Методическая статья

Методов оценки цитотоксичности и подавления иммунитета горючих Табачные компонентов Продукт

DOI:

10.3791/52351

⸱

10 января 2015 г.

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Wake Forest University Health Sciences, 2R&D Department, R.J. Reynolds Tobacco Company

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Используя оптимизированные анализы мононуклеарных клеток периферической крови человека (PBMC) ex vivo, мы показали, что препарат горючего табачного изделия заметно подавляет рецептор-опосредованные внутриклеточные секретируемые цитокины и цитолитическую способность эффекторных PBMC. Эти быстрые анализы могут быть полезны для оценки продукта и понимания потенциальных долгосрочных последствий воздействия табака.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Среди других патофизиологических изменений, хроническое воздействие табачного дыма вызывает воспаление и подавление иммунитета, которые были связаны с повышенной восприимчивостью курильщиков микробных инфекций и возникновения опухолей. Экс естественных подавление рецепторов-опосредованной иммунной реакции в мононуклеарных клетках периферической крови человека (РВМС) обрабатывали компонентов дыма является привлекательным подходом для изучения механизмов и оценки вероятных долгосрочных последствий воздействия табачных изделий. Здесь мы оптимизировали методы для выполнения экс анализов крысах с МНПК, стимулированных бактериального липополисахарида, в Toll-подобных рецепторов 4 лиганда. Последствия всего табачного дыма кондиционированной среды (WS-КМ), подготовка горючих табачных изделий (ТЭС) и никотин были исследованы на секрецию цитокинов и убийства клетки-мишени путем МНПК в бывших естественных условиях анализов. Показано, что цитокины, секретируемые IFN-γ, TNF, IL-10, IL-6, и IL-8 и внутриклеточные цитокины IFN-47 ;, TNF-α и MIP-1α были подавлены в WS-CM-инфицированными МНПК. Цитолитическая функции эффекторных РВМС, как определено в К562 клеток-мишеней погибли анализа также была снижена путем воздействия WS-МС; Никотин минимально эффективными в этих анализах. Таким образом, мы представляем набор усовершенствованных анализов для оценки последствий ТЭС в бывших естественных условиях анализов, и эти методы могут быть легко адаптированы для тестирования других продуктов, представляющих интерес.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Значительный объем пунктов знаний к неблагоприятным последствиям для здоровья хронического курения сигарет, в том числе сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) и рак 1,2. Хронический курение, как известно, вызывают воспаление и подавление иммунитета, и эти изменения отражаются внести свой ​​вклад с повышенным риском микробной инфекции и рака у курильщиков 3. В пробирке и бывших естественных условиях методы полезны при выяснении молекулярных основ патофизиологических эффектов сигаретный дым 4-9 (Таблица 1), и признаются в качестве важных инструментов для направления формирующегося регулирование различных табачных изделий 10,11.

Например, мы показали, что горючие вещества табачных изделий (ТЭС), такие как всей табачного дыма кондиционированной среды (WS-КМ) и общей твердых частиц (TPM) значительно более токсичным и разрушительным дляДНК, чем негорючих ТЭС или никотина 12,13. В соответствии с опубликованной работы, это было недавно сообщили, что горючие ТЭС или никотин 12,13. В соответствии с опубликованной работы, мы недавно сообщили, что горючие ТЭС вызвало заметное подавление иммунитета. Это свидетельствует подавлением Toll- подобный рецептор (TLR) -ligands, секрецию цитокинов и клеток-мишеней (K562) убийство по МНПК в Экс Vivo модели 14. Учитывая значимость воспаления в сигаретном болезненных процессов дыма, вызванного, дальнейшая оптимизация условий анализа для оценки иммунной модулирующие эффекты сигаретного дыма представлены в данном отчете.

Экс естественных условиях анализы обычно измеряют внутриклеточный и секретируется цитокины, а также цитолитическую функцию цитотоксических Т и NK клеток в К562 гибели клеток анализы 14. Анализы участвует предварительной инкубации с WS-МС и никотина и последующей стимуляцией РВМСс с TLR агонистов в течение 3 дней; окончательные показания выполняются с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) и / или проточной цитометрии. Мы использовали бактериального липополисахарида (ЛПС), который связывается с TLR-4 рецепторов и стимулирует РВМС в результате чего производство внутриклеточных цитокинов и секреции цитокинов. В дополнение к оптимизации различных аналитических шагов для оценки иммуномодулирующее действие ТЭС, мы также представляем методы выделения МНПК гибель клеток анализов и IL-8 количественной оценке. Эти методы могут быть применены для решения других вопросов исследования и уточнены оценки табачные изделия в контексте регулирования.

