкого круга ученых, фармацевтической и промышленных учреждений. Saccharomyces Cerevisiae или почкованием дрожжи, является модель эукариот, для которых полная коллекция ~ 6000 делеции гена мутантов и Гипоморфные основного гена мутанты являются коммерчески доступными. Эти сборники мутантов может быть использован для систематического выявления химико-гена взаимодействий, т.е. гены, необходимые, чтобы переносить химического вещества. Эта информация, в свою очередь, сообщает о вероятном механизме действия этого соединения. Здесь мы опишем протокол для быстрой идентификации химико-генетических взаимодействий у почкующихся дрожжей. Показано, метод с использованием химиотерапевтического агента 5-фторурацил (5-FU), который имеет четко определенный механизм действия. Наши результаты показывают, что ядерная TRAMP РНК экзосома и ферментов репарации ДНК необходимы для пролиферации в присутствии 5-ФУ, который согласуется с предыдущими мicroarray штрих-кодированием химические генетические подходы и знания, что 5-FU негативно влияет как на РНК и ДНК обмен веществ. Необходимые протоколы проверки этих экранов с высокой пропускной способностью, также описаны.

Введение

Генетические инструменты и доступные в модельной организма Saccharomyces Cerevisiae ресурсы позволили масштабные функциональной геномики исследований, которые в совокупности обеспечивают новое понимание того, как гены функционируют как сети для выполнения требований биологических систем. Краеугольным камнем этих инструментов была совместная создание полного набора незаменимых генов удалений всех открытых рамок считывания в дрожжах 1,2. Поразительным наблюдением было то, что только ~ 20% генов дрожжей, необходимые для жизнеспособности при выращивании в гаплоидов в стандартных лабораторных условиях. Это подчеркивает способность клетки к буфера против геномных возмущений за счет использования альтернативных биологических путей. Генетические мутанты, которые являются жизнеспособными индивидуально, но смертельным в сочетании сигнала, подключенных или конвергентные параллельных биологические пути и создавать сети генетического взаимодействия, которые описывают биологическую функцию. С развитием условного Теmperature-чувствительные и гипоморфные аллели важных генов технология не ограничивается изучением несущественных генов 3,4. Эта концепция была применена в геномной шкале производить объективную карту генетического взаимодействия, иллюстрирующий, как гены, участвующие в подобных клеточных процессов кластер вместе 5.

Химические возмущения генных сетей мимические генов делеции (Рисунок 1) 6. Запрос ингибирующее рост соединений против высокой плотности множества штаммов удалений гиперчувствительности идентифицирует профиль химико-генетического взаимодействия, т.е. список генов, которые требуется переносить химическую нагрузку. Как генетических взаимодействий, крупномасштабные экраны химических библиотек, показали, что соединения с аналогичной способ действия кластера вместе 7. Таким образом, путем создания химико-генетический профиль взаимодействие соединения механизм действия, могут быть установлены путем сравнения его с LARGE масштаб синтетический генетических и химических генетического взаимодействия наборы данных 8,9.

Крупномасштабные химико-генетический экраны, где множество соединений, опрошенные, были выполнены конкуренции штрих-код анализов. При таком подходе Объединенные коллекции штаммов с делецией выращивают в массе в течение нескольких поколений в небольшом объеме среды, содержащей химическое вещество. Поскольку каждый мутант с делецией таит в себе уникальную генетическую штрих-код, жизнеспособность / рост отдельных мутантов в бассейне штаммов удаление отслеживается микрочипов или высокой пропускной последовательности 10.

Выведение пригодность мониторинга размеры колоний физически Arrayed мутантов, выращенных на агара, содержащего биологически активного соединения также эффективный метод, чтобы идентифицировать химические-генетических взаимодействий 11,12. Такой подход обеспечивает экономичную альтернативу к конкурсу на основе отбора и хорошо подходит для опробования небольших библиотек химических веществ.Изложенные здесь просто методология составления перечня химико-генетических взаимодействий в S. Cerevisiae, что не зависит от молекулярной биологии манипуляции или инфраструктуры. Она требует лишь сбор дрожжей удаление, робота или вручную фиксации в аппарат, и свободно доступного программного обеспечения для анализа изображений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Общая схема этой процедуры указаны на рисунке 2.

