Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Простой Critical размера бедренной кости Дефект Модель на мышах

13.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52368

⸱

15 марта 2015 г.

 ,  , 
1Institute for Regenerative Medicine at Scott & White Hospital, Texas A&M Health Science Center, 2Department of Orthopedic Surgery, University of Texas Medical Branch, 3Molecular and Cellular Medicine, Texas A&M Health Science Center

В этой статье

Краткое содержание

Животные модели часто используются для имитации серьезных повреждений костей в биомедицинских исследованиях. Из-за их малых размеров установление стабилизированных поражений костей у мышей выходит за рамки возможностей большинства исследовательских групп. В данной работе мы описываем простой метод установления и анализа экспериментальных дефектов бедренной кости у мышей.

Аннотация

Хотя кость обладает замечательной способностью к регенерации, серьезная травма кости часто приводит к повреждениям, которые не заживают должным образом. На самом деле, одна десятая всех переломов костей конечностей не заживает полностью из-за степени травмы, заболевания или возраста пациента. Наша способность улучшать регенеративные стратегии костей в решающей степени зависит от способности имитировать серьезные травмы костей у подопытных животных, но генерация и стабилизация больших повреждений костей технически сложна. В большинстве случаев серьезная травма длинной кости имитируется экспериментально путем установления дефекта, который не заживает естественным образом. Это достигается за счет полного удаления костного сегмента, размер которого более чем в 1,5 раза превышает диаметр поперечного сечения кости. Затем кость стабилизируется с помощью металлического имплантата для поддержания правильной ориентации краев перелома и обеспечения подвижности.

Из-за их маленького размера и хрупкости длинных костей, установление таких поражений у мышей выходит за рамки возможностей большинства исследовательских групп. Таким образом, модели дефектов длинных костей ограничены крысами и более крупными животными. Тем не менее, мыши дают значительные исследовательские преимущества в том смысле, что они могут быть генетически модифицированы и выведены как иммунокомпрометированные штаммы, которые не отторгают человеческие клетки и ткани.

Здесь мы демонстрируем метод, который облегчает создание сегментарного дефекта в бедре мыши с использованием стандартного лабораторного и ветеринарного оборудования. С практикой изготовление фиксирующего устройства и хирургическая имплантация становятся возможными для большинства обученных ветеринаров и персонала, проводящего исследования на животных. Используя данные примеров, мы также предоставляем методологии для количественного анализа заживления костей для модели.

Введение

Считается, что половина населения США испытывают на разрыв в возрасте 65 1. Для тех пациентов с переломами хирургическое лечение, 500000 процедуры предусматривают использование костного трансплантата 2, и это число будет расти с более стареющего населения 3 , Хотя кости является одним из немногих органов, который имеет потенциал, чтобы полностью исцелить без рубцов, бывают случаи, когда процесс не 3,4. В зависимости от обстоятельств и качество лечения, 2-30% от переломов длинных костей неудачу, в результате чего не состоящих в профсоюзе 3,5. Хотя остаются некоторые дебаты по определению, ложных, критических размеров или не состоящих в профсоюзе повреждений костей, как правило, относится к травме, которая не заживает в течение естественного жизни субъекта 6. Для экспериментальных целей, эта продолжительность сокращается в среднем время, необходимое для полного заживления среднего размера травмы костей. Номера для профсоюзов повреждения кости происходят на питгими причинами, но основные факторы включают в себя тяжелейшие психологические травмы в результате критически размера зазора, инфекции, плохое ангиогенеза, употребление табака, или заторможенной мощностью osteoregenerative из-за болезни или возраста 7. Даже если она не профсоюзы успешно лечить, она может стоить более $ 60000 в порядке, в зависимости от типа травмы и подходов, используемых 8.

В умеренных случаях используется аутологичных костная пластика. Эта стратегия включает в себя восстановление кости с сайта донора и имплантации на месте травмы. Хотя такой подход является весьма эффективным, объем доступной доноров, полученных кости ограничен, и процедура включает в себя дополнительную операцию, что приводит к постоянной боли у многих пациентов 9,10. Кроме того, эффективность в аутологичного костного трансплантата зависит от состояния здоровья пациента. Костные заменители, изготовленные из синтетических материалов или обработанные трупной кости в изобилии доступны 11-13, но они гаве существенные ограничения, в том числе бедных адгезионных свойств клетки-хозяина, снижение Остеокондуктивность и потенциал для иммунного отторжения 14. Существует поэтому острая необходимость в регенерации кости технологий, которые являются безопасными, эффективными и широко доступны.