Таблица 1. Опубликованные отчеты в пробирке и бывших естественных условиях методы, используемые для изучения varilus патофизиологические эффекты препаратов табачных изделий CS, сигаретный дым средой.; CSC, сигаретный дым конденсата; CSE, сигаретный дым экстракт; ELISA, иммуноферментный анализ; GADPH, глицеральдегид 3-фосфатдегидрогеназы; КПЦР, количественной полимеразной цепной реакции; RT, в режиме реального времени количественной полимеразной цепной реакции; TS, табачного дыма.

Автор (год обучения) Лан и др. (2004) Муди и др. (2004) Олтманс и др. (2005) Vayssier (1998) Witherden и др. (2004) Birrell и др. (2008)
Клетки используется Человека бронхиальных клеток эндотелия (BEAS-2B), нейтрофилы человека Человека эпителиальные клетки (А549) Гладкой мускулатуры дыхательных путей клетки человека (HASMC) Человека premonocytic U937 клетки, моноциты человека Альвеолярного типа II эпителиальные клетки (ATII) Человек моноцитовклеточной линии (ТНР-1), легочные макрофаги человека
ТЭЦ используется CSE CSC CSE TS CSE CS
Метод, используемый ИФА, КПЦР, миграция, электромобилей сдвиг Immunohisto, автохимия, электрофорез, ArrayScan комплект, RT-PCR, ELISA ИФА, ПЦР, КПЦР, электрофорез Сдвиг гель-мобильность Световая микроскопия, электронная микроскопия, электрофорез, ELISA КПЦР, ИФА, E-toxate комплект (Sigma), p65 планшете (TransAm), электрофорез, различные наборы для иммуноанализа
Мера ИЛ-8, GM-CF, AP-1, NF-kB, миграция Гистонов ацетилтрансферазы, гистондезацетилаз, NF-kB, IL-8, П. И. κB-α, GADPH HO-1, GADPH, RANTES, ИЛ-8, эотаксин Тепловой шок / стрессовые белки (HSP / Hsp70), HF транскрипционный фактор, NF-kB,ФНО-α Поверхностно-активное вещество белок (SP-A, SP-C), ИЛ-8, МСР-1, GRO-α, ФНО-α, ИЛ-1β, IFN-γ IL-8, IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP1-α, GRO-α, МАРК / JNK / ERK фосфорилирования, cJUN: связывание с ДНК, глутатион, p65: связывание с ДНК
Конечный результат CSE вниз регулирует выработку цитокинов путем подавления AP-1 активации. H 2 O 2 и CSC повышения ацетилирование гистонов белков, снижение гистонов дезацетилазы деятельность, дифференциально регулировать провоспалительных релиз цитокинов. Сигаретный дым может вызвать высвобождение IL-8 из HASMC, усиливается TNF-α, 20% CSE меньше IL-8-релизе, подавление эотаксина и RANTES сигаретного дыма. TS активированный фактор HF транскрипции, который был связан с Hsp70 гиперэкспрессией и торможения NFkB связывания активность и TNF-α-релиз. Снижение ATII уровни хемокинов клеток получают компромисс AlveoLAR ремонт, способствуя сигаретного дыма, вызванного альвеолярного повреждения и эмфиземы. Данные предоставить механистическое объяснение, почему курильщики обострение респираторных инфекций. Подавление врожденной ответ сопровождается увеличением IL-8.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: письменное информированное согласие делать это исследование было получено в местном клинической единицы исследования под IRB утверждения, за надлежащей клинической практики. Обработка крови, выделение МНПК и других экспериментов на клеточных культурах выполняются в стерильных условиях, используя микробиологически стерильные материалы и реагенты.