1. Определение ингибирующее рост дозы

  1. Подготовка дрожжей ночной культуры
    ПРИМЕЧАНИЕ: дрожжи-экстракт-пептон-декстроза рост массовой информации (YEPD) используется в данном протоколе является стандартным рецептом 13.
    1. Серия из BY4741 (Мата his3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) клеток на YEPD агаром и инкубировать в течение 48 ч при 30 ° С или до видимые колонии образуют.
    2. Подготовка ночных культур путем инокуляции 5 мл жидкой среды YEPD в стерильной культуральной судна с одной колонии. Инкубируют в течение ночи при 30 ° C при непрерывном вращении или встряхивании. Культура, как правило, достигают насыщения к утру (~ 2 × 10 8 клеток / мл).
  2. Твердый препарат агаровых средах, содержащих различные химические дозы
    1. Подготовка несколько запасыхимический быть испытана на 100x желаемой конечной концентрации в соответствующем растворителе.
      Примечание: Эффективные концентрации будет зависеть от химических, и должно быть определено эмпирически. Поэтому желательно, чтобы сначала проверить широкий спектр конечная концентрация, то есть от низкой мкМ до высокой мМ.
    2. Для каждой концентрации химических, подлежащих испытанию, аликвоту 3 мл расплавленного агара YEPD к нескольким стерильной культуральной трубки. Место в C водяной бане 55 °, чтобы не укрепляя.
    3. Для каждой концентрации химических веществ, подлежащих испытания добавить 30 мкл 100x соединения расплавленных сред, вихревых 2-3 сек для смешивания и пипетки 1 мл в каждой паре одинаковых скважин в 12-луночного планшета. Не забудьте включить в транспортное средство только контроль. Разрешить пластин для установки в течение ночи при комнатной температуре. Откажитесь от любого дополнительного средства массовой информации.
  3. Распространение покрытие клетки
    1. Привить 10 мл жидких сред YEPD с 2 мкл насыщенного дрожжевой культуры, выращивали в течение ночи, как в шаге 1.1.2.
    2. Пластина 25 мкл разведенной культуры дрожжей в хорошо и равномерно распределяется с помощью стерильных стеклянных шариков или стержень, и позволяют пластины для сушки под огня. Инкубируют планшет при 30 ° С в течение 48 ч.
    3. Оценка рост дрожжей (общее количество и размер колоний) на пластины. Выбор сублетальный концентрацию соединения, которая не ингибирует рост, больше, чем 10% -15% для выполнения экрана.

