Методическая статья

Электрофизиологических и морфологических характеристик нейронов микросхем при остром мозга срезов при использовании парных патч-зажим Recordings

DOI:

10.3791/52358

⸱

10 января 2015 г.

 ,  , 
1Institute of Neuroscience and Medicine (INM-2), Research Centre Jülich, 2Department of Psychiatry, Psychotherapy and Psychosomatics, Medical Faculty, JARA, RWTH Aachen University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Патч-зажимные записи и одновременное заполнение внутриклеточного биоцитина синаптически связанных нейронов в острых срезах мозга позволяют провести коррелированный анализ их структурных и функциональных свойств. Целью данного протокола является описание основных технических этапов электрофизиологической регистрации с нейронных микросхем и их последующего морфологического анализа.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сочетание локальной фиксации записи из двух (или более) синаптически связанных нейронов (парные записи) в острых мозг срезов препаратов с одновременным заполнением внутриклеточного biocytin позволяет коррелированную анализ их структурных и функциональных свойств. С помощью этого метода можно выявить и охарактеризовать как до, так и постсинаптические нейроны их морфологии и электрофизиологические рисунком ответа. Парные записи позволяют изучать образцы подключения между этими нейронами, а также свойства химической и электрической передачи синаптической. Здесь мы даем шаг за шагом описание процедур, необходимых для получения надежных парные записи вместе с оптимального восстановления нейронов морфологии. Мы расскажем, как пары нейронов, соединенных через химических синапсов или щелевых контактов указаны в мозг срезов препаратов. Мы будем общих чертах, как нейроны восстанавливаются, чтобы получить их 3D морфологию dendritIC и аксонов домена и, как синаптические контакты были выявлены и локализованы. Мы также обсудим предостережения и ограничения в паре технологии записи, в частности те, которые связаны с дендритных и аксонов укорочения в процессе подготовки срезах мозга, потому что они сильно влиять на показатели подключения. Тем не менее, из-за универсальности в паре подхода записи она останется ценным инструментом для характеристики различных аспектов синаптической передачи в определенных нейронных микросхем в головном мозге.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нервные микросхемы между двумя синаптически связанных нейронов являются строительными блоками крупномасштабных сетей в мозге и являются базовыми элементами синаптической обработки информации. Предпосылкой для характеристики таких нейронных микросхем, чтобы знать морфологию и функциональные свойства как пре- и постсинаптических нейронов партнеров, тип синаптической связи (ов) и свою структуру и функциональные механизма. Тем не менее, во многих исследованиях синаптических соединений, по меньшей мере один из нейронов в микросхеме не хорошо охарактеризованы. Это связано с относительно неспецифических протоколов стимуляции, часто используемых в исследованиях синаптической связи. Таким образом, структурные и функциональные свойства пресинаптического нейрона либо не определены вообще или лишь в весьма малой степени (то есть, выражение маркерных белков и т.д.). Парные записи в сочетании с внутриклеточным окрашиванием маркерами суч как biocytin, neurobiotin или флуоресцентных красителей лучше всего подходит для изучения малых нейронных микросхем. Этот метод позволяет исследовать множество структурных и функциональных параметров морфологически определены синаптической связи, в то же время.

Так называемые «унитарные» моносинаптические связи между двумя нейронами были исследованы в обоих корковых и подкорковых областях мозга 1-10 с использованием острых срезов препаратов. Первоначально острые микроэлектродов были использованы в этих опытах; Через записи патч зажим был использован для того, чтобы получить записи синаптических сигналов с более низким уровнем шума и улучшенной временным разрешением.

Значительный технический прогресс был использование инфракрасного дифференциального интерференционного контраста (ИК-ДИК) оптики 11-14, микроскопические техники, что значительно улучшило видимость и идентификации нейронов в срезе мозга, так что это стало возможным тО получить записи с визуальной идентификации синаптических связей 15-17. В общем, парных записи делаются в острых срезов препаратов; только очень немногие публикации доступны отчетности записи с синаптически связанных нейронов в естественных условиях 18-20.

Наиболее важным преимуществом парных записей является то, что функциональные характеристики могут быть объединены с морфологического анализа как на световой и электронной микроскопическом уровне (см, например., 7,16,21). После гистохимическим обработки, дендритных и аксонального морфологии синаптически связанных нейронов пары прослеживается. Затем можно количественно морфологические особенности, такие как длина, пространственной плотности, ориентации, ветвления и т.д. Эти параметры можно затем обеспечивают основу для объективной классификации конкретного синаптической связи. Кроме того, в отличие от большинства других методов, используемых для изучения нейронных connectiВиты, в паре записи также позволяет идентифицировать синаптических контактов унитарных синаптических связей. Это может быть сделано непосредственно с использованием комбинации световой и электронной микроскопии 16,21-27 или с помощью визуализации кальция 28,29 дендритных шипиков. Тем не менее, с последнего подхода только возбуждающим, но не ингибирующие соединения могут быть изучены, как это требуется приток кальция через постсинаптических рецепторов каналов.