1. WS-CM Подготовка

  1. Генерация WS-CM, как описано выше 12.
    1. Подготовка WS-CM, передавая дым из четырех 3R4F справочных сигарет через Roswell института Park Memorial (RPMI) 1640 без фенола красного, используя следующую схему курению: 35-60-2, объемом затяжки в мл, интервал слоеного в сек, и продолжительности слоеного в сек, соответственно. Каждый препарат создает образец 20 мл.
  2. Этикетка трубки (ы) с даты, времени завершены, и имя и номер сигарет. Хранить в 500 мкл аликвоты при -80 ° C сразу после курения завершена.
  3. Анализ аликвот замороженных WS-cm, Чтобы определить уровни никотина, табачных конкретных нитрозаминов и полициклических ароматических углеводородов, как описано выше 12.

2. Выделение МНПК

  1. Соберите свежую кровь от здоровых доноров (которые не являющихся потребителями табачных изделий) Изолировать МНПК от свежей крови, как описано ниже в рамках отдельного разрешения Wake Forest Baptist Health IRB 15.
    1. До прибытия мешка крови, есть бутылка 500 мл, ножницы, буфер изоляции и фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS) (RT) готов в уровень биобезопасности 2 (BSL-2) капот культуре клеток. Выделение буфера должен быть защищен от света.
    2. Держите сумку в крови с ног на голову и разрежьте трубу чуть ниже, где он был зажат оставляя по крайней мере, 3 см труб.
    3. Снимите крышку с бутылки 500 мл и удерживайте над отверстием бутылки трубку. Возьмите мешок крови и инвертировать его, чтобы кровь свободно вытекать из мешка в тон бутылка, пока мешок не пуст. Дайте крови течь на внутреннюю стенку флакона по сравнению с вертикально вниз, чтобы избежать образования пузырьков.
    4. Налейте буфер изоляции в бутылку в соотношении 1: 5 буфера изоляции с кровью. Закройте бутылку плотно и аккуратно переверните его, в конце-по-конец, в 10 раз. Оставьте бутылку в капот культуре клеток инкубируют с выключенным светом, в течение 1 ч при комнатной температуре.
    5. Свет, соломенно-желтый слой будет наращивать выше крови. Удалить этот слой с помощью 25 мл серологические пипетки в 50 мл конические пробирки. Собранный количество может варьировать от 50 - 300 мл, в зависимости от субъекта, который донорской крови.
    6. Центрифуга трубки при 200 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
    7. Аспирируйте полупрозрачный супернатант, оставляя темные крови цвета гранул. Осадок будет свободна, но вязкой.
    8. Пипетка 3 мл буфера изоляции в 15 мл конические пробирки.
    9. К ресуспендируют осадок, добавляют 20 мл DPBS на каждые 50 мл соломенного цвета жидкость, собранна в секТеп 2.1.5. Vortex тщательно перемешать, и консолидировать ресуспендировали жидкости из нескольких труб. Эта жидкость содержит суспендируют клетки крови.
    10. С передачей пипетки, передача 5 мл взвешенных клеток крови на 3 мл буфера изоляции в шаге 2.1.8. Наклоните 15 мл коническую трубку, содержащую суспензию клеток медленно и осторожно, чтобы создать два отдельных слоя. Центрифуга трубки на 400 мкг в течение 40 мин при комнатной температуре с минимальным ускорением и без тормоза.
    11. Использование передачи пипетки, чтобы удалить полученный мутный средний слой светлого сгустка крови (), содержащий РВМС в 50 мл коническую трубку. Избегайте рисования других четких слоев под ним. Трансфер не более 25 мл в каждую 50 мл коническую трубку.
    12. Добавить 25 мл холодного буфера работает (или более, чтобы заполнить весь оставшийся объем 50 мл коническую трубку), чтобы промыть клетки. Центрифуга клетки при 400 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
    13. Ресуспендируют гранул с 10 мл рабочего буфера. Этот документ содержит МНПК. Граф клеток и использовать чатопосредованно или места на льду для замораживания.