2. Систематическое Химическая генетический скрининг

  1. Обслуживание удаления мутантных массива (DMA) и Подготовка источника плиты
    1. Для более подробного описания по строительству на удаление массивов мутантных из запасов глицерина, пожалуйста, обратитесь к Барышникова и др. 14. После того, как мутанты с делецией были выстроены при плотности 384 колоний на чашку, DMA могут быть сохранены в течение нескольких месяцев при 4 ° С. Репликация на YEPD агар, содержащий 200 мкг / мл G418, который необходим для предотвращения колонии от выращивания другвсе остальные.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько последовательных репликаций следует избегать, чтобы предотвратить потерю медленно растущих штаммов и свести к минимуму появление супрессоров мутантов. Это особенно актуально, если сохранение коллекции, как гаплоидов.
    2. Выполните все шаги реплик обшивки с помощью микробного выстроив роботизированной системы. Кроме того, управлять одел колонии с помощью ручного инструмента пиннинга.
      Примечание: В сборник дрожжевого удаление доступен как гаплоидов и диплоидов из нескольких коммерческих источников, и обычно поставляется в виде запасов глицерина в 96-луночных планшетах.
  2. Конденсаторные массив удаление мутантный
    1. Подготовьте 250 мл YEPD агаровой среде, содержащей 200 мкг / мл G418. Эффективная концентрация G418 может изменяться, и каждая серия должна быть проверена эмпирически.
    2. Подготовьте пять YEPD агаром путем заливки 50 мл YEPD агаре, содержащем 200 мкг / мл G418 на пластине. Сделайте это за один день до конденсации массив и позволяют пластины для охлаждения при комнатной температуретературы ночь на плоской ровной поверхности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Четыре пластины будут необходимы для сбора при плотности 1536-деформированное состояние, пятая пластинка выливали в виде дополнительно.
    3. Удалите 16 чашек Петри, содержащих мутантный коллекцию удалить при плотности 384 колоний на чашку и позволяют достичь комнатной температуры (~ 1 ч).
    4. Сотрите конденсата, образовавшуюся на крышке каждой пластины с использованием деликатная задача уничтожить. Невыполнение этого требования может привести к каплями воды осаждается на массиве и перекрестного загрязнения, выстроенных мутантов.
    5. Использование микроорганизмов массива закрепления робота, уплотнять DMA с плотностью 384 колоний на чашку (16 чашек Петри) в 1536 колоний на чашку (4 чашках Петри). Выполните это так, что 1-й колонии из пластин 1 штифтов грести 1 столбец 1 конденсированного массива, 1-й колонии пластины 2 в строке 1 колонки 2, 1-й колонии пластины 3 в строке 2 и столбце 1, и 1-й колонии пластины 4 в строке 2колонка 2.
    6. Выдержите сводный массив на 30 ° С в течение ночи.
    7. Осмотрите массив для обеспечения равномерного переноса колоний из исходных пластин. Там будет несколько пустых позиций, специально включены в массив, которые служат в качестве руководства для обеспечения DMA были сокращены правильно (рис 4а).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это будет источником пластины для реплик на среде, содержащей исследуемое соединение. Один источник пластина может быть использован для нескольких pinnings. Кроме того, многие роботы будут иметь компенсирующее функцию, которая будет обеспечивать одинаковое число дрожжей, передаются каждый раз.
  3. Реплика пластины массив удаление мутант
    1. Подготовка 700 мл управления (машина только) и 700 мл экспериментальной информации (химико-содержащих). Этого достаточно для проведения анализа в трех экземплярах (12 пластин в состоянии, плюс два экстра).
    2. Налейте 50 мл YEPD агар, содержащий химически испытание или контроль за тарелку. Разрешить пластин TO остыть при комнатной температуре в течение ночи на плоской ровной поверхности.
    3. Использование робота реплики пластины, инокуляции DMA на трех наборов пластин, содержащих химические вещества в экспериментально определенной концентрации, а также тремя наборами пластин, содержащих управления транспортным средством. Планшеты инкубируют при комнатной температуре в течение 24-48 ч.

3. рентгенографические пластины и анализ данных

  1. Удалить пластины из инкубатора и позволяют им прийти к комнатной температуре (~ 1 час) до изображений. Это позволит предотвратить образование конденсата во время визуализации пластины.
  2. Изображение пластины 24 и 48 ч по снятия крышки и размещение лицевой стороной вниз на плоскую сканера постели. Захват изображений с разрешением не менее 300 точек на дюйм. Кроме того, использовать цифровую камеру для захвата изображений. Если этого поместите пластины лицевой стороной вверх на темном фоне и удалить крышки к изображению.
    ПРИМЕЧАНИЕ: формат и позиционирование пластин будет зависеть от программы количественного используется.
  3. Выполните количественной оценки и сравнения массивов размеров колонии, используя один из нескольких программ с открытым исходным кодом, в том числе Balony 15, SGAtools 16, и ScreenMill 17.

4. Проверка экрана

ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе несколько дрожжей делеции мутанты набрать как индивидуальной непереносимости химического вещества. Эти химические, генетические взаимодействия должны следующий раз будет подтверждено двумя способами. Во-первых идентичность чувствительных штаммов должно быть подтверждено с помощью ПЦР. Во-вторых, химической чувствительности должны быть независимо забил. Изложенные ниже краткий протокол для выполнения пятнистость анализы для проверки натяжения гиперчувствительность, технику распространены в дрожжевой биологии.