Наша способность улучшить регенеративные стратегии кости в значительной степени зависит от способности имитировать серьезную кости травмы в подопытных животных, но поколение и стабилизация больших костных поражений технически сложной задачей. В большинстве случаев, серьезные травмы длинную кость имитируется экспериментально путем создания дефект, который не будет, естественно, лечить. Хотя это может изменяться в зависимости от вида 15, это достигается за счет полного удаления сегмента кости, который больше, чем в 1,5 раза диаметр кости поперечным сечением 16. Затем кости, стабилизированного металлического имплантата, чтобы сохранить правильную ориентацию краев трещин и позволяют мобильности. Из-за их небольшого размера и хрупкостиих длинные кости, создание таких поражений у мышей находятся за пределами возможностей большинства научно-исследовательских групп. Таким образом, модели длинную кость дефект ограничены крыс и более крупных животных. Тем не менее, у мышей себе значительные исследовательские преимущества в том, что они могут быть генетически модифицированные и разводили в ослабленным иммунитетом штаммов, которые не отвергают человека клетки и ткани.

Для приложений, основанных на человеческих клетках мышей иммунитетом являются привлекательными для работы, потому что они являются физиологически хорошо характеризуется, легко дома, экономически эффективным и легко проанализировать рентгенологически и гистологически. Первостепенное значение в том, что у мышей иммунитетом не отвергают клетки от различных видов, включая человека. Их небольшой размер позволяет также тестировать очень небольшого числа клеток или объемов экспериментальных лесов в ортопедической практике. Несколько мышиных ортопедические модели сообщалось, что позволить себе различные степени стабильности костной 17,18. Те, страховочныеMS, которые приводят к очень высоким уровнем устойчивости, таких как внешние фиксаторы и стопорных пластин преимущественно лечить путем Intramembranous оссификации хотя эндохондральной заживления сообщалось 19. В отличие от этого, те, которые допускают определенную микро- и / или макро-движение, например те, которые используют нефиксированных или частично фиксированной мозговидной контактов, как правило, заживают с преобладанием эндохондральной окостенения 20,21. Задержка союз или не союз дефектов длинных костей, особенно трудно достичь в мышах в связи с повышенным уровнем стабилизации требуется. Тем не менее, были зарегистрированы несколько подходов, в том числе мозгового штифтов с блокировкой ногтей, фиксирующих пластин и внешних фиксаторов 22. Эти системы обычно работают хорошо, но, учитывая их сложную конструкцию, они могут быть технически сложными в установке. Например, Гарсиа и др. 23 разработали элегантную блокировки системы контактный для использования в мышах, но процедура включает разрезы на двух отдельном местес и обширной модификацией бедренной кости, чтобы приспособить штифты. Эти процедуры были выполнены при вскрытии микроскопом.

Здесь мы опишем простой бедренной мозгового штифт с центральной воротником, предназначенную для предотвращения закрытия 3 мм дефицита костной, а также очертить оригинальные края дефекта. В то время как вывод не был установлен на самой кости, точное определение размеров диаметра шпильки и развёртывания медуллярного результатов полость, в достаточной вмешательства к минимуму торсионного движения (рисунок 1). При тщательном выборе инбредной возраста, пола и деформации соответствием мышей, результат хорошо воспроизводим гипертрофическая без uniondefect 22, которые могут быть легко оценены рентгенологически. Кроме того регионах, представляющих интерес может быть воспроизводимо определяется после микро-компьютерной томографии (μCT) для измерения De Novo формирования костной ткани и Гистоморфологические параметров. Выводы были прототипы в нашей лаборатории с помощью легко доступных инструментов.

figure-introduction-1
Рисунок 1: Экспериментальная принцип Схематическое резюме сегментной модели дефекта.. Центральный сегмент 3 мм из 9-10 мм мышиного бедра вырезали хирургическим (слева). Длиной 3 мм, 19 калибра хирургической стали трубки пропускают через 9 мм длиной, 22 г трубку из нержавеющей стали и фиксируется с помощью клея точно в центре (справа). Полученный штифт вставлен в мозговых каналов остальных проксимальных и дистальных отделов бедренной кости с 19 г воротник с заменой 3 мм сегмент кости (ниже, в центре).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол предназначен для женской обнаженной (Nu / J) мышей (18-25 г, 6 недель), полученной из Jackson Laboratories. Так штаммы мышей незначительно отличаться с точки зрения анатомии и темпы роста, мы советуем изготовление булавок оптимизирован для штамма, пола и возраста получателей перед имплантацией в живых субъектов. Если штаммы тщательно подобраны, посадки с натягом между стержнем и полости костного мозга является высокой воспроизводимостью. Процедуры для жилья, питания и общего животноводства выходят за рамки этого протокола, но все мыши были размещены в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных (8-е издание) и институциональной политики, установленной Уходу за животными и Использование комитет (IACUC) и кафедрой сравнительной медицины (DCM) на Скотта и Белого больницы.