3. замораживания и оттаивания в МНПК

  1. Центрифуга РВМС, которые были собраны в стадии 2.1.13 течение 10 мин при 400 х г.
  2. Заполните замораживания контейнер с изопропилового спирта в соответствии с инструкциями изготовителя. ВНИМАНИЕ: изопропиловый спирт легко воспламеняется и характеризуется острой токсичностью.
  3. Ресуспендируют гранул с RPMI 1640 (4 ° С), содержащей 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 10% диметилсульфоксида (ДМСО). Это RPMI 1640 замерзания средой. Ресуспендируют гранул с количеством замораживания среды, что приведет к суспензии, имеющей примерно 5 х 10 7 клеток / мл. Число клеток, доступных для замораживания будет меняться.
  4. Не включать 1 мл аликвоты клеточной суспензии в 2 мл криопробирки и разместить криопробирок в контейнере замерзания. Поместите замораживания контейнер с криопробирок в морозильной камере при -80 ° C для хранения O / N, а затем удалить криопробирок и передать для хранения вкриогенная морозильник между -150 ° С до -190 ° С.
  5. Извлеките криоскопической из криогенного хранилища и разморозить его быстро при осторожном перемешивании в водяной бане при 37 ° С.
  6. Сразу передачи талой РВМС в криоскопической пробирки в 15 мл коническую пробирку с 10 мл RPMI полной среды 1640 (4 ° С), содержащей 10% FBS, 1% Pen / Strep и 1% L-глутамина. Содержание талой криоскопической пробирки должны быть переданы как можно быстрее, чтобы получить максимальное жизнеспособности клеток 15.
  7. Центрифуга РВМС при 400 х г в течение 10 мин.
  8. Ресуспендируют гранул с 5 мл RPMI 1640 полной среде и подсчет клеток.
  9. Измерение жизнеспособности клеток с помощью установленных методов, таких как трипанового синего методом исключения. Вообще жизнеспособность клеток с помощью этого метода составляет около 90 - 95%. РВМС теперь готовы для использования в экспериментах.

Определение Смерть 4. Сотовый

ПРИМЕЧАНИЕ: Растворы, перечисленные здесь, для целей настоящего ГТУду. Разведения могут быть соответствующим образом изменены.

  1. Развести WS-см или никотин в 96-луночный планшет с использованием RPMI полной среды в общем объеме 100 мкл / лунку, как указано ниже.
  2. Развести WS-см до следующих концентраций: 0,1, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, и 5 мкг / мл равнодействующих никотина единиц (на основе содержания никотина в WS-12 см).
  3. Развести никотина в RPMI среде до следующих концентраций: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000 и 3000 мкг / мл. ВНИМАНИЕ: Никотин остро токсичен и экологически опасным.
  4. Добавить 100 мкл РВМС, взвешенных в полной среде RPMI в каждую лунку в концентрации 1 × 10 6 клеток / лунку. Общий объем клеток плюс WS-см или никотина будет 200 мкл / лунку.
  5. Для целей данного исследования, подготовке двух наборов пластин, как описано выше. Покрытие пластин и инкубировать одну пластину в течение 24 ч и одной пластины в течение 3 ч при 37 ° С и 5% СО 2. Регулировка моменты времени по мере необходимости.
  6. Промыть при комнатной температуре клетки центрифугированием при 300 х г в течение 3 мин, аспирации супернатант, встряхиванием в нижней части пластины с пластины, покрытой и, наконец, ресуспендирования клеток с 200 мкл охлажденного льдом буфера под управлением, и повторить стадии промывки еще раз.
  7. Добавить 95 мкл рабочего буфера, а затем 5 мкл 7-aminoactinomycin D (7AAD) в каждую лунку при общем объеме 100 мкл / лунку. Инкубируйте планшет в темноте при комнатной температуре в течение 15 мин.
  8. Добавить 100 мкл работает буфер для кластерных труб. Перевести весь объем клеточной суспензии из каждой лунки пластины к кластеру труб и приобрести образцы на поток цитометр.
  9. Определить процент 7AAD-позитивных клеток с использованием проточной цитометрии программного обеспечения для анализа.

5. EC 50 Определение

  1. EC 50 значения WS-CM и никотина определяются 7AAD-положительное окрашивание МНПК.
  2. ЕС 50 значение определяется как концentration, при которой 50% клеток были уже не жизнеспособны в 24 ч анализа, а значения выражены в мкг равностепенной никотина ед / мл.
  3. Для целей настоящего исследования, EC 50 значения были признаны 1,56 мкг / мл и 1650 мкг / мл для WS-CM и никотина, соответственно.

6. Секретируемые Цитокины

ПРИМЕЧАНИЕ: Растворы, перечисленные здесь, для целей данного исследования. Разведения могут быть соответствующим образом скорректированы.

