Методическая статья

Функциональная оценка биологического нейротоксинов в сетевых культур стволовых клеток, полученных Центральная нервная система Нейроны

11.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52361

⸱

5 февраля 2015 г.

 ,  ,  , 
1Research Division, Cellular Molecular Biology Branch, United States Army Medical Research Institute of Chemical Defense

В этой статье

Краткое содержание

Описан пользовательский протокол для дифференцировки мышиных ЭС-клеток в определенные популяции высокочистых нейронов, демонстрирующих функционирующие синапсы и поведение эмерджентной сети. Электрофизиологический анализ демонстрирует потерю синаптической передачи после воздействия ботулинического нейротоксина серотипов /A-/G и столбнячного нейротоксина.

Аннотация

Терапевтические и механистические исследования пресинаптически целевых нейротоксинов клостридий (УНТ) были ограничены необходимостью масштабируемой, клеточно-ориентированная модель, которая производит функционирования синапсов и подвергается физиологические реакции к интоксикации. Здесь мы опишем простой и надежный способ эффективно дифференцировать мышиных эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) в определенные происхождений синаптически активных, сетевых нейронов. После протокола дифференцировки 8 дней, клеток получают нейроны мышиных эмбриональных стволовых (номеров ESN) быстро выражать и по полочкам neurotypic белки, образуют нейронные морфологии и развивать внутренние электрические ответы. К 18 дней после дифференцировки (Div 18), демонстрируют активную номеров ESN глутаматэргических и γ-аминомасляной кислоты (GABA) ергических синапсов и возникающих сетевых поведение характеризуется возбуждающим: ингибирующее баланс. Чтобы определить, интоксикация УНТ функционально противодействует ли синаптическую передачу нервного, таким образом, тиражирование йе в естественных условиях патофизиологии, который отвечает за клинические проявления ботулизма или столбняка, цельноклеточная патч зажим электрофизиологии был использован для количественного спонтанные миниатюрные возбуждающие постсинаптические токи (mEPSCs) в номеров ESN, подверженных столбняка нейротоксина (тент) или ботулинического нейротоксина (ботулинического токсина) серотипов / A- / G. Во всех случаях, номеров ESN выставлены почти полную потерю синаптической активности в пределах 20 часов. Хмельные нейроны остаются жизнеспособными, о чем свидетельствует неизменных отдыха мембранных потенциалов и собственных электрических ответов. Для дополнительной характеристики чувствительности этого подхода, зависимые от дозы эффект интоксикации по синаптической активности были измерены 20 ч после добавления BoNT / A. Отравление с 0,005 мкМ BoNT / A приводит к значительному декремента в mEPSCs, со средним ингибирующей концентрации (IC 50) 0,013 мкМ. Сравнение средние дозы показывают, что функциональные измерения синаптической торможения быстрее, точнее и чувствительнее, чем SNAREАнализы расщепления или мышь летальность анализа. Эти данные проверки использования синаптически сочетании, стволовых клеток получены нейроны для очень специфической и чувствительного обнаружения УНТ.

Введение

Основная цель данного метода заключается в функционально оценить синаптической активности в сетевых культур клеток, полученных нейронов стволовых подверженных нейротоксинов клостридий. Это первая демонстрация в пробирке, полученной модели, которая функционально повторяет pathophysiologies, ответственных за клиническими проявлениями ботулизма и проверяет номеров ESN в подходящей модели для обнаружения УНТ, терапевтического обследования и механических исследований.

BoNTs являются крайне опасная бактериальная нейротоксины, полученные членами вида Clostridium. В том числе недавно предложенной ботулинического токсина / ч, восемь отличающихся по антигенам серотипов ботулинического токсина были описаны (/ A- / ч) 1,2. Все серотипы выражены в 150 кДа пептидов, которые посттрансляционно прорезей для получения dichain, состоящую из 100 кДа тяжелой цепи (НС) и 50 кДа легкой цепи (LC), связанный дисульфидной связью 3. HC посредником связывание с пресинаптических рецепторов и ЛОРRy токсина в нейрон через синаптические эндоцитоза. Во время эндосомный обработки, HC подвергается структурной реорганизации, чтобы сформировать пор в везикулы мембраны, что облегчает перемещение в ЛЦ в пресинаптической цитозоле. LC затем специально ориентирована и расщепляет растворимый N -ethylmaleimide чувствительных привязанность слияние белка-рецептора (SNARE) белки в пресинаптической отсека: SNAP-25 (BoNT /, / C, / E), VAMP2 (BoNT / B, / D, / F, / G) или синтаксин (BoNT / C) 1. Расщепление любой из этих SNARE белков предотвращает сборку синаптической экзоцитоза техники, тем самым блокируя высвобождение нейромедиаторов. Эта комбинация эффективного нейронов адресности и пресинаптической локализации оказывает BoNTs самые мощные яды известно, по оценкам смертельных доз человека, как низко как 0,1 - 1 нг / кг 1.

Биохимические анализы могут быть использованы для обнаружения присутствия или активности CNT ЖК с высокой чувствительностью. Тем не менее, эти методы не Interrogate способность к связыванию токсина, ENTER, активировать и функции в нейронах, и поэтому косвенные и, возможно, вводящие в заблуждение меры присутствии активного токсина. В отличие от этого, функциональные пробы интоксикации, такие как мышь летальности анализа (MLA) всесторонне оценить способность УНТ успешно вести переговоры на всех этапах внедрения и активации, обеспечивая более актуальных и конкретных оценок токсина деятельности. В то время как MLA является золотым стандартом обнаружения ботулинического токсина, это метод, в естественных условиях, которая использует смерть, как конечной точки и, следовательно, имеет ограниченное применение в качестве платформы исследования. Попытки разработать модели на основе клеток УНТ опьянения, подходящей для механистических исследований и лечебных скрининга также понесли значительные ограничения. В то время как первичные культуры нейронов обеспечивают высокую степень физиологической релевантности, их использование осложняется рядом факторов, в том числе высокую стоимость ресурсов, относительно низким выходом, при наличии множественных нейронов субвиды и обширная нормативно-административный надзор связан с использованием животных. В качестве альтернативы первичных нейронов, нейрогенные клеточные линии (которые могут быть вызваны, чтобы принять нейроноподобных свойства от химической стимуляции), такие как нейробластомы и надпочечников хромаффинных клеток были использованы в качестве моделей в пробирке интоксикации. Поскольку эти клетки являются постоянно культивируют до индукции, они с высокой степенью масштабируемости и поэтому хорошо подходит для умеренно-пропускной подходов. Тем не менее, их актуальность вызывает сомнения, так как индуцированные фенотипы, как правило, неоднородны, плохо чувствительны к УНТ и не проявляют критических нейронов поведения, в том числе неспособность сформировать до и после синаптические отсеков, которые собираются в функциональную синапсов 4. При отсутствии физиологически интактных пресинаптических отсеков, полный спектр токсин: нейронных взаимодействий не могут быть воспроизведены, и поэтому функциональные измерения опьянения не возможно 5. Нетт удивительно, попытки провести механистические исследования или скрининг снадобья для BoNTs с использованием индуцированных нейрогенные клеточных линий привели в результатах, которые несовместимы с в естественных условиях и первичных исследований нейронных 6.