  1. Серия из лучшего (повышенной чувствительностью) мутанты с делецией сбора дрожжей на YEPD агаре, содержащем 200 мкг / мл G418. Выдержите при 30 ° С до колонии не образуют. Проверка генотип штамма с помощью диагностического ПЦР с праймерами соответствии спротоколу производителя.
  2. Посев 5 мл YEPD жидкости для каждого штамма и инкубировали в течение ночи при 30 ° С с вращением или встряхиванием.
  3. Измерьте наружный диаметр 600 и разбавить каждого штамма, чтобы OD 600 = 1 в стерильной дН 2 O. Они теперь нормированные культуры дрожжей.
  4. Распределить 100 мкл нормированной дикого типа дрожжей (BY4741) культуры хорошо A1 96-луночного планшета. Распределить 100 мкл до семи дополнительных штаммов скважин B1-H1.
  5. Используйте многоканальной пипетки обойтись 90 мкл стерильной дН 2 O в лунки A2-H2 через А6-H6. Наконец, подготовить серию 1:10 разведения нормированных культур дрожжей. Сначала серийно пипетки 10 мкл из колонки 1 в колонку 2 с помощью многоканальной пипетки и продолжают по 96-луночного планшета до шести разведений не производится (т.е. 10 0 до 10 -5).
  6. Трансфер 2-5 мкл разбавленного дрожжевых культур в сетке, используя многоканальныйпипеттор на YEPD твердых средах, содержащих химические и транспортных средств контроля. Планшеты инкубируют при соответствующей температуре в течение 24-48 ч.
  7. Проверьте пластины и сравнить чувствительность некоторых мутантов к химическому (по отношению к BY4741 управления). Изображение пластины 24 и 48 ч, как и в шаге 3.2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При идентификации нескольких сверхчувствительных штаммов со связанными онтологий генов или функций придает уверенность в справедливости экрана, трансформация гиперчувствительной удаления штамма плазмиды, содержащей дикого типа копии гена необходимо официально установить, что геном удаление интерес (и не скрытые мутации второй сайт) вызывает лекарственной чувствительности.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В проверке этого подхода мы провели характерную химическую генетический экран взаимодействия химиотерапевтического средства 5-фторурацил (5-FU) после описанной выше протокола. 5-ФУ, как известно, разрушают тимидилатсинтазы, а также метаболизма ДНК и РНК 18. Химические генетические взаимодействия 5-ФУ хорошо изучены и исследованы методами дрожжи штрих-код микрочипов с использованием как гетерозиготные и гомозиготные коллекции удаления, 8,19. Здесь показано, что аналогичные результаты могут быть полу...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Изложенные здесь подход для создания химико-генетических профилей взаимодействия. Метод прост: путем сравнения размеров колонии каждого из штаммов в полных коллекций делеции гена в присутствии и в отсутствие химической, все гены, необходимые, чтобы переносить химическую инсульт определены. Анализ обогащение Краткое полученного списка чувствительных штаммов могут быть использованы, чтобы дать представление о режиме химических веществ действий. В то время как этот протокол был оптимизирован для начинающих дрожжи, оно такж...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Исследования в лаборатории CJN поддерживается операционными грантов NSERC, Научно-исследовательского института Канады общества рака (CCSRI), и Канадский Фонд рака молочной железы (BC-Юкон филиал).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Дрожжевой экстрактBioBasicG0961Для жидких/твердых сред YEPD добавить до 1% конечной концентрации (w/v)
Порошок тирптонаBD Biosciences211820Для жидких/твердых сред YEPD добавить до 2% конечной концентрации (w/v)
ДекстрозаAnachemia31096-380Для жидких/твердых сред YEPD добавить до 2% конечной концентрации (w/v) — Не автоклавировать. Приготовьте 20% исходный раствор, процедите стерилизуйте и добавьте в среду после автоклавирования.
Agar ABio BasicFB0010Для твердых сред YEPD добавить до 2% конечной концентрации (w/v)
G418A.G. Scientific Inc.G-1033Подготовить 1,000x запас по 200  мг/мл в dH2O и стерилизация фильтром. 
12-луночный планшетGreiner Bio One655180
5 мл пробирки для культивированияEvergreen Scientific222-2376-080
10 см Чашка ПетриVWR25384-302
ROTORHDA Singer Instruments ROT-001высокопроизводительный робот для закрепления микробиологических матриц
PLUSPLATE© Petri DishSinger Instruments PLU-001Коробка из 200 тарелок
384 Короткий штифт RePadSinger Instruments RP-MP-384Коробка из 1 000 пэдов
1536 Короткоконтактный RePadSinger Instruments RP-MP-1536Коробка из 1 000 прокладок
Альтернативные инструменты для закрепления:
Полностью автоматизированные Robtic SystemsS& P робототехникаhttp://www.sprobotics.comДоступно несколько автоматизированных систем обработки колоний, робитов и воображения.
Инструменты для ручного закрепления& P Scientifichttp://www.vp-scientific.comРучные инструменты и аксессуары для репликации. 
V