  1. Развести WS-см в 96-луночный планшет с использованием RPMI полной среды в общем объеме 100 мкл / лунку в концентрации 0,3, 1,56, 3 и 5 мкг / мл равнодействующих никотина единиц.
  2. Развести никотина в следующих концентрациях: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000, и 3000 мкг / мл. ВНИМАНИЕ: Никотин остро токсичен и экологически опасным.
  3. Добавить 100 мкл РВМС, взвешенных в полной среде RPMI в каждую лунку в концентрации 1 × 10 6 клеток / лунку.Общий объем клеток плюс WS-см или никотина будет 200 мкл / лунку.
  4. Закройте планшет и инкубируют в течение 3 ч при 37 ° С и 5% СО 2.
  5. Промыть при комнатной температуре клетки центрифугированием при 300 х г в течение 3 мин, аспирации супернатант, встряхиванием в нижней части пластины с пластины, покрытой и, наконец, суспендирующие клетки с 200 мкл охлажденной льдом рабочем буфере и повторение стадии промывки еще раз.
  6. Добавить 200 мкл полной среды RPMI, и повторить стадии промывки еще раз.
  7. Добавить 200 мкл 10 мкг / мл LPS среды в каждую лунку.
  8. Закройте планшет и инкубируют в течение 4 ч, 24 ч, 48 ч, или 72 ч при 37 ° С и 5% СО 2. Регулировка времени инкубации при необходимости.
  9. Центрифуга пластины при 300 х г в течение 3 мин.
  10. Возьмите 175 мкл супернатанта из каждой лунки и хранить в морозильной камере при температуре -80 ° C для выполнения анализов с шагом 7 и 8.

7. Cytometric бисера Массив Анализ

<ол>
  • Оттепель клеточные супернатанты, полученные из шага 6,10 и использования в анализе Центрального банка. Выполните цитометрии массив шарик (ЦБА) Анализ в соответствии с инструкциями изготовителя.

    • 8. IL-8 ELISA

    1. Оттепель клеточных супернатантов с шага 6,10 и использования в IL-8 ELISA. Выполните анализ ELISA в соответствии с инструкциями изготовителя.

    9. внутриклеточного окрашивания и проточной цитометрии

    ПРИМЕЧАНИЕ: Растворы, перечисленные здесь, для целей данного исследования. Разведения могут быть соответствующим образом скорректированы.

    1. Развести WS-см в 96-луночный планшет с использованием RPMI полной среды в общем объеме 100 мкл / лунку в концентрации 0,3, 1,56, 3 и 5 мкг / мл равнодействующих никотина единиц.
    2. В то же пластине, разбавленной никотина в следующих концентрациях: 2, 10, 50, 100, 500, 2000, и 4000 мкг / мл. ВНИМАНИЕ: Никотин остро токсичен и экологически ХазарDOUS.
    3. Добавить 100 мкл РВМС, взвешенных в полной среде RPMI при концентрации 1 × 10 6 клеток / лунку. Общий объем клеток плюс WS-см или никотина будет 200 мкл / лунку.
    4. Закройте планшет и инкубируют в течение 3 ч при 37 ° С и 5% СО 2.
    5. Промыть при комнатной температуре клетки центрифугированием при 300 х г в течение 3 мин, аспирации супернатант, встряхиванием в нижней части пластины с пластины, покрытой и, наконец, ресуспендирования клеток с 200 мкл охлажденного льдом буфера под управлением, и повторить стадии промывки еще раз.
    6. Добавить 200 мкл RPMI полной среде к плите, и повторите шаг Мойте еще раз.
    7. Подготовка рабочих концентраций 2 мкл / мл GolgiPlug и 10 мкг / мл LPS с помощью RPMI полной среды и добавить 200 мкл в каждую лунку.
    8. Инкубируют планшет в течение 6 ч при 37 ° С и 5% СО 2.
    9. В конце стадии 9,8, мыть клетки с рабочим буфером (4 ° С) и спиннинг в 300мкг в течение 3 мин при 4 ° С.
    10. Добавить 100 мкл Cytofix в каждую лунку и инкубируют в течение 20 мин при 4 ° С.
    11. Промыть клетки 3 раза, как описано в стадии 9,9 1х Permwash (4 ° С) при 300 х г в течение 3 мин при 4 ° С.
    12. Добавить 45 мкл 1х Cytoperm в каждую лунку с последующим 5 мкл каждого из одного из следующих антител в каждую лунку: ФНО-α-Alexa Fluor 488, IFN-γ V500, MIP-1α ПЭ. Инкубируйте при 4 ° С в течение 30 мин.
    13. Промыть клетки в два раза, как описано выше в стадии 9,9 1х Permwash (4 ° C) и один раз с рабочим буфером (4 ° C) при 300 х г в течение 3 мин при 4 ° С.
    14. Ресуспендируют клеток с 200 мкл 2% параформальдегида (4 ° C). Передача клеток в 12 × 75 мм пробирок и анализа проб на проточной цитометрии. ВНИМАНИЕ: Параформальдегид вызывает коррозию, остро токсичен и опасен для здоровья.