Было предложено, что стволовые центральной нервной системы (ЦНС) нейроны клеток получают может обеспечить следующего поколения на основе клеток платформу для исследования ботулинического токсина, который сочетает релевантности первичных нейронов с гибкостью культивируемых клеточных линий 7-10. В частности, клеток, полученных нейроны стволовых мыши (номеров ESN) были найдены, чтобы быть очень чувствительны к физиологических доз BoNT / A- / г и повторить многие в естественных ответов на интоксикации, в том числе дифференциальных persistences, с повышенной активностью интоксикации, и серотипа -специфические потенции 5,8,11. Такое поведение предположить, что в естественных условиях механизмов поглощения ботулинического токсина, обработки, торговли и деятельности сохраняются в номеров ESN. Тем не менее, ингибирование синаптической Activitу есть подпись проявление ботулизма, и, следовательно, демонстрируя потерю синаптической активности после интоксикации УНТ необходимо до заключения, что номеров ESN являются подходящими в пробирке, полученной модели на основе клеток для исследований УНТ.

Для измерения влияния интоксикации УНТ на синаптической активности, цельноклеточная патч-зажим электрофизиологии был использован для количественного моносинаптические токи в обработанных носителем или CNT-лечение DIV 21 + номеров ESN. Мы обнаружили, что опьянение номеров ESN с BoNT / A- / г или TeNT причиной> 95% потерю активности синаптической течение 20 ч во всех случаях. Дальнейшая характеристика провели 20 ч после интоксикации BoNT / показал дозозависимое влияние на синаптической активности, с пределом обнаружения ниже 0,005 мкм и IC 50 значения 0,013 мкМ. Эти результаты показывают, что чувствительность и временные рамки электрофизиологического обнаружения интоксикации значительно улучшилось по сравнению с сопоставимыми иммуноблот на основе анализирует о SNAP-25 расщеплению и в естественных условиях мыши летальности анализов, показывающие, что функциональные измерения интоксикации синаптически активных культур нейронов может способствовать более чувствительной, конкретные и быстрые методы, чтобы охарактеризовать клеточный ответ на BoNT.

Протокол

1. Адаптация ЭСК фидера бесклеточной суспензионной культуре

  1. не Оттепель ЭСК при 37 ° С до тех пор, кусочек льда остается.
  2. Использование P1000 пипетки, осторожно переносить 1 - 2,5 × 10 6 диссоциируют ESCs в не-культуры ткани обработанной чашке, содержащей 10 мл подогретого ESC среды. Инкубируйте в увлажненной инкубаторе тканевых культур в течение 20 часов при 37 ° С и 5% СО 2.
  3. После 20 ч, промыть клетки осторожно перенос подвески культуры в 15 мл коническую пробирку с использованием 10 мл серологической пипеткой. Гранулы ESCs в течение 3 мин при 200 х г. Во время спина, добавить 10 мл свежей ESC среды обратно в низкой адгезии блюдо.
  4. Отберите супернатант, стараясь избежать выбивании осадок клеток, а также добавить 1 мл свежей ESC среды в осадок клеток. Передача клеток в бактериальной блюдо с использованием пипетки P1000 и возврата в инкубаторе.
  5. Соблюдайте клетки ежедневно до агрегаты не становятся видны невооруженным глазом (обычно от 4 - 8 дней (г); агрегаты будут 0,2- 0,5 мм). Если агрегаты не очевидны после 4 дней, повторите шаг 1,3. После того, как агрегаты могут видеть, отделить и сохранить ЭСК, как описано в разделе 2.

2. ESC пассажи и обслуживание

  1. Передача ESC агрегатов до 15 мл коническую трубку, используя стерильный 10 мл пипетки и позволить агрегаты оседают на компактном гранулы (обычно 3 - 5 мин). Отберите супернатант, будьте осторожны, чтобы избежать нарушения клеточного осадка, и мыть агрегаты с 5 мл PBS. Хотя гравитационного осаждения рекомендуется, в качестве альтернативы пеллет клетки в 100 мкг в течение 2,5 мин вместо того, чтобы сэкономить время.
  2. Отберите PBS и добавить 500 мкл трипсина. Инкубируйте агрегатов в трипсином в течение 3 мин на водяной бане при 37 ° С. Добавить 500 мкл среды ESC для разбавления трипсина и осторожно растирают в 10 раз с P1000 пипетки, чтобы разбить агрегаты. Граф клеток с использованием гемоцитометра.
  3. Гранул диссоциированных клеток в течение 3 мин при 200g и ресуспендируют клеток в конечной концентрации 1,0х 10 7 клеток / мл в ESC среды. Передача 150 мкл (1,5 × 10 6 клеток) в 10 мл свежей среды ESC в 10 см бактериальной блюдо и возврата в культуре ткани инкубаторе в течение 48 ч. Избыток ЭСК могут быть дифференцированы, криоконсервации при 1 - 5 х 10 6 клеток / мл в 90% ESC среде, дополненной 10% ДМСО или выбросить.
  4. Прохождение агрегатов каждые 48 ч. Агрегаты готовые для прохождения будет ясно видно, диаметром более 0,5 мм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размораживание и культура криоконсервированных, подвески приспособлены клеток осуществляется в соответствии с пунктами 1.2 - 1.4. Агрегаты будут готовы к пересева в 48 - 72 часов.

3. дифференцировки нейронов

ПРИМЕЧАНИЕ: Проведение шаги 3,1 - 3,5 до полудня и шаг 3,7 после полудня. Обзор процедур дифференциации представлена ​​на рисунке 1А.