В дополнение к детальному анализу синаптической передачи в определенном нейронных микросхем в паре записей также позволит исследовать синаптических правил пластичности 30,31 или - в сочетании с агонистом / антагонистом применения - модуляции синаптической передачи с помощью медиаторов, таких как ацетилхолин, 32 и аденозина 33.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все экспериментальные процедуры были проведены в соответствии с Директивой ЕС о защите животных, Закон об охране немецкий животных (Tierschutzgesetz), Руководящих принципов Федерации европейской лабораторных животных научной ассоциации.

1. Установка для электрофизиологии

Перед началом с парной записи, электрофизиологии настройки должен быть построен. Краткое описание, как такое настройка собран приведен ниже:

  1. Установите таблицу анти-вибрации, на котором микроскоп, манипуляторы и все другое оборудование будут размещены.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вибрация или любой другой вид движения должен быть как можно меньше при записи с синаптических связей, потому что это требует изменения пипеток (поиск электрода заменены на записи электрода).
  2. Поставьте клетку Фарадея вокруг стола анти-вибрации, чтобы уменьшить электрический шум. Подключайте все оборудование внутри са ФарадеяGE с электрическим заземлением.
  3. Установите микроскоп с моторизованной оси фокусировки, которая основана на моторном столе ху на столе анти-вибрации в соответствии с руководящими принципами производителя. Это позволяет надежно перемещать микроскоп, чтобы нейронов, которые не находятся в одной и той же поле зрения, как это относится к трансламинарные связей в коре головного мозга.
  4. Установите видеокамеру к порту камеры микроскопа и подключите его к аналоговых и / или цифровых экранов, чтобы наблюдать за подготовку срез и движение электродов. Используйте камеру, которая может переключаться между низко- и большом увеличении, чтобы получить обзор и крупным планом изображения, соответственно, синаптически в сочетании нейронов пары клеток. Это также помогает контролировать движение патч электродов.
  5. Установите таблицу образца, содержащего вставку для ванной камеры (пробурена в доме из блока плексигласа) для подготовки мозга среза. Эта таблица образец не должен быть подключен кмикроскопа, т.е., должен быть закреплен на столе воздуха и микроскоп должен быть маневренным под ним.
  6. Гора два (или больше, если необходимо) высокоточные микроманипуляторы, которые могут быть перемещены во всех трех измерениях. Установите патч-зажим предварительного усилителя на манипуляторов и подключить их к основному усилителю.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости дополнительные манипуляторы могут быть установлены в течение, например, более чем в два предварительных усилителей, внеклеточные электроды стимуляции, систем доставки лекарственных средств и т.д.
  7. Поместите ванны камеру в таблице образца. Установите впускной решения и розетки и подключить их к системе перфузии.
  8. Использование перистальтического насоса для поддержания перфузии записи камеры с искусственной цереброспинальной жидкости (ACSF, таблица 1), при стабильной скорости потока 4 - 6 мл / мин для оптимальной жизнеспособности среза.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышайте эту скорость потока значительно, как это приведет к турбулентности в ASCF и, следовательно, движение среза.
  9. Установите держатели для датчиков температуры и Ag / AgCl первом электроде на стол образца. Это необходимо, чтобы зонд и электрод попробовать ванну в камере.
  10. Для хорошей видимости нейронов в подготовке среза использовать инфракрасное освещение в микроскоп. Это снижает дифракцию света и, следовательно, размытия изображения. Убедитесь, что микроскоп оснащен дифференциальных интерференционного контраста оптики для достижения "3D'-как визуализации. Это поможет исправления нейронов и позволяют ориентации нейронов глубоких в срезе (60 мкм или более глубокого).
  11. В ходе эксперимента, сохранить срезах мозга в экспериментальной камере с покровным стеклом в нижней части. Поставьте платиновый арфе 'на вершине ломтиком чтобы предотвратить срезов из плавающей. Платина арфа сделан из U-образной, сплюснутые платиновой проволоки со строками из зубной нити, склеенных на него.
  12. Хранить ACSF перфузии срез при температуре 32 - 35 ° С, чтобы обеспечить OPTIMAL контроль оксигенации и рН. Это может быть сделано путем нагревания раствора с устройством Пельтье установленной близко к притоку ACSF в ванну камеры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте ультратонкий чехол скользит, так что даже микроскопические конденсаторы с высокой числовой апертурой и короткой рабочей дистанции могут быть ориентированы на образец. Это необходимо для оптимального освещения среза.
    Для изображения и описания в электрофизиологии настройке оптимизированной для парных записей в подготовке мозга срез рис 4 в работе. 34.