    10. K562 Убийство Анализ

    ПРИМЕЧАНИЕ: К562 должны быть выращеныв культуре при 37 ° С и 5% СО 2 с полной среде RPMI, пока они не достигнут 80% слияния до анализа.

    1. Подготовка 5 мм карбоксифлуоресцеина сукцинимидиловый эфир (CFSE) маточного раствора путем добавления 18 мкл ДМСО в пробирку.
    2. Развести WS-см или никотин в 96-луночный планшет с использованием RPMI полной среды в общем объеме 100 мкл / лунку, чтобы достичь желаемых равностепенно никотина единиц или концентрации никотина для каждой лунки. ВНИМАНИЕ: Никотин остро токсичен и экологически опасным.
    3. Добавить 100 мкл РВМС в полной среде RPMI при концентрации 1,5 × 10 6 клеток / лунку. Общий объем клеток с WS-CM или никотина будет 200 мкл / лунку.
    4. Закройте планшет и инкубируют в течение 3 ч при 37 ° С и 5% СО 2.
    5. Промыть клеток K562, добавив 10 мл DPBS и центрифуге при 400 х г в течение 8 мин при комнатной температуре.
    6. Ресуспендируют клеток с 10 мл DPBS и подсчет клеток К562.
    7. Подготовка CFSE WorkiРаствор нг добавлением 1 мкл исходного раствора CFSE до 1 мл DPBS.
    8. Добавить 1 мл рабочего раствора CFSE в 1 мл клеточной суспензии K562, содержащей 1 - 2 х 10 7 клеток. Вихревой и инкубировать точно в течение 2 мин при комнатной температуре.
    9. Сразу добавить 200 мкл FBS. Вихревой и инкубировать точно в течение 2 мин при комнатной температуре.
    10. Добавьте 10 мл RPMI полной среде и центрифугируют пробирку при 400 х г в течение 8 мин при комнатной температуре.
    11. Удалить супернатант RPMI и разорвать гранулы и ресуспендирования клеток с 10 мл RPMI полной среды и считать CFSE-меченых клеток К562.
    12. Промыть РВМС центрифугированием пластину на 300 мкг в течение 3 минут при комнатной температуре. Аспирата супернатант декантируют жидкость. Установите на место крышку и вихрь нижней части пластины. Добавить 200 мкл RPMI полной среде и повторите этап промывки еще раз.
    13. Добавить CFSE-меченых клеток К562 в соотношении 1:15 (100000 K562s: 1,5 × 10 6 РВМС) к каждому образцу лунку планшета РВМС и дальше яncubate в течение 5 ч при 37 ° С и 5% СО 2.
    14. Промыть смесь клеток центрифугированием при 300 х г в течение 3 мин при комнатной температуре. Аспирата супернатант путем отбрасывания жидкости. Поместите крышку и вихрь нижней части пластины.
    15. Добавить 200 мкл рабочего буфера и повторите этап промывки, описанные в шаге 10.14 еще раз.
    16. Добавить 95 мкл работает буфер, а затем 5 мкл 7AAD в каждую лунку при общем объеме 100 мкл / лунку. Инкубируйте планшет в темноте при комнатной температуре в течение 15 мин.
    17. Добавить 100 мкл рабочего буфера в каждую лунку и передать весь объем клеточной суспензии из каждой лунки пластины к кластеру труб и приобрести образцы на поток цитометр.
    18. Определить процент 7AAD-положительных и CFSE-положительных клеток с помощью проточной цитометрии программного обеспечения для анализа.