1. Изготовление Пен

figure-protocol-1
Рисунок 2: сборка PIN-код. () Фотографии хирургического стальных труб на различных стадиях сборки и 4 мм, вырезанные Диаметр цилиндра от 5 мм толщиной Gelfoam лист. (Б) после полировки собранный штифт (выше), Gelfoam цилиндр подстрижены, расположен над стали Воротник (средний), а затем выдерживают в автоклаве, в результате чего стерильного штифта с покрытием сушили Gelfoam. Это улучшает прикрепление клеток в месте повреждения и сохраняет направление исцеления (ниже). (С) Иссеченную бедра оснащены костномозгового штифта. (D) Примеры штифта на различных толщин и длин демонстрируя гибкость этого подхода. (Е) μCT реконструкция контактный стабилизированного бедренной дефекта, иллюстрирующий взаимодействие мозгового штифта с губчатой ​​кости в проксимальных и дистальных концах бедренной кости.

  1. Сокращение длины 9 мм 22 г нержавеющей подкожной трубки, и длину 3 мм, 19 г трубопроводов при использовании армированного стекловолокна диаметром 23,8 мм сверхмощный отсечки колесо, установленное на роторном инструмента. Использование малых плоскогубцы остроконечного для иммобилизации трубки (фиг.2а, выше). Носите соответствующую защиту для глаз и обрабатывать ротационный инструмент с осторожностью.
  2. Нанесите небольшое количество (приблизительно 10 мкл) цианакрилатного кле к середине 9 мм вала. не Пропустите 3 мм воротник над 9 мм вал, пока в центре и крутить, чтобы равномерно распределить клей между воротником и вала. Измерение размеров с парой цифровых суппорты и сравнить с фиг.1. Разрешить, чтобы установить, по крайней мере, 15 ч (фиг 2А, в центре).
  3. Используйте 220 грит наждачной пропитанный диск с для удаления заусенцев и чрезмерных клей.
  4. Использование ротационный инструмент, шлифовать штифт с помощью войлочных полировальных диска.
  5. Промойте дистиллированной водой и насухо Compressed воздуха.
  6. Целостность испытаний, помещая 19 г подкожного тупую иглу на вал вновь из пальца и нажатием против воротника. Убедитесь, что воротник может противостоять приблизительно 25 г веса.
  7. Промыть штифт в стерилизованного фильтрацией фосфатным буферным раствором (фиг.2В, сверху). Убедитесь, что вал штифт плотно в бедренную медуллярной полости с воротником вплотную к краям разреза кости (рис 2С). Прототип различные конфигурации для конкретных целей исследования и получателя (Рисунок 2D). Убедитесь, что концы штифта проникать в трабекулярной кости диафиза так, чтобы максимизировать фиксацию и улучшить посадку с натягом (рис 2E).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется, чтобы посадка испытания на образцах костного перед имплантацией в живом мышей (например, рис 2С).
  8. Используйте диаметром 4 мм Punch-биопсия резак для резки цилиндрот 5 мм толщиной листа хирургического желатиновой губки. Использование скальпель, чтобы обрезать цилиндр на 3 мм длины и передать 20 G иглу по длине цилиндра, чтобы сформировать отверстие (фиг.2а, ниже).
    Примечание: Мы обнаружили, что расположение желатиновой или коллагеновой матрицей в месте дефекта улучшает удерживание клеток и индуцирует рост в длину вдоль оси кости.
  9. Пропускают цилиндр желатин пены над штифтом и выровнять с воротником (фиг.2В, в центре) и автоклав на сухой цикла при 120 ° С в 15 фунтов на квадратный дюйм. Желатин пены будет высыхать и темным цветом (фиг.2В, ниже).

2. Хирургическая техника

ПРИМЕЧАНИЕ: следующая процедура написана с соблюдением всех принципов, установленных в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных (8-е издание). Пожалуйста, соблюдайте все дополнительные политикиустанавливается местным IACUC и обеспечить IACUC-утвержденного протокола для животных (или эквивалент) на месте, прежде чем приступить следующих разделах.

figure-protocol-2
Рисунок 3: Хирургические инструменты. () Хирургический набор. Micro сверло (1), резки колесо (2), рассасывающийся шовный (3), наружная шовные (4), скальпель лезвия (5), скальпель ручки (6), стерильные мозговые контакты, завернутые в фольгу (7), медуллярный глубиномер сделал форма для подкожных трубы (8), декоративные носом щипцы (9), крысы зубы щипцы (10), тупые Калибрующие расширители иглы (11), водители иглы (12), маленькие кровоостанавливающих (13), декоративные ножницы (14), распатором (15), модифицированный Kern щипцы (16) (B):. Изменения, которые необходимо произвести Керн стиле костяные ручки для мышей.