2. Мозг фрагмент Подготовка

  1. Мягко обезболить животное, из которого ткани мозга должны быть приняты изофлураном (конечная концентрация <0,1%).
    ПРИМЕЧАНИЕ: другие обезболивающие также может быть использован. Использование анестезии должны соответствовать рекомендациям и правилам соответствующих животное комитета. Всегда убедитесь, что животное не раздражается или в условиях стресса после добавленияанестетик.
  2. Обезглавить животное, открыть череп и удалить мозг как можно быстрее, используя процедуру, описанную в работах. 34,35.
  3. Передача мозг в охлажденном (4 ° C) искусственного спинномозговой жидкости газированные смесью карбогена газа с 95% O 2 и 5% CO 2.
  4. Изолировать область мозга, который должен быть изучен.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры для получения оптимального сохранения и минимальное усечение дендритов и аксонов до и постсинаптических нейронов должна быть определена заранее для каждого нейронов связи и стадии развития в рамках расследования. В оптимальном рассеченной среза головного мозга, аксон пресинаптических нейронов не требуется, чтобы быть параллельной поверхности среза. Скорее всего, они должны указать в ломтики с острым углом. Применяется для апикальной дендрита постсинаптических нейронов пирамидальных; он должен быть проверен под световым микроскопом. Это особенно важно для нелокального или Тranslaminar синаптических связей, т.е.., где до и постсинаптических somata более 200 мкм друг от друга и вероятность дендритных и аксонов укорочения, скорее всего, будет существенно выше, чем для местных соединений.
  5. Трансфер мозг микротома камеры. Основываясь на эмпирических данных, различные решения внеклеточного нарезки используются в зависимости от возраста животного (см таблицах 2 и 3; полезная информация также может быть найден в разделе " http://www.brainslicemethods.com/ »).
  6. Обрезать мозг, пока область-мишень не видно.
  7. Для получения срезов с хорошей видимостью клеток, вырезать 300 - толстые ломтики мозга 400 мкм, если животное является зрелым (> 3 недель). Если животное является незрелым (1-й до 2-й недели жизни у мышей и крыс) ломтики могут быть обрезаны до толщины ~ 600 - 800 мкм без значительного отрицательного воздействия клеток visibility.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволит повысить стабильность "незрелых" ломтиками и уменьшить количество возможных усечений дальнего дендритных и аксонов залогов.
  8. Передача ломтики от микротома камеры в инкубационной камере, заполненной раствором нарезки аэрированной смесью 95% O 2 и 5% CO 2. Хранить ломтики в инкубационной камере в течение по меньшей мере 30 мин до 1 ч или при комнатной температуре или в ~ 30 ° С, в зависимости от типа эксперимента.

3. Парные Patch-Clamp Запись и Biocytin Заполнение

В зависимости от типа синаптической связи три различных подхода используются для нахождения синаптически связанных нейронов. Если вероятность соединения низкая (как можно ожидать наиболее возбуждающими связями), выполните следующие действия:

  1. Нейронные связи с низким подключения
    1. Заполните патч пипетки с внутренним решением композиции, перечисленныев таблице 4 для всех записей в конфигурации цельноклеточной добавить biocytin в концентрации от 3 ​​-. 5 мг / мл до внутреннего (пипетки) раствора, чтобы получить хорошие результаты окрашивания для пре- и постсинаптических нейронов. Пусть biocytin диффундируют в клетки, по крайней мере, 15 - 30 мин (в зависимости от размера нейрона).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не добавляйте biocytin в растворе, используемом в «Поиск» пипеток, указанных ниже.
    2. Патч предполагаемый постсинаптического нейрона в режиме целых клеток. Используйте патч пипетки с длинным и стройным голени. Это облегчает маневренность пипетки под цели и уменьшает артефакты движения, которые могут возникнуть при электрод вводится в срезе.
    3. Затем, залатать потенциального пресинаптического нейрона в конфигурации клеточного прикрепляется при помощи «Поиск» патч пипетку 8 - 10 сопротивления МОм и небольшой диаметр кончика. С помощью этих пипеток установить «свободную» клеток подключением патч. Filл 'поиске "пипетку с внутренним раствора, в котором К + заменен Na + (таблица 5), с тем, чтобы не деполяризовать нейронов во время поиска для пресинаптической клетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: "свободно" сопротивление уплотнения не находится в диапазоне ГОм, но, как правило, около 30 - 300 МОм.
    4. Держите мембранный потенциал в рамках "свободной" печатью до примерно -30 до -60 мВ в текущем режиме зажим. Затем примените импульсов большого тока (0,2 - 2 Na), чтобы вызвать потенциал действия в потенциальной пресинаптической клетки. Соблюдайте этот потенциал действия в виде небольшого колоска на ответ напряжения.
    5. Установите частоту стимуляции 0,1 Гц, чтобы предотвратить краткое изложение постсинаптической ответ. Используйте более низкие частоты стимуляции в случае мозговую ткань очень незрелыми или синаптической связи не очень надежны.
    6. В случае «постсинаптической" нейрон не реагирует на стимуляцию тестирование »пресинаптической" NeuРон, патч новой нейрон в "свободной" режим уплотнения. Не заменяйте «Поиск» патч электрода до тех пор, как печать с сопротивлением> 30 МОм устанавливается. Испытание до 30 потенциально пресинаптических нейронов в этом случае.
      Примечание: Для предотвращения повреждения нейронов во время процедуры поискового с рыхлой зажима патч, только слегка всасывания должны быть применены к поисковой пипетки по сравнению с той, которая применяется к патч пипетки цельноклеточной.
    7. Если стимуляция в «рыхлых» результатов в режиме уплотнения в ВПСП / IPSP с задержкой <5 мс в постсинаптического нейрона удалить «Поиск» пипетку из пресинаптического нейрона.
    8. Замените «Поиск» патч пипетки с участком электрода, заполненного biocytin содержащих, регулярное внутреннее решение. Убедитесь эту запись патч пипетки имеет сопротивление 4 - 8 МОм; чем больше размер сомы ниже сопротивление электрода может быть.
    9. Патч пресинаптическийнейрон и запись в целых клеток, текущий режим-зажим. Выявите потенциалы действия по инжекции тока в пресинаптических нейронов и записывать постсинаптическую ответ. Храните данные на компьютер для последующего офф-лайн анализа.
  2. Нейронные связи с высокой связности
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для нейронных микросхем с высокой степенью связности (> 30%) используют другую процедуру, чтобы найти синаптических связей. Эта процедура описана ниже и часто используется для тормозной синаптической связи, которые имеют в среднем более высокой, чем отношение подключения возбуждающих соединений 36. Он не должен быть использован, когда соотношение соединения падает ниже этого значения.
    1. Патч пресинаптический нейрон непосредственно в режиме целых клеток. Затем, залатать потенциального постсинаптического нейрона, а также в режиме цельных клеток. Оба клетки должны быть в соответствии с действующим контроля зажима. Выявите потенциал действия в пресинаптических клетки. Мониторинг перспективной постсинаптического нейрона для postsynaptic потенциал.
    2. В случае нейрон не показывает ответ на пресинаптической стимуляции, патч новый нейрон в режиме цельноклеточной помощью заплатки электрод, наполненный регулярной внутренней раствора. Если обнаружено соединение, не изменить патч пипетки, но приступить к записи. Затем перейдите, как в шаге 3.1.9.
  3. Нейронные связи через гэп-переходов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для поиска электрических (GAP-образном перекрестке) соединений с помощью следующей процедуры, которая представляет собой модифицированную версию того, что используется для маловероятных соединений.
    1. Патч постсинаптической нейрон в конфигурации локальной фиксации целых клеток.
    2. Впоследствии, патч предполагаемый пресинаптического нейрона в конфигурации с отрывными уплотнения (низкое сопротивление уплотнения 30 - 300 МОм) с помощью «Поиск» патч пипетку 7 - 10 сопротивления МОм. Это пипетки должны быть заполнены с модифицированным высокой Na + внутреннее решение для отрывными уплотнения стимуляции.
    3. INJECт 100 - 300 мс импульсы длинные гиперполяризационные текущие через «свободную» печатью; Команда потенциал пипетки должен быть установлен до примерно -60 до -70 мВ. Соблюдайте подключение щелевых если это стимуляции приводит к небольшому гиперполяризующего ответ в «постсинаптической" нейрона.
    4. Repatch на '' пресинаптического нейрона в режиме цельноклеточной и действовать, как описано выше.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения хорошего окрашивания аксонов и дендритных процессов, с помощью протокола приведены ниже. Этот протокол описан вкратце здесь, однако, Подробный протокол гистохимического обработки, используемой в нашей лаборатории приведен в работе. 37.