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Результаты

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Результаты были представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего (четыре образца доноров). T-критерию Стьюдента между обработанной и необработанной контрольных образцов проводили с использованием Excel программного обеспечения, а также сравнения Т-тест для всех процедур с соответствующими им управления. Статистическая значимость была указана: *, P <0,05; ** P <0,005; *** Р <0,0005.

    Для измерения эффекта воздействия на WS-МС и никотина, РВМС обрабатывали различными...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Обсуждение

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Мы и другие ранее продемонстрировали, что лечение МНПК с ТЭС подавляет несколько ответов, в том числе экспрессии и секреции цитокинов и функциональных мер, таких как клетки-мишени убийство 14. Экспериментальные методы, описанные в предыдущей работе требуют более долгий инкубационный период и были скромными по величине 14. Учитывая потенциальные применения этой привлекательной Экс Vivo модели для фундаментальных и прикладных исследований, мы исследовали, может ли какой-либо из параметров ан...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Раскрытие информации

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

    Благодарности

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Эта работа финансируется RJ Reynolds Tobacco Company (RJRT) под соглашение о сотрудничестве исследований с Wake Forest University школы медицины. GL Прасад полный рабочий день сотрудник RJRT.

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Материалы

    Список материалов, использованных в этой статье
    ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
    12 x 75 мм тубыBD Falcon352058
    15 мл конические трубкиCorning430790
    2 мл микротрубкиAxygenMCT-150-C-S
    3R4F эталонные сигаретыУниверситет Кентукки, Колледж сельского хозяйства3R4F
    50 мл конические трубкиCorning430828
    бутылка500 млCorning430282
    7AADBD Pharmingen559925
    96-луночная плоская нижняя пластинаTermo Nunc439454
    96-луночная круглая нижняя пластинаBD Falcon353077
    Колпак для клеточных культурThermo Scientific1300 серия A2
    ЦентрифугаEppendorf58110R
    CFSEМолекулярные зонды Life TechnologiesC34554
    Кластерные пробиркиCorning4401Вреден при проглатывании, канцероген
    Cytofix/Cytoperm (Permwash)BD Biosciences555028Легковоспламеняющийся
    ДМСО (диметилсульфоксидSigma-AldrichD8418
    DPBSLonza17-512F
    FBSSigma-AldrichF2442
    FCAP ArrayBD Biosciences652099программное обеспечение анализирует данные CBA
    Фильтрующий блокNalgene156-4020
    Проточный цитометрBD BiosciencesFACS Canto II8 цветов, в Ex 405 и Em 785.
    Проточный цитометрBD BiosciencesFACS Calibur4 цвета at Ex 495 и Em 785.
    Программное обеспечение для анализа проточной цитометрииTree StarFlowJo
    Морозильный контейнерNalgene5100-0001Содержит ДМСО, раздражающее средство
    GogliPlugBD Biosciences555029канцероген, раздражающее, коррозионное
    H2SO4Sigma-Aldrich339741
    набор воспалительных цитокиновчеловекаBD Biosciences551811
    ИФН-&гамма; V-500 АнтителоBD Horizon561980Сенсибилизатор кожи
    IL-8 ELISA KitR and D SystemsDY208
    Изоляционный буферIsolymph, CTL Scientific Corp.1114868Легковоспламеняющаяся жидкость, раздражающий спирт
    Sigma-AldrichW292907
    L-GlutamineGibco Life Technologies25030-081
    LPS Sigma-AldrichL2630
    MIP1-α PE АнтителоBD Pharmingen554730Острая токсичность, пероральный
    MonensinSigma-AldrichM5273
    NaClSigma-AldrichS7653
    НикотинSigma-AldrichN3876Острая токсичность, опасность для окружающей среды
    ParafilmBemis" М»
    ПараформальдегидSigma-AldrichP6148Легковоспламеняющийся, раздражающий кожу
    Pen/streppingGibco Life Technologies15140-122
    RPMI 1640Gibco Life Technologies11875-093
    Бегущий буферMACS Running Buffer, Miltenyi Biotech130-091-221
    Th1/Th2 CBA KitBD Biosciences551809
    TNF-α Alexa Fluor 488 АнтителоBioLegend502915
    Трансферная пипеткаFisher Scientific13-711-20
    Tris BaseSigma-AldrichT1503
    )