  1. Разбить ЭСК, как в шагах 2,1 - 2,5. Передача 350 мкл (3,5 х 10 6) диссоциируютD ЭСК в 10 см низкого прикрепления блюдо с 25 мл дифференциации среды. Поместите на орбитальном шейкере в 30 - 45 оборотов в минуту внутри инкубаторе тканевых культур при 37 ° С с 5% СО 2. Это первый день дифференциации, называется день в пробирке (DIV) -8.
    ПРИМЕЧАНИЕ: использование ультра-низким блюдо крепления увеличивает стоимость данного метода, но производит чуть больше урожая, чем бактериальные чашки Петри с агрегаты могут иногда придерживаются в чашки Петри. Если предпочтение отдается различных размеров тарелки, средние объемы и числа клеток могут быть расширены соответственно.
  2. После 48 ч (DIV) -6, использовать 25 мл пипетки для передачи отличительные клеточных агрегатов в 50 мл коническую трубку. Сразу добавить свежие 25 мл дифференциации среды в чашке Петри.
  3. Разрешить агрегаты для урегулирования более 2 - 5 мин, производя видимый осадок, который 1 - глубокая 2 мм. Игнорировать отдельные клетки или небольшие агрегаты, оставшиеся в суспензии. Тщательно аспирата среду и передать сеLL осаждения обратно в чашку Петри с помощью P1000. Место на ротационном шейкере в инкубаторе тканевых культур.
  4. В DIV -4 повторите шаг 3,2. Осадок будет 2 - глубокая 4 мм. Замена 30 мл дифференциации среду, дополненную 6 мкМ полностью-транс-ретиноевой кислоты (RA) в чашке Петри. Возврат к роторной качалке в инкубаторе тканевых культур в течение дополнительного 48 ч.
  5. В DIV -2 повторите шаг 3,3. Осадок будет 4 - 8 мм в глубину в этой точке.
  6. В DIV -1, подготовить обшивки поверхностей, как в разделе 4.
  7. В DIV 0, оттепель 5 мл предварительно аликвоты и замороженных NPC трипсинизации среде при 37 ° С в течение 5 - 10 мин и место в капюшоне культуры ткани. Использование 25 мл пипетки, передача дифференциации агрегаты объемом 50 мл коническую трубку. Разрешить агрегаты отстояться и аккуратно аспирата средой. Вымойте гранул в два раза с 10 мл PBS, что позволяет агрегаты для урегулирования между стирок.
  8. После второго PBS мыть, добавить 5 мл NPC трипсинизации среды к осадку и инкубировать при 376; С в течение 5 мин. Аккуратно вылить трубку после 2,5 мин.
  9. Добавить 5 мл 0,1% соевого ингибитора трипсина (STI), чтобы инактивировать трипсин и взболтайте. Осторожно растереть 10 - 15 раз с 10 мл серологической пипеткой до тех пор, относительно однородная суспензия клеток производится.
  10. Медленно передачи клеточной суспензии в сито 40 мкм или 70 мкм клеток, помещенной в верхней части 50 мл коническую трубку. После того как все подвески был отфильтрован, добавить 1 мл N2 среде мыть оставшиеся клетки через фильтр и пеллет Диссоцииро- клеточной суспензии в течение 6 мин при 200 х г.
  11. Отберите среду без нарушая гранул. Промыть клетки в два раза с 10 мл среды N2, гранулирования клеток в течение 5 мин при 200 х г и растиранием между промывками с P1000. До второй промывки, рассчитывать клеток с использованием гемоцитометра.
  12. Ресуспендируют клеток в N2 среды на 1 х 10 7 клеток на мл и пластины номеров ESN при плотности клеток 150 000 - 200 000 клеток / см 2.
  13. Трансфер недавно для борьбы с вредителямиред номеров ESN в увлажненной инкубаторе тканевых культур при 37 ° С и 5% СО 2 и поддерживать как и в разделе 5.

4. Подготовка Культура поверхности для Покрытие Neural прекурсоров в DIV 0

  1. Подготовка культуры ткани, обработанных блюд, по крайней мере за 1 день до посева. Добавьте достаточное количество полиэтиленимина (PEI, 25 мкг / мл в стерильной H 2 O) или поли-D-лизином (PDL; 100 мкг / мл в стерильной H 2 O), чтобы покрыть тканевых культур, обработанных пластиковых блюда и инкубировать O / N в 37 ° C.
  2. Утром покрытия, мыть посуду дважды бидистиллированной H 2 O и один раз PBS. После последней промывки, добавляют достаточное N2 среды, чтобы покрыть посуду (например, 1 мл на лунку блюдо 12-луночного или 4 мл в чашку диаметром 6 см).
  3. Подготовка 18 мм покровные стекла, по крайней мере за один день до нейрона покрытия. Чистые покровные по плазме очистки в течение 4 мин.
  4. Сразу передачи очищенных покровные с этанолом, промывают парафином на днеБольшое стерильную чашку и добавить 400 мкл PEI или PDL раствора, полученного на стадии 4.1. Инкубируйте O / N при 37 ° С в инкубаторе тканевых культур.
  5. Утром стирки покровные три раза водой и добавляют 5 мкг / мл ламинин в PBS в течение 1 - 3 ч при 37 ° С. До диссоциации нейроны, аспирации ламинином и немедленно передать покровное к яме блюдо 12-луночного содержащей 1 мл NPC среде, будучи уверенным, чтобы сохранить обработанной стороны вверх.
  6. Магазин блюда и покровные в 37 ° С до НПС не готовы к пластине.

5. Техническое обслуживание нейронов

  1. В DIV 1, аспирация среды и заменить N2 культуральной среде.
  2. В DIV 2 и 4, аспирации среды и заменить B27 культуральной среде.
  3. В DIV 8, аспирация средних и заменить B27 культуральной среде, содержащей ингибиторы митоза, чтобы устранить загрязнения, не нервных клеток.
  4. В DIV 12, заменить B27 культуральной среде.
  5. Не снимайте DIV12 + номеров ESN из 5% CO 2 до использования.

6. Измеренная Ингибирование синаптической передачи (MIST) Анализ для количественного Миниатюрные Возбуждающие постсинаптические токи

ВНИМАНИЕ: нейротоксины Clostridial являются наиболее ядовитые вещества, известные, согласно оценкам, человек LD 50 значения, как низко как 0,1 - 1 нг / кг. Получить необходимые разрешения до использования этих токсинов и использовать соответствующие меры предосторожности.