Ссылки

  1. Giaever, G., et al. Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 418, 387-391 (2002).
  2. Winzeler, E. A., et al. Functional characterization of the S. cerevisiae genome by gene deletion and parallel analysis. Science. 285, 901-906 (1999).
  3. Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat Methods. 5, 711-718 (2008).
  4. Li, Z., et al. Systematic exploration of essential yeast gene function with temperature-sensitive mutants. Nat Biotechnol. 29, 361-367 (2011).
  5. Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327, 425-431 (2010).
  6. Parsons, A. B., et al. Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways. Nat Biotechnol. 22, 62-69 (2004).
  7. Parsons, A. B., et al. Exploring the mode-of-action of bioactive compounds by chemical-genetic profiling in yeast. Cell. 126, 611-625 (2006).
  8. Hillenmeyer, M. E., et al. The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes. Science. 320, 362-365 (2008).
  9. Hillenmeyer, M. E., et al. Systematic analysis of genome-wide fitness data in yeast reveals novel gene function and drug action. Genome Biol. 11, R30(2010).
  10. Smith, A. M., et al. Competitive genomic screens of barcoded yeast libraries. J Vis Exp. (54), (2011).
  11. Bowie, D., Parvizi, P., Duncan, D., Nelson, C. J., Fyles, T. M. Chemical-genetic identification of the biochemical targets of polyalkyl guanidinium biocides. Organic & Biomolecular Chemistry. 11, 4359-4366 (2013).
  12. Alamgir, M., Erukova, V., Jessulat, M., Azizi, A., Golshani, A. Chemical-genetic profile analysis of five inhibitory compounds in yeast. BMC Chem Biol. 10 (6), (2010).
  13. Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. Cold Spring Harbor Laboratory. Methods In Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2005).
  14. Baryshnikova, A., et al. Synthetic genetic array (SGA) analysis in Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Methods Enzymol. 470, 145-179 (2010).
  15. Young, B. P., Loewen, C. J. Balony: a software package for analysis of data generated by synthetic genetic array experiments. BMC Bioinformatics. 14, 354(2013).
  16. Wagih, O., et al. SGAtools: one-stop analysis and visualization of array-based genetic interaction screens. Nucleic Acids Res. 41, W591-W596 (2013).
  17. Dittmar, J. C., Reid, R. J., Rothstein, R. ScreenMill: a freely available software suite for growth measurement, analysis and visualization of high-throughput screen data. BMC Bioinformatics. 11, 353(2010).
  18. Longley, D. B., Harkin, D. P., Johnston, P. G. 5-fluorouracil: mechanisms of action and clinical strategies. Nat Rev Cancer. 3, 330-338 (2003).
  19. Lum, P. Y., et al. Discovering modes of action for therapeutic compounds using a genome-wide screen of yeast heterozygotes. Cell. 116, 121-137 (2004).
  20. Toussaint, M., Conconi, A. High-throughput and sensitive assay to measure yeast cell growth: a bench protocol for testing genotoxic agents. Nat Protoc. 1, 1922-1928 (2006).
  21. Robinson, M. D., Grigull, J., Mohammad, N., Hughes, T. R. FunSpec: a web-based cluster interpreter for yeast. BMC Bioinformatics. 3, 35(2002).
  22. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4, 44-57 (2009).
  23. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37, 1-13 (2009).
  24. Hong, E. L., et al. Gene Ontology annotations at SGD: new data sources and annotation methods. Nucleic Acids Res. 36, D577-D581 (2008).
  25. Fang, F., Hoskins, J., Butler, J. S. 5-fluorouracil enhances exosome-dependent accumulation of polyadenylated rRNAs. Mol Cell Biol. 24, 10766-10776 (2004).
  26. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol Syst Biol. 2, 0008(2006).
  27. Nichols, R. J., et al. Phenotypic landscape of a bacterial cell. Cell. 144, 143-156 (2011).
  28. Dai, J., et al. Probing nucleosome function: a highly versatile library of synthetic histone H3 and H4 mutants. Cell. 134, 1066-1078 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Быстрая идентификация химических генетических взаимодействий в
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.