    Ссылки

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. How Tobacco Smoke Causes Disease: The Biology and Behavioral Basis for Smoking-Attributable Disease, A Report of the Surgeon General. , U.S. Department of Health and Human Services. (2010).
    2. Zeller, M., Hatsukami, D. The Strategic Dialogue on Tobacco Harm Reduction: a vision and blueprint for action in the US. Tob. Control. 18, 324-332 (2009).
    3. Sopori, M. Effects of cigarette smoke on the immune system. Nature Reviews Immunology. 2, 372-377 (2002).
    4. Birrell, M. A., Wong, S., Catley, M. C., Belvisi, M. G. Impact of tobacco-smoke on key signaling pathways in the innate immune response in lung macrophages. J. Cell Physiol. 214, 27-37 (2008).
    5. Laan, M., Bozinovski, S., Anderson, G. P. Cigarette smoke inhibits lipopolysaccharide-induced production of inflammatory cytokines by suppressing the activation of activator protein-1 in bronchial epithelial cells. J. Immunol. 173, 4164-4170 (2004).
    6. Moodie, F. M., et al. Oxidative stress and cigarette smoke alter chromatin remodeling but differentially regulate NF-kappaB activation and proinflammatory cytokine release in alveolar epithelial cells. Faseb J. 18, 1897-1899 (2004).
    7. Oltmanns, U., Chung, K. F., Walters, M., John, M., Mitchell, J. A. Cigarette smoke induces IL-8, but inhibits eotaxin and RANTES release from airway smooth muscle. Respir. Res. 6, 74(2005).
    8. Vayssier, M., Favatier, F., Pinot, F., Bachelet, M., Polla, B. S. Tobacco smoke induces coordinate activation of HSF and inhibition of NFkappaB in human monocytes: effects on TNFalpha release. Biochem. Biophys. Res. Commun. 252, 249-256 (1998).
    9. Witherden, I. R., Vanden Bon, E. J., Goldstraw, P., Ratcliffe, C., Pastorino, U., Tetley, T. D. Primary human alveolar type II epithelial cell chemokine release: effects of cigarette smoke and neutrophil elastase. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 30, 500-509 (2004).
    10. Hatsukami, D. K., Biener, L., Leischow, S. J., Zeller, M. R. Tobacco and nicotine product testing. Nicotine Tob. Res. 14, 7-17 (2012).
    11. Ashley, D. L., Backinger, C. L., van Bemmel, D. M., Neveleff, D. J. Tobacco Regulatory Science: Research to Inform Regulatory Action at the Food and Drug Administration's Center for Tobacco Products. Nicotine Tob. Res. , (2014).
    12. Arimilli, S., Damratoski, B. E., Bombick, B., Borgerding, M. F., Prasad, G. L. Evaluation of cytotoxicity of different tobacco product preparations. Regul. Toxicol. Pharmacol. 64, 350-360 (2012).
    13. Gao, H., Prasad, G. L., Zacharias, W. Differential cell-specific cytotoxic responses of oral cavity cells to tobacco preparations. Toxicol In Vitro. , (2012).
    14. Arimilli, S., Damratoski, B. E., Prasad, G. L. Combustible and non-combustible tobacco product preparations differentially regulate human peripheral blood mononuclear cell functions. Toxicol. In Vitro. 27, 1992-2004 (2013).
    15. Arimilli, S., Damratoski, B. E., Chen, P., Jones, B. A., Prasad, G. L. Rapid isolation of leukocyte subsets from fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells in clinical research. Cryo Letters. 33, 376-384 (2012).
    16. Schmid, I., Krall, W. J., Uittenbogaart, C. H., Braun, J., Giorgi, J. V. Dead cell discrimination with 7-amino-actinomycin D in combination with dual color immunofluorescence in single laser flow cytometry. Cytometry. 13, 204-208 (1992).
    17. Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. J. Immunol. Methods. 325, 51-66 (2007).
    18. Taga, K., Yamauchi, A., Kabashima, K., Bloom, E. T., Muller, J., Tosato, G. Target-induced death by apoptosis in human lymphokine-activated natural killer cells. Blood. 87, 2411-2418 (1996).

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Перепечатки и разрешения

    Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

    Запросить разрешение

    Теги

    K562CFSELPS

    Похожие статьи