  1. Осторожно развести BoNT / A в 100 раз желаемой конечной концентрации в культуральной среде ESN и нагреваться до 37 ° С. Добавить соответствующий объем токсина на DIV 21 + ЕСН культуры, вихревой культуры блюдо, и вернуться к инкубатора.
  2. Если клетки будут проанализированы более 4 ч после интоксикации, добавить к токсин блюдо и вихрь без удаления от 5% CO 2, например, непосредственно в инкубаторе или в постоянном СО 2 камеры.
  3. В соответствующий момент времени, AspiraTE ESN культуральной среды и дважды промывали внеклеточной буфера записи (ЕРБ). Добавить 4 мл Еврорадио с добавлением 5,0 мкМ тетродотоксин и 10 мкМ бикукуллином, блокируя потенциалы действия и антагонизма ГАМК A активность рецептора, соответственно.
  4. Трансфер блюдо электрофизиологии буровой установки. Ни перфузии, ни контроль температуры необходим для MIST исследовании.
  5. Потяните боросиликатного стекла с использованием микропипетки съемник для получения записи пипетки с 5-10 мОм сопротивления и залейте внутриклеточного буфера записи. Осторожно опустите заполненную записи пипетки в силицирования реагента до записи.
  6. Использование воздуха заполненный шприц, обеспечивают положительное давление в записи пипетки опускают в ERB. После осторожного посадки записи пипетки на сомы нейрона должен быть записан, удалить избыточное давление и образуют gigaseal. Уменьшение удержания напряжения до -70 мВ. Аккуратно нанесите отрицательное давление пробиться в конфигурации целых клеток.
  7. Переключитесь на ток-зажим для мониторинга и записи мембранный потенциал покоя. Без корректировки для жидких потенциалов перехода, мембранный потенциал покоя будет между -67 до -82 мВ.
  8. Выполните непрерывный -70 мВ запись фиксации потенциала для 4 - 5 мин, чтобы обнаружить миниатюрных возбуждающих постсинаптические токи (mEPSCs).
  9. Анализ 4 мин записанных данных для выявления mEPSC с использованием программного обеспечения для обнаружения всплеска со следующими настройками: Порог, 5; Период искать локальный максимум, 10 000 мкс; Время до пика для базового уровня 5000 мкс; Период искать время затухания, 20000 мкс; Доля пика, чтобы найти время затухания, 0,37; Период в среднем базовой линии, 1000 мкс; Площадь порог, 20; Кол-во пунктов до средней пика, 1; Направление пика, отрицательный.
  10. Собирать и сохранять информацию о зарегистрированных событий. Разделите количество обнаруженных событий в 4 минут на 240, чтобы определить частоту mEPSC в Гц.
  11. Сбор mEPSC частоты для 8 - 12 продолжениеROLS и 8 - 12 BoNT обработанные образцы для каждого условия экспозиции. Анализ частоты от возрасту и грунта из контрольной группы. Определить статистическую значимость% ингибирования синаптической активности с использованием одностороннего ANOVA Испытания и после специальной Даннетта.

Результаты

Мы разработали протокол дифференциации, которая позволяет экономичное производство большого количества клеток, полученных нейронов высокой чистоты стволовых из ЭСК мыши (подробно в рис 1а) 8,11. Этот метод был использован в течение года, чтобы воспроизводимо отличить частным образом, и коммерчески доступные ESC линии в нейронах определенных линий 12-14. Критические элементы этого протокола включают в себя (1) адаптацию ЭСК фидерными бесклеточной культуральной суспензии; (2) надлежащее обслуживание суспензионных культур; и (3) дифференциации в соответствии с поворотными условиях. Переход к суспензионной культуре значительно сокращает время и затраты на обслуживание ESC, и устраняет необходимость снимать фидерные клетки до дифференциации. После адаптации подвески, Oct3 / 4 выражение соответствует по крайней мере 30 проходов, с указанием, что адаптация подвески не изменять экспрессию маркеров плюрипотентности (рис 1B-D ). ЭСК подходят для дифференцировки нейронов раз выход клеток последовательно превышает 1 х 10 7 клеток за один проход. Это обычно происходит в течение десяти проходов после адаптации подвески или пять проходов после оттаивания ЭСК, которые ранее были подвеска адаптированы. Механическое вращение дифференциации агрегатов также установлено, что решающее значение для увеличения нейронной урожая. Добавление ротационном шейкере устранены супер-образования агрегатов, увеличение совокупного жизнеспособности и получени увеличение выхода нейронных клеток-предшественников (НПС) в DIV 0 (рис 1E) ~ 300%.

Типичный дифференциация начинается с 3,5 х 10 6 ЭСК в DIV -8 и производит 115 х 10 6 NPC, на DIV 0, примерно 60% из которых будет выжить и стать нейроны. Остальные 40% включают в себя не-нейрональных клеток и в значительной степени устранены в сыворотке лишением между DIV 0 - 1. Небольшое количество сохраняющихся глии могут быть удалены путем добавления митотических Inhibitors из DIV 2 - 4 или DIV 8 - 12. Плотность Покрытие имеет решающее значение в DIV 0; нейроны покрытием слишком редко не доживает до 2 недель. Через несколько дней после посева, дифференцированные нейроны обладают нейронные морфологии и по полочкам neurotypic белки, такие как somatodendritic маркера MAP2 и аксонов маркера Тау (рис 2А). По DIV 14 Синапсины-1 + Puncta могут быть определены на axodendritic интерфейсов, указывающие на формирование синапсов. Это согласуется с экспрессией маркерных белков синаптических предшествующих DIV 7 8,11. Нервные морфологии продолжают созревать через DIV 21, в это время культуры демонстрируют сложные axodendritic беседок и большой синаптической Puncta (рис 2а). Если ведется надлежащим образом, номеров ESN остаются жизнеспособными и активными в течение по крайней мере 4 недели после посева.

Продольный профилирование выражения с РНК-последовательность подтверждается морфологическими и протеомный доказательства нейронов спецификации апбы созревания 11,15. Представительства маркеры прогрессирования развития выставлены профили экспрессии стадии конкретных, в том числе Oct3 / 4, нестин, DCX, NeuN и KCC2 (рис 2b). По DIV 0, номеров ESN выразил обильные копии нейронных конкретных структурных белков, в том числе MAP2 и Тау. В соответствии с предыдущими выводами, наблюдались маркеры только для двух нейронных подтипов: vGluT2-выражения среднего мозга / задний мозг глутаматергические нейроны и ГАМКергические интернейронов 8. Соответственно, широкий спектр глутаматэргических и ГАМК маркеров выставлены резкое увеличение в экспрессии между DIV 0 и DIV 7, в том числе пресинаптических белков SNARE, необходимых для высвобождения нейромедиатора; рецепторы нейротрансмиттеров, необходимых для пост-синаптических ответов; и леса белков, необходимых для троса эти рецепторы постсинаптической мембраны. Нейроны обладают зрелые внутренние электрические характеристики на DIV 14 и спонтанных миниатюрных возбуждающих постсинаптических токов DIV16 16.