4. Гистохимический Обработка

  1. Передача срез головного мозга с парой синаптически связанных нейронов в пробирку, содержащую 4% параформальдегида, растворенного в 0,1 М фосфатном буфере, и зафиксировать срез в течение 24 ч. Для электронной микроскопии, зафиксировать срез с помощью 2,5% глутаровыхальдегида и 1% параформальдегида.
  2. На следующий день, трансфер ломтики в нормальном фосфатного буфера, не содержащей фиксатор. Вымойте ломтиками фосфатным буфером в течение 6 - 8 раз в течение 10 - 15 минут каждый, чтобы удалить лишнюю фиксатором.
  3. Выдержите ломтики в течение 20 мин в 3% H 2 O 2 решения в 0,1 М фосфатного буфера, чтобы минимизировать эндогенного пероксидазной реакции. Соблюдайте сильный образование пузырьков. Продолжить реакцию, пока никаких дальнейших пузыри не образуются. Затем, промыть ломтики в 0,1 М фосфатном буфере в течение 6 - 8 раз (в течение 10 мин каждый), чтобы удалить оставшиеся H 2 O 2.
  4. Иммуноцитохимические и хромогенные реакции
    Визуализация biocytin заполненные нейронов основана на стрептавидин-пероксидаза хрена биотинилированный реакции, катализируемой с диаминобензидином; это производит темный осадок, который производит четкое пятно с высоким пространственным разрешением. Следующие процедуры используются для хромогенного реакции: <ол>
  5. Приготовьте раствор ABC согласно протоколу завода-изготовителя. Добавить в 14,55 мл фосфатного буфера с добавлением 150 мкл 10% Triton X100 (таблица 6, и только для световой микроскопии) и держать раствор в течение 30 мин в темноте. Выдержите ломтики в этом растворе O / N перед использованием.
  6. Инкубируйте срезов в растворе ABC на шейкере в течение 1 ч при комнатной температуре и в темноте. Впоследствии, держать ломтиками O / N при 4 ° С в холодильнике. На следующее утро, инкубировать срезов при КТ в течение еще одного часа.
  7. После этого промойте ломтиками, по меньшей мере четыре раза в течение 10 мин каждый в фосфатном буфере. Затем инкубируют в шейкере в течение 30 мин в темноте в 2 мл никель-усилились раствора 3-3'-диаминобензидина (таблица 7). Будьте очень осторожны при обращении с диаминобензидина и использовать только под вытяжным шкафом; это чрезвычайно канцерогенными, даже при очень низких концентрациях.
  8. Добавить 6,5 мкл 3% H 2 O 2 в диаминобензидин содержащихРешение. Монитор пигментной реакцию в световом микроскопе, пока темно-коричневые запятнанные нейроны, четко видны. Затем сразу остановить реакцию путем промывки срезов несколько раз в фосфатном буфере.
  9. Mount ломтики с пятнами нейронов на клей, силана покрытием Histobond или желатинизированные стандартных объектов слайдов.
  10. Хранить слайды во влажной камере, по меньшей мере 80% влажности O / N. На следующий день, пусть кусочки воздушно-сухой еще в течение 10 мин. До встраивания, передачи слайдов в растворах с увеличением концентрации этанола (20 - 100%), с тем чтобы их дегидратации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс обезвоживания должен быть медленным в противном случае искажения в дендритных и аксонов процессов могут происходить 37. Если альтернативная процедура вложение выбирается, например, один с на основе глицерина Moviol, обезвоживание не требуется; Однако это может привести к неоднородной сжатия фрагмента и, следовательно, искаженная нейронов morpholoГр.
  11. Наконец, инкубировать в течение 10 мин в ксилол, вставлять кусочки в гидрофобной вложения средой для световой микроскопии и поместите ультра-тонкие покровные на вершине. Пусть скользит высохнуть в течение 20 мин при комнатной температуре.