Измеряется Ингибирование синаптической передачи (MIST) анализа была использована для оценки влияния интоксикации на синаптической активности. Сравнивая частоты mEPSC между опьянения и обработанной носителем DIV 24 + номеров ESN, туман дает количественную и измерения удельной опьянения на основе функционального торможения синаптической активности (рис 3А). MIST используют для измерения влияния BoNT / A- / г или палатке на синаптической активности в номеров ESN на 20 ч после ванны добавлением каждого токсина. Токсины были добавлены при концентрации, эквивалентной 10-кратное значение EC 50, как определено ранее иммуноблот анализа SNARE расщепления белка 11. Все токсинов снижается частоты mEPSC до менее чем 5% от обработанных носителем контрольных. Сокращение синаптических ставок не были связаны с клеточной гибели или изменены внутренние ответов, так как в состоянии алкогольного опьянения номеров ESN были пригодны исправлена, уволен повторные потенциалы действияв ответ на подачу тока и не проявлял никакого существенного изменения в мембранный потенциал покоя (рис 3б, в).

Для сравнения чувствительности туман существующих методов для обнаружения УНТ, предел обнаружения и средние ингибирующие концентрации (IC 50) были определены 20 ч после добавления BoNT / A до номеров ESN. Интоксикация как мало, как 0,005 мкМ BoNT / A производится статистически значимое снижение частоты mEPSC, с IC 50 значением 0,013 мкМ и полного молчания синаптической активности, выше 12:05 вечера (рис 4а). Это IC 50 значение соответствует приблизительно 0,5 мыши летальных единиц / мл, предполагая, что туман в два раза чувствительны и от 2 до 4-кратного быстрее, чем ОМС в обнаружения присутствия BoNT / A. Измерения иммуноблот SNAP-25 расщепления произвел EC 50 значения 12:38 вечера и минимальной обнаруживаемой дозе 12:05 вечера, указывая, что MIST примерно в 30 раз более чувствительнычем иммуноблот на основе обнаружения расщепленных SNARE белков (рис 4б).

figure-results-1
Рисунок 1. Подвеска приспособлены номеров ESN остаются митотически стабильной и выразить маркеры плюрипотентности. () Схема обслуживания и дифференциации ESC. Наличие или отсутствие ретиноевой кислоты (RA) или ингибирующий лейкоз фактор (LIF) отмечен + или -. Сравнение между дней в пробирке (DIV) и классических стадий развития (DS) для первичных культур нейрон 17. (B) распространение тарифы на R1, D3 и клеточных линий C57BL / 6J ES стабилизировать пяти проходов после перехода на суспензионной культуре. (C) проточной цитометрии данные не демонстрируют существенные изменения в Oct3 / 4 выражения в R1, D3 и клеточных линий C57BL / 6J ES измеренное в 25 проходов в суспензионной культуре (N = 6 для каждого). (D) Фактический ресурс клеток при рутинной пассажей для подвески приспособлены R1 ESC линии, измеренной между проходами 5 и 30 (черная линия). Теоретические кумулятивные выходы, если клетки не отбрасываются при пассирования также представлены (красная линия). (E) светлого поля изображения DIV 0 агрегатов, выпускаемых под статической (слева) и поворотные условиях (справа). Поворотные условия производства сферические агрегаты без агломерации и увеличение NPC дает 3 раза (р <0,001, определяется с использованием т-теста Стьюдента) 11. * Обозначает Р <0,05. Эта цифра была изменена от Хаббарда и др. 11 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2. Морфологические, прoteomic и транскриптомных свидетельствует о нейронов спецификации и созревания () Иммуноцитохимия от DIV 7 -. DIV 49 демонстрирует нейронов разветвление и внешний вид синаптической Puncta на axodendritic интерфейсов. Аксоны помечены Тау (зеленый), дендриты помечены MAP2 (красный), пресинаптических отсеков помечены Синапсины (белый), и ядра окрашиваются DAPI (синий). (B) Продольная выражение профилирование представительных генов, демонстрирующих процесс развития выражение стадии конкретных и указанием нейронов подтипов. Все генные транскрипты выражается в приблизительном количестве транскриптов на клетку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3. номеров ESN под. перейти ингибирование синаптической активности при воздействии BoNT / AG и палаточные () Характерные следы от номеров ESN собраны 20 ч после ванны добавлением ~ 10 х EC 50 значения BoNT / A - / G, палатка или транспортного средства. Каждый нейротоксин уменьшается синаптической активности более чем на 95% по сравнению с контрольной группой. (B) Хмельные нейроны оставались в состоянии стрелять повторные точки доступа в ответ на деполяризации тока инжекции (как показано на BoNT / A, но наблюдалось во всех опьянения культур) и (С) показывает отсутствие изменений в отрицательном мембранный потенциал покоя (С, N> 18 для каждой обработки). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4. Определение чувствительности Туман в BoNT / A-лечениеИзмерения туман синаптической активности 20 ч после ванны добавления BoNT / A номеров ESN. (). Представительства сегменты напряжения зажим следы выставлены снижение частоты mEPSC следующий BoNT / A воздействия (левая сторона). Количественный mEPSC частоты (гистограммы, справа, N = 20 в контрольной группе; N = 11 - 22 для каждой дозы) подтверждает дозозависимое снижение частоты mEPSC. Средние ингибирующие концентрации определяли с помощью наименьших квадратов из нелинейной регрессии с использованием переменным наклоном четыре параметра (R 2> 0,91). Обратите внимание на предел обнаружения тумана в номеров ESN, по крайней мере 0,005 мкм. (B) BoNT / интоксикация приводит номеров ESN в расщеплении SNAP-25, как визуализировать сдвигами гель мобильности (представительство западной пятно на левой стороне с собой диаграмму, показывающую количественного SNAP-25 расщепления на право, N = 4) , Обратите внимание на снижение чувствительности с помощью расщепления белка SNARE (SNAP-25) в качестве конечной точки (EC 50 12:36 вечера) по сравнению с MIST (IC 50 0,013 мкМ). * Обозначает Р <0,05; *** Указывает на P <0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