5. нейронов Реконструкция и Synaptic Связаться Локализация

  1. Изучение слайды с biocytin меченных нейронов под световым микроскопом, снабженную 60X / 100X масла иммерсионный объектив и конденсатором с высокой числовой апертурой для оптимальной пространственной разрешающей. Убедитесь, что аксонов бутоны и дендритных шипиков, четко видны.
  2. Проследите нейроны или синаптически связанных пар нейронов при помощи промышленного нейрон систему отслеживания (табл конкретных материалов / оборудования) для получения 3D нейронные реконструкции. Провести отслеживание вручную под постоянным визуальным контролем, чтобы обнаружить даже небольшое аксонов или дендритные залогов. Для парных записей с синаптически связанных нейронов руководство трассировка еще методвыбор, потому что атрибуция например, аксонов профиль либо к пре- или постсинаптического нейрона требуется значительный опыт реконструкции.
  3. Если требуется, чтобы счетчики аксонов бутонов и / или дендритных шипиков. Потому что шипы или даже позвоночника подтипов и аксонов бутоны могут проявлять определенную распределение и плотность по отношению к например, коркового слоя или области, это может помочь охарактеризовать нервных типов клеток.
  4. Для синаптически связанных пар нейронов, проверьте пресинаптического аксона и постсинаптические дендриты для близких appositions при максимальном увеличении доступных. Заметим, в аксонов Bouton и постсинаптических дендритных позвоночника или вал находится в той же фокальной плоскости можно рассматривать как предполагаемого синаптического контакта. Отметить этот контакт в реконструкции.
  5. Исправьте нейронов реконструкции для усадки во всех трех пространственных измерениях в соответствующем разделе программы трассировки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время фиксации, гистохимические обработкаи обезвоживание значительная механическая деформация и усадка происходит; это повлияет на измерения длины аксонов и дендритных и сильно исказить их пространственное расположение. Сжатые поправочные коэффициенты для вложения среде ~ 1,1 х и у направлениях и ~ 2,1 для Z-направлении 37.
  6. Для количественного морфологического анализа с помощью программы анализа данных для нейрофизиологии (табл конкретных материалов / оборудования).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Парные записи являются методом выбора для углубленного характеристики морфологически выявленных одно- или двунаправленного синаптических связей, а также щелевых (электрический) соединения (Рисунок 1). Пример парных записи в слое 4 коры соматосенсорной ствола показано на фиг.1А. И в одном направлении возбуждающую и тормозных синаптических соединений могут быть охарактеризованы (Фиг.1В, С). Кроме парные записи позволяют записывать с двунаправленным синаптических соединени...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Парные записи с синаптически в сочетании возбуждающих и / или тормозных нейронов являются очень гибким подходом к изучению нейронных микросхем. Мало того, что этот подход позволяет оценить связь синаптическую между типами нейронов, но и позволяет определить функциональные характеристики соединения и морфологии пред- и постсинаптической нейронов. Кроме того, агонисты и / или антагонисты могут быть легко применены к нейронов в срезов препаратов. Это позволяет изучать влияние нейромодуляторов от свойств синаптической перед...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить всех членов группы "Функция нейрональных микросхем" в Институте нейронаук и медицины, INM-2, Исследовательский центр Юлиха и группу "Функция кортикальных микросхем" на кафедре психиатрии, психотерапии и психосоматики, Медицинская школа, JARA, Рейнско-Вестфальский технический университет Ахена за плодотворные дискуссии. Эта работа была поддержана исследовательской группой DFG по функции коры головного мозга (BaCoFun).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
УсилительHEKAEPC 10 USB Tripleс 2 - 3 предусилителями
МикроскопOlympusBX51WIс 2 портами камеры, объективом 4X и объективом погружения в воду 40X
КамераTILL PhotonicsVX55инфракрасная ПЗС-камера
Рабочая станцияLuigs & NeumannInfrapatch 240с моторизованным x-y столиком и моторизованной осью фокусировки для микроскопа
МикроманипуляторLuigs & NeumannSM-5x-y-z манипуляторы для 2 - 3 предусилителей
Faraday cageLuigs & Антивибрационный стол Neumann
Newport Spectra-Physics
PatchmasterHEKA
MicrotomeMicrom InternationalHM650V
Съемник микропипетокHEKASutter P-97
Neurolucida systemMicrobrightfieldс программами Neurolucida и Neuroexplorer