Ток золотой стандарт для обнаружения УНТ, определения серотипа и количественного определения ГНД. MLA опрашивает весь диапазон хоста: токсин, необходимых для взаимодействия интоксикации происходит в естественных условиях (например, токсин связывания с рецептором клеточной поверхности, интернализации токсина-рецепторного комплекса, LC транслокации в цитоплазму, LC-опосредованного расщеплени субстрата и ингибирование синаптической нейротрансмиссии) 18. Однако, несмотря на ГНД предлагает физиологический модель опьянения, это ресурсоемкий, можно смешивать загрязнителями и включает в себя большое количество мышей со смертью в качестве конечной точки. Альтернативно, анализы на основе клеток для детекции и количественного BoNT были ограничены первичных культурах нейронов, которые также требуют использования животных, или линий клеток нейробластомы, которые не способны формировать синапсы и, как правило, обладают низкой чувствительностью к нейротоксинов 8. На сегодняшний день, большинство измерений интоксикации в гоESE платформы на основе клеток полагались на обнаружении протеолитического расщепления SNAP-25, VAMP1 / 2 или синтаксина-1 11. Это проблематично, поскольку SNARE белка расщепление было показано, что нелинейно связаны с ингибированием синаптической в естественных условиях, и, следовательно, не может точно отражать интоксикацию или восстановление после интоксикации 19,20.

Идеальный сотовый основе модели системы для обнаружения УНТ бы (я) будет нейрон основе; (II) можно синаптически в сочетании с neurotypic электрических ответов; (III) весьма чувствительны ко всем серотипов УНТ или подтипов; и (IV) предложение масштабируемости, производительности и аналитические раз, эквивалентные или улучшенные над ОМС, по более низкой цене, и без необходимости использования животных. Для удовлетворения этих требований, мы разработали способ получения больших количеств высокообогащенного, сетевых культур глутаматэргическую и ГАМК нейронов из коммерчески доступных мыши ЭСК линий. Затем мы разработали туман анализа для количественногосинаптической торможения в ответ на интоксикацию с палаткой и BoNT / A- / G. В то время как MIST анализ может проводиться на любом синаптически активного нейрона населения (например, первичные нейроны или срезах мозга), в настоящее время номеров ESN являются только в пробирке происходит модель нейрона, что воспроизводимо развивается сеть поведения возникающие и поэтому подходит для MIST исследовании.

Производство достаточного количества нейронов определенного рода для исследований УНТ потребовалось несколько нововведений в ESC культуры и дифференциации. Во-первых, путем выбора для культивирования и ESCs, которые могут выжить подвески-адаптации, мы исключили возможность загрязнения фидерными клетками и необходимостью очистки фидерные клетки от ESCs в начале дифференциации. Хотя молекулярные механизмы, лежащие в основе суспензионного адаптации неизвестны, подвески приспособлены ЭСК оставаться митотически активны, сохраняют Oct3 / 4 выражение и продолжают быть нейрогенной. Используя этот метод, ~ 1,5 х 10 7 EСК, как правило, восстанавливается каждый проход. Во-вторых, производство НПС была увеличена ~ 300% за счет включения механическое перемешивание, чтобы предотвратить агломерацию в процессе дифференциации, якобы повышение доступности питательных веществ интерьеров агрегатов. В процессе мы обнаружили, что сыворотка используется для ESC культуры и дифференцировки нейронов является наиболее важным компонентом в поддержании нейрогенные ЭСК. Для лучшего успеха, мы рекомендуем подвеску с адаптацией ЭС клетки к каждому участку сыворотки и накопления запасов сыворотку при -20 ° С, чтобы поддержать ESC культуры и дифференцировку нейронов в течение срока действия.

Как и в большинстве синаптически активными культурами, DIV 14 + номеров ESN очень чувствительны к резким изменениям рН, и даже кратковременного воздействия атмосферных концентраций СО 2 может привести к нейротоксичности в течение 24 часов. Для экспериментов, требующих лечения культур с последующим инкубации продолжительностью O / N или больше, нейроны должны рассматриваться непосредственно яп инкубатор или переданы на постоянное CO 2 камеры до эксперимента.

Различные методы подтвердил нейрогенез и нейронов созревания, в том числе МТП, транскрипции профилирования и целых клеток патч-зажим электрофизиологии. Временные изменения в экспрессии генов и нейронов морфологии согласуются с быстрым прогрессированием через стадии развития нейрогенеза, и DIV 16, номеров ESN выставлены возбуждающие и подавляющие миниатюрные постсинаптические токи с возникшей сети поведения 16. Свидетельство синаптической активности предположил, что номеров ESN может повторить pathophysiologies, ответственных за клиническими проявлениями ботулизма и столбняка. Это было подтверждено с помощью MIST, чтобы показать, что интоксикация ботулинического токсина / A- / г или палатку нарушение mEPSC частот от> 95% по сравнению с обработанных носителем или необработанными нейронами.

Измерения чувствительности туманом на BoNT / A указал на средние ингибирующиеконцентрация (IC 50) 0,013 мкМ (эквивалентно 0,5 мыши летальной ед / мл) и предела-о-обнаружения ниже 0,005 мкМ, измеренный при 20 ч после ванны того. Основываясь на этих ценностях, MIST примерно в два раза чувствительнее и 2 - 4 раза быстрее, чем ОМС и в 30 раз более чувствительны, чем иммуноблот на основе обнаружения расщепленных SNAP-25.

В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что сетевые популяции клеток, полученных нейронов стволовых предлагают физиологический, клеточно-ориентированная модель опьянения. В сочетании с улучшенными методами, чтобы получить сетевые культуры ESN от подвески приспособлены ЭСК, использование MIST должны уменьшить необходимость проведения испытаний на животных и их недостатки, затрат и этических проблем, ОМС, обеспечивая более быстрое, чувствительные и специфические меры интоксикация. Хотя цельноклеточная патч-зажим электрофизиологии является метод с низкой пропускной для идентификации присутствия активных нейротоксинов, он предлагает разрешение и спеЭду, что недостижимо с помощью молекулярных методов. Эти результаты также свидетельствуют о том, что применение активности в зависимости от методов оценки синаптической активности и поведение сети может позволить быстрое и специфической детекции нейротоксинов. Такие подходы выше пропускная бы механистические исследования, терапевтическое или диагностических анализов возможные для широкого круга neuromodulatory агентов, в том числе УНТ.