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hughes, G. M., Tauc, L. A direct synaptic connexion between the left and right giant cells in Aplysia. J Physiol. 197 (3), 511-527 (1968).
  2. Korn, H., Triller, A., Mallet, A., Faber, D. S. Fluctuating responses at a central synapse: n of binomial fit predicts number of stained presynaptic boutons. Science. 213 (4510), 898-901 (1981).
  3. Miles, R. Synaptic excitation of inhibitory cells by single CA3 hippocampal pyramidal cells of the guinea-pig in vitro. J Physiol. 428 (1), 61-77 (1990).
  4. Malinow, R. Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations and LTP. Science. 252 (5006), 722-724 (1991).
  5. Mason, A., Nicoll, A., Stratford, K. Synaptic transmission between individual pyramidal neurons of the rat visual cortex in vitro. J Neurosci. 11 (1), 72-84 (1991).
  6. Thomson, A. M., West, D. C. Fluctuations in pyramid-pyramid excitatory postsynaptic potentials modified by presynaptic firing pattern and postsynaptic membrane potential using paired intracellular recordings in rat neocortex. Neuroscience. 54 (2), 329-346 (1993).
  7. Buhl, E. H., Halasy, K., Somogyi, P. Diverse sources of hippocampal unitary inhibitory postsynaptic potentials and the number of synaptic release sites. Nature. 368 (6474), 823-828 (1994).
  8. Bolshakov, V. Y., Siegelbaum, S. A. Regulation of hippocampal transmitter release during development and long-term potentiation. Science. 269 (5231), 1730-1734 (1995).
  9. Debanne, D., Guerineau, N. C., Gahwiler, B. H., Thompson, S. M. Physiology and pharmacology of unitary synaptic connections between pairs of cells in areas CA3 and CA1 of rat hippocampal slice cultures. J Neurophysiol. 73 (3), 1282-1294 (1995).
  10. Miles, R., Toth, K., Gulyas, A. I., Hajos, N., Freund, T. F. Differences between somatic and dendritic inhibition in the hippocampus. Neuron. 16 (4), 815-823 (1996).
  11. MacVicar, B. A. Infrared video microscopy to visualize neurons in the in vitro brain slice preparation. J Neurosci Methods. 12 (2), 133-139 (1984).
  12. Dodt, H. U., Zieglgansberger, W. Visualizing unstained neurons in living brain slices by infrared DIC-videomicroscopy. Brain Res. 537 (1-2), 333-336 (1990).
  13. Stuart, G. J., Dodt, H. U., Sakmann, B. Patch-clamp recordings from the soma and dendrites of neurons in brain slices using infrared video microscopy. Pflugers Arch. 423 (5-6), 511-518 (1993).
  14. Debanne, D., et al. Paired-recordings from synaptically coupled cortical and hippocampal neurons in acute and cultured brain slices. Nat Protoc. 3 (10), 1559-1568 (2008).
  15. Gulyas, A. I., et al. Hippocampal pyramidal cells excite inhibitory neurons through a single release site. Nature. 366 (6456), 683-687 (1993).
  16. Silver, R. A., Lubke, J., Sakmann, B., Feldmeyer, D. High-probability uniquantal transmission at excitatory synapses in barrel cortex. Science. 302 (5652), 1981-1984 (2003).
  17. Biro, A. A., Holderith, N. B., Nusser, Z. Quantal size is independent of the release probability at hippocampal excitatory synapses. J Neurosci. 25 (1), 223-232 (2005).
  18. Crochet, S., Chauvette, S., Boucetta, S., Timofeev, I. Modulation of synaptic transmission in neocortex by network activities. Eur J Neurosci. 21 (4), 1030-1044 (2005).
  19. Bruno, R. M., Sakmann, B. Cortex is driven by weak but synchronously active thalamocortical synapses. Science. 312 (5780), 1622-1627 (2006).
  20. Constantinople, C. M., Bruno, R. M. Deep cortical layers are activated directly by thalamus. Science. 340 (6140), 1591-1594 (2013).
  21. Markram, H., Lubke, J., Frotscher, M., Roth, A., Sakmann, B. Physiology and anatomy of synaptic connections between thick tufted pyramidal neurones in the developing rat neocortex. J Physiol. 500 (Pt 2), 409-440 (1997).
  22. Gray, E. G. Axo-somatic and axo-dendritic synapses of the cerebral cortex: an electron microscope study). J Anat. 93 (Pt 4), 420-433 (1959).
  23. Uchizono, K. Characteristics of excitatory and inhibitory synapses in the central nervous system of the cat). Nature. 207 (997), 642-643 (1965).
  24. Tamas, G., Buhl, E. H., Lorincz, A., Somogyi, P. Proximally targeted GABAergic synapses and gap junctions synchronize cortical interneurons. Nat Neurosci. 3 (4), 366-371 (2000).
  25. Feldmeyer, D., Lubke, J., Silver, R. A., Sakmann, B. Synaptic connections between layer 4 spiny neurone-layer 2/3 pyramidal cell pairs in juvenile rat barrel cortex: physiology and anatomy of interlaminar signalling within a cortical column. J Physiol. 538 (Pt 3), 803-822 (2002).
  26. Feldmeyer, D., Lubke, J., Sakmann, B. Efficacy and connectivity of intracolumnar pairs of layer 2/3 pyramidal cells in the barrel cortex of juvenile rats). J Physiol. 575 (Pt 2), 583-602 (2006).
  27. Helmstaedter, M., Staiger, J. F., Sakmann, B., Feldmeyer, D. Efficient recruitment of layer 2/3 interneurons by layer 4 input in single columns of rat somatosensory cortex). J Neurosci. 28 (33), 8273-8284 (2008).
  28. Oertner, T. G., Sabatini, B. L., Nimchinsky, E. A., Svoboda, K. Facilitation at single synapses probed with optical quantal analysis. Nat Neurosci. 5 (7), 657-664 (2002).
  29. Koester, H. J., Johnston, D. Target cell-dependent normalization of transmitter release at neocortical synapses. Science. 308 (5723), 863-866 (2005).
  30. Markram, H., Lubke, J., Frotscher, M., Sakmann, B. Regulation of synaptic efficacy by coincidence of postsynaptic APs and EPSPs. Science. 275 (5297), 213-215 (1997).
  31. Egger, V., Feldmeyer, D., Sakmann, B. Coincidence detection and changes of synaptic efficacy in spiny stellate neurons in rat barrel cortex. Nat Neurosci. 2 (12), 1098-1105 (1999).
  32. Eggermann, E., Feldmeyer, D. Cholinergic filtering in the recurrent excitatory microcircuit of cortical layer 4. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (28), 11753-11758 (2009).
  33. Feldmeyer, D., van Aerde, K. I., Qi, G. Society for Neuroscience. , 335.313(2012).
  34. Radnikow, G., Gunter, R. H., Marx, M., Feldmeyer, D. Neuronal Network Analysis : Concepts and Experimental Approaches. Fellin, T., Halassa, M. 67, Springer Verlag. 405-431 (2012).
  35. Feldmeyer, D., Egger, V., Lubke, J., Sakmann, B. Reliable synaptic connections between pairs of excitatory layer 4 neurones within a single 'barrel' of developing rat somatosensory cortex. J Physiol. 521 (Pt 1), 169-190 (1999).
  36. Koelbl, C., Helmstaedter, M., Lubke, J., Feldmeyer, D. A Barrel-Related Interneuron in Layer 4 of Rat Somatosensory Cortex with a High Intrabarrel Connectivity). Cereb Cortex. , (2013).
  37. Marx, M., Gunter, R. H., Hucko, W., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Improved biocytin labeling and neuronal 3D reconstruction. Nat Protoc. 7 (2), 394-407 (2012).
  38. Biro, A. A., Holderith, N. B., Nusser, Z. Release probability-dependent scaling of the postsynaptic responses at single hippocampal GABAergic synapses. J Neurosci. 26 (48), 12487-12496 (2006).
  39. Huang, C. H., Bao, J., Sakaba, T. Multivesicular release differentiates the reliability of synaptic transmission between the visual cortex and the somatosensory cortex. J Neurosci. 30 (36), 11994-12004 (2010).
  40. Helmstaedter, M., et al. Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina. Nature. 500 (7461), 168-174 (2013).
  41. Oberlaender, M., et al. Cell type-specific three-dimensional structure of thalamocortical circuits in a column of rat vibrissal cortex. Cereb Cortex. 22 (10), 2375-2391 (2012).
  42. Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Laminar sources of synaptic input to cortical inhibitory interneurons and pyramidal neurons. Nat Neurosci. 3 (7), 701-707 (2000).
  43. Schubert, D., et al. Layer-specific intracolumnar and transcolumnar functional connectivity of layer V pyramidal cells in rat barrel cortex. J Neurosci. 21 (10), 3580-3592 (2001).
  44. Schubert, D., Kotter, R., Zilles, K., Luhmann, H. J., Staiger, J. F. Cell type-specific circuits of cortical layer IV spiny neurons. J Neurosci. 23 (7), 2961-2970 (2003).
  45. Schubert, D., Kotter, R., Luhmann, H. J., Staiger, J. F. Morphology, electrophysiology and functional input connectivity of pyramidal neurons characterizes a genuine layer va in the primary somatosensory cortex. Cereb Cortex. 16 (2), 223-236 (2006).
  46. Yoshimura, Y., Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Excitatory cortical neurons form fine-scale functional networks. Nature. 433 (7028), 868-873 (2005).
  47. Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Fine-scale specificity of cortical networks depends on inhibitory cell type and connectivity. Nat Neurosci. 8 (11), 1552-1559 (2005).
  48. Shepherd, G. M., Svoboda, K. Laminar and columnar organization of ascending excitatory projections to layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex. J Neurosci. 25 (24), 5670-5679 (2005).
  49. Bureau, I., von Saint Paul, F., Svoboda, K. Interdigitated paralemniscal and lemniscal pathways in the mouse barrel cortex. PLoS Biol. 4 (12), e382(2006).
  50. Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10 (5), 663-668 (2007).
  51. Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).
  52. Adesnik, H., Scanziani, M. Lateral competition for cortical space by layer-specific horizontal circuits. Nature. 464 (7292), 1155-1160 (2010).
  53. Molnar, Z., Cheung, A. F. Towards the classification of subpopulations of layer V pyramidal projection neurons. Neurosci Res. 55 (2), 105-115 (2006).
  54. Doyle, J. P., et al. Application of a translational profiling approach for the comparative analysis of CNS cell types. Cell. 135 (4), 749-762 (2008).
  55. Brown, S. P., Hestrin, S. Intracortical circuits of pyramidal neurons reflect their long-range axonal targets. Nature. 457 (7233), 1133-1136 (2009).
  56. Groh, A., et al. Cell-type specific properties of pyramidal neurons in neocortex underlying a layout that is modifiable depending on the cortical area. Cereb Cortex. 20 (4), 826-836 (2010).
  57. Brown, S. P., Hestrin, S. Cell-type identity: a key to unlocking the function of neocortical circuits. Curr Opin Neurobiol. 19 (4), 415-421 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

3D

Похожие статьи