Раскрытие информации

Правительство США подало две международные патентные заявки, которые включают методы, описанные в этой статье: PCT/US2014/22042 под названием «Способы обнаружения нейротоксина с использованием синаптической активности»; и PCT/US13/40641 под названием «Обнаружение токсинов с использованием нейронов, полученных из стволовых клеток».

Благодарности

Эта работа финансировалась Национальным институтом Национального института здравоохранения аллергии и инфекционных заболеваний (IAA номер AOD12058-0001-0000) и обороны Агентство по уменьшению угрозы в - совместных научно-технических отделение, медицинская Отдел S & T (номера грантов CBM.THRTOX.01.10 .RC.023 и CBM.THRTOX.01.RC.014). Это исследование было проведено в то время как PB провел защиты от угроз Снижение Агентства Национальный исследовательский совет по исследованиям в Associateship премии и KH провел Национальный исследовательский совет по исследованиям в Associateship Award. Мы благодарим Ангела Адкинс и Кейли Tuznik (USAMRICD) для оказания технической помощи; и Синди Kronman (USAMRICD) за помощь в редактировании. Мнения, выраженные в этой статье, являются мнениями авторов и не отражают официальную политику Департамента армии, министерства обороны или американского правительства.

Материалы

Таблица 3. Оборудование и программное обеспечение
Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Таблица 1. ESC и ESN
Knockout DMEMLife Technologies10829-018Среда: ESC культуральная среда
Рецептура и примечания: 500 мл
100x MEM NEAALife Technologies11140-050Среда: хранить при 4 ° C для приема до 1 месяца<бр/> Состав и примечания: 6 мл
200 мМ L-аланил-L-глутаминATCC30-21156 мл
ES квалифицированный FBSПрикладные стволовые клеткиASM-500790 мл
100x антибиотикиSigma-AldrichA59553 мл
55 мМ 2-меркаптоэтанолLife Technologies21985-0231,1 мл
107 единиц/мл LIFMilliporeESG110760 μ L
Knockout DMEMLife Technologies10829-018Среда: среда для дифференцировки ESC
Рецептура и примечания: 436,6 мл
100x MEM NEAALife Technologies11140-050Среда: хранить при температуре 4 °°; C в течение 1 месяца
Состав и примечания: 5 мл
200 мМ L-Alanyl-L-GlutamineATCC30-21155 мл
сыворотки, отвечающей требованиям ESCПрикладные стволовые клеткиASM-500750 мл
100x антибиотикиSigma-AldrichA59552,5 мл
55 мМ 2-меркаптоэтанолLife Technologies21985-0230,9 мл
PBS Dulbecco's PBSSigma-AldrichD8537Среда: NPC трипсинизация среда
Состав и примечания: 100 мл
0,5 М ЭДТА (18,3%)Sigma-Aldrich3690Среда: заморозить в 5 мл алиquote
Состав и примечания: 0,266 мл
трипсинаSigma-AldrichT880250 мг
полиэтиленимина (PEI)Sigma-AldrichP3143Среда: Решения для поверхностных покрытий
Рецептура и примечания: 2.5 & микро; г/мл в H20
поли-D-лизина (PDL)Sigma-AldrichP7280Среда: использовать в пределах 1 недели<бр/> Состав и примечания: 100 &m; г/мл в H20
LamininSigma-AldrichL20205 µ г/мл в H20
DMEM/F12 + GlutaMAXLife Technologies10565-018Среда: NPC культуральная среда
Рецептура и примечания: 492,5 мл
100x N2 витаминовLife Technologies17502-048Среда: хранить при 4 ° C на срок до 1 месяца
Состав и примечания: 5 мл
100x антибиотиковSigma-AldrichA59552,5 мл
[header]
Neurobasal ALife Technologies10888-022Среда: ESN культуральная среда
Формула и примечания: 482,5 мл
50x витаминов B27Life Technologies17504-044Носители: хранить при 4 градусах; C до 1 месяца<бр/> Состав и примечания: 10 мл
200 мМ L-аланил-L-глутаминATCC30-21155 мл
100x антибиотикиSigma-AldrichA59552,5 мл
5-фтор-2'-дезоксиуридин (5FDU)Sigma-AldrichF0503Среда: 2000x Ингибиторы митоза аликвот и хранить при -20 °°; C
Состав и примечания: дд 150 мг 5FDU и 350 мг уридина до 10 мл Нейробазала А. Стерильный фильтр, аликвот и заморозка. Используйте 2000x в питательной среде ESN.
UridineSigma-AldrichU3003
TrypLE Express TrypsinLife Technologies12605-010Среда: Разное
Состав и примечания: хранить в RT
DMSOSigma-AldrichD8418хранить в RT
ингибитор трипсина сои (ИППП)Sigma-AldrichT6414хранить при -20 > C
этанолSigma-AldrichE7023хранить в RT
аскорбиновую кислотуSigma-AldrichA4403Приготовьте 100 мМ запаса, растворив 100 мг аскорбиновой кислоты в 5,7 мл смеси 50:50 ДМСО/этанол.
ретиноевая кислота (РА)Sigma-AldrichR2625Ресуспендия 15 мг РА в 9 мл 50:50 ДМСО/этанол. Добавьте 1 мл 100 мл аскорбиновой кислоты. Аликвота и хранится при -80 °C. Стабильно в течение 6 мес.
Таблица 2. MIST
NaClSigma-Aldrich71386Среда: Внеклеточный записывающий буфер
Конечная концентрация (мМ): 58,44
МВт: 140
KClSigma-Aldrich60135Среда: (ERB; pH = 7,3, 315 мО)
Конечная концентрация (мМ): 74,56
МВт: 3,5
2PO4Sigma-AldrichS3139Среда: стабильная при 4 градусах; C для не менее 6 мес.<бр/> Конечная концентрация (мМ): 119,98<бр/> МВт: 1,25
CaCl<суб>2Сигма-Олдрич21115Конечная концентрация (мМ): 110,98<бр/> МВт: 2
МгКл<суб>2Сигма-Олдрич63069Конечная концентрация (мМ): 95,21<бр/> МВт: 1
D-глюкозаСигма-ОлдричG8644Конечная концентрация (мМ): 180,16<бр/> МВт: 10
HEPESSigma-AldrichH0887Конечная концентрация (мМ): 238,3<бр/> МВт: 10
K-глюконатSigma-AldrichP1847Среда: Внутриклеточный записывающий буфер<бр/> Конечная концентрация (мМ): 234,5<бр/> МВт: 140
NaClСигма-Олдрич71386Среда: (IRB; рН = 7,3, 320 мО)<бр/> Конечная концентрация (мМ): 58,44<бр/> МВт: 5
мг-АТФSigma-AldrichA9187Среда: Стабильно при 4 °°; C для не менее 6 мес.<бр/> Конечная концентрация (мМ): 507,18<бр/> МВт: 2
Li-GTPSigma-AldrichG5884Конечная концентрация (мМ): 523,18<бр/> МВт: 0,5
CaCl<суб>2Сигма-Олдрич21115Среда: стабильная при 4 & град; C для не менее 6 мес.<бр/> Конечная концентрация (мМ): 110,98<бр/> МВт: 0,1
MgCl<суб>2Сигма-Олдрич63069Среда: стабильна при 4 &d; C для не менее 6 мес.<бр/> Конечная концентрация (мМ): 95,21<бр/> МВт: 1
EGTASigma-AldrichE3889380,35
HEPESSigma-AldrichH0887Среда: Стабильная при 4 & град; C для не менее 6 мес.<бр/> Конечная концентрация (мМ): 238,3<бр/> МВт: 10
бикукуллинTocris131Среда: Разное<бр/> Конечная концентрация (мМ): 0,01<бр/> МВт: 417,85
CNQXSigma-AldrichC239Конечная концентрация (мМ): 0,01<бр/> МВт: 276,12
ТетродотоксинSigma-AldrichA8001Конечная концентрация (мМ): 0,005<бр/> МВт: 645.74
BoNT/A-/GМетабиологические препаратыН/ДСреда:
Конечная концентрация (мМ): TBD
МВт: 150 000
Столбнячный токсинSigma-AldrichT3194Конечная концентрация (мМ): TBD
МВт: 150 000
SigmacoteSigma-AldrichSL-2Конечная концентрация (мМ): N/A
МВт: N/A<
MiniAnalysis (версия 6.0.7)Synaptosoft, Inc.Н/ДПрограмма для детектирования событий
Igor Pro (версия 6.22A)WaveMetricsН/ДПрограмма для визуализации записей
PatchmasterHekaN/AПрограмма для сбора данных
Olympus IX51 инвертированный микроскопOlympusN/A
микроманипуляторSutter InstrumentMPC-365
патч-клэмпинг усилительСъемникECB10USB
Инструмент SutterP-1000
боросиликатные капиллярные трубкиИнструмент SutterB150-86-10Corning 7740
18 мм стеклянные покровные стеклаFisher12-545-84
очиститель плазмыHarrick PlasmaPDC-32G
клеточный фильтр (40 & микро; m)Fisher08-771-1
Шейкер для танцовщицы живота StovallFisher15-453-211
посуда с низкой адгезиейFisher05-539-101Corning 3262
бактериальная посудаVWR25384-302100 x 15 мм
, td colspan="4"> микропипеток Heka

Ссылки

  1. Simpson, L. L. Identification of the major steps in botulinum toxin action. Annual Review Of Pharmacology And Toxicology. 44, 167-193 (2004).
  2. Dover, N., Barash, J. R., Hill, K. K., Xie, G., Arnon, S. S. Molecular Characterization of a Novel Botulinum Neurotoxin Type H Gene. The Journal Of Infectious Diseases. , (2013).
  3. Singh, B. R. Botulinum neurotoxin structure, engineering, and novel cellular trafficking and targeting. Neurotoxicity Research. 9, 73-92 (2006).
  4. Larsen, J. C. U. S. Army botulinum neurotoxin (BoNT) medical therapeutics research program: past accomplishments and future directions. Drug Development Research. 70, 266-278 (2009).
  5. McNutt, P., Celver, J., Hamilton, T., Mesngon, M. Embryonic stem cell-derived neurons are a novel, highly sensitive tissue culture platform for botulinum research. Biochem Bioph Res Co. 405, 85-90 (2011).
  6. Eubanks, L. M., et al. An in vitro and in vivo disconnect uncovered through high-throughput identification of botulinum neurotoxin A antagonists. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 2602-2607 (2007).
  7. Pellett, S., et al. Sensitive and quantitative detection of botulinum neurotoxin in neurons derived from mouse embryonic stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 404, 388-392 (2011).
  8. Mesngon, M., McNutt, P. Alpha-Latrotoxin Rescues SNAP-25 from BoNT/A-Mediated Proteolysis in Embryonic Stem Cell-Derived Neurons. Toxins. 3, 489-503 (2011).
  9. Kiris, E., et al. Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery. Stem Cell Res. 6, 195-205 (2011).
  10. Whitemarsh, R. C., et al. Novel application of human neurons derived from induced pluripotent stem cells for highly sensitive botulinum neurotoxin detection. Toxicological Sciences. 126, 426-435 (2012).
  11. Hubbard, K. S., et al. High yield derivation of enriched glutamatergic neurons from suspension-cultured mouse ESCs for neurotoxicology research. BMC Neurosci. 13, 127(2012).
  12. Brook, F. A., Gardner, R. L. The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 5709-5712 (1997).
  13. Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium. Journal Of Embryology And Experimental Morphology. 87, 27-45 (1985).
  14. Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 8424-8428 (1993).
  15. Hubbard, K., Gut, I. M., Lyman, M. E., McNutt, P. M. Longitudinal RNA sequencing of the deep transcriptome during neurogenesis of cortical glutamatergic neurons from murine ESCs. F1000Research. 2 (35), (2013).
  16. Gut, I. M., et al. Novel application of stem cell-derived neurons to evaluate the time- and dose-dependent progression of excitotoxic injury. PLoS One. 8, e64423(2013).
  17. Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 8, 1454-1468 (1988).
  18. Capek, P., Dickerson, T. J. Sensing the deadliest toxin: technologies for botulinum neurotoxin detection. Toxins. 2, 24-53 (2010).
  19. Raciborska, D. A., Trimble, W. S., Charlton, M. P. Presynaptic protein interactions in vivo: evidence from botulinum A, C, D and E action at frog neuromuscular junction. The European Journal Of Neuroscience. 10, 2617-2628 (1998).
  20. Baskaran, P., Thyagarajan, B. Acute and chronic effects of botulinum neurotoxin a on the mammalian neuromuscular junction. Muscle & Nerve. 50, 206-215 (2014).

Перепечатки и разрешения

Теги

Clostridium
Функциональная оценка биологического нейротоксинов в сетевых культур стволовых клеток, полученных Центральная нервная система Нейроны
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.