  1. Выберите хирургическую комнату процедура или чистую лабораторию с закрывающимся двери и не через-трафика. Санируйте подходящую работу Surfacе с клинической степени четвертичного основе дезинфицирующим моющим средством.
  2. Во время ношения одноразовых стерильных перчаток и одежду, создать стерильную поле около 60 х 90 см 2 на облагороженная рабочей поверхности с автоклавированна ткани шторы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется, чтобы иметь помощника удалить внешнюю упаковку и представить стерильные материалы для следователя, установив в поле.
  3. Поставьте продезинфицировать грелку установленное на теплой воды повторного циркуляционного насоса на салфетке и залить стерильных одноразовых шторы. Теплый шарик стерилизатор до рабочей температуры (250-265 ° C, на это уходит до 30 минут).
  4. На стерильной зоне, организовать хирургический набор (рис 3а), чтобы обеспечить удобный доступ ко всем компонентам. Кроме того, обеспечить стерильную хлопковую марлю (2 х 2 дюйма 2), стерильные Q-подсказки, стерильный стальной шар (500 мл), содержащий стерильного физиологического раствора (0,9% вес / об), и хлоргексидин / изопропиловый спирт хирургическое дезинфицирующих аппликаторов.
  5. Соберите небольшойживотное анестезия блок рядом с стерильной поле с индукцией камеры и носового конуса собраний в соответствии с ветеринарными руководства и инструкции по эксплуатации. Используйте кислород клиническое класса, как на поставку газа и ИФ, USP.

figure-protocol-3
Рисунок 4: Хирургическая процедура. (AC) подход и воздействие на бедренной кости. (DE) Высота и порезы. (FK) Развертывание и размера, мозгового каналов.

figure-protocol-4
Рисунок 5: Хирургическая процедура. (AB) Установка штифта. (CD) Закрытие. (E) Типичный образ в правильном положении штифт 24 ч после операции.

  1. Поместите мышь в индукции камеры системы анестезии и себет выход на 2 л мин -1 O 2 и изофлуран концентрации до 3% (об / об).
    1. Убедитесь, что мышь находится в бессознательном состоянии в течение 1 мин; повысить концентрацию до 4% (объем / объем), если это необходимо. Снимите мыши, место на стерильной поле с грелку, закрепленной и применять носовой обтекатель. Передача поступать в конуса, и уменьшить изофлуран до 2,5%, ждать в течение еще 20 сек, и испытания для адекватного хирургического плоскости, в соответствии с институциональной политики. Как правило, отсутствие задних конечностей рефлекса при легком сжал является достаточным для определения адекватной анестезии.
    2. В течение всего процесса, попросите помощника монитор для сильной регулярной дыхания и розовой окраски конечностей и рта региона для обеспечения надлежащего уровня оксигенации в бессознательном состоянии. Отрегулируйте анестезии в соответствии с ветеринарными руководством и институциональной политики, если это необходимо. Применение стерильной искусственной слезы смазки мазь (15% (об / об) минеральное масло, 83% (об / об) WHITE вазелин) для глаз.
  2. Переверните мышь на одной стороне с задних конечностей вверх на новом одноразовой салфетке. Если необходимо, удалите мех с электрической бритвой или кремом для удаления волос. Протрите сайт стерильным физиологическим раствором и удалить дополнительную драпировку с избытком меха. Поместите новый Фенестрированные драпировка над мыши так, чтобы покрыть все части, но весь задних конечностей (фиг.4А), но сохранить вид на лице и лапы для мониторинга окраску и дыхание.
  3. Местонахождение и второй концы бедренной и надрезать кожу в течение 5-10 мм вдоль продольной оси (фиг.4В). Отделите слой кожи от фасции с # 15 скальпель, подвергая боковой подход к бедренной кости с помощью двуглавой мышцы бедра и латеральной широкой мышце бедра. Найдите, где перегородки обоих мышц удовлетворения (это линия белого ткани против розового окрашивания мышцы). С помощью скальпеля, тщательно препарировать по межмышечной границы добедренная кость видна (рис 4В).
  4. Разработка разрез с тупым распатором таким образом, чтобы подвергнуть весь диафизе (фиг.4С). Используйте лифт, чтобы дополнительно обнажить центральные две трети бедренной кости, заботясь, чтобы сохранить задняя сосудисто-нервный пучок на внутренней стороне (рис 4D). Аккуратно очистить мягкую ткань прочь кости с помощью скальпеля и насухо стерильной ватной палочкой или эквивалент.
  5. Найдите центр бедренной кости с суппортами если необходимо, и знак с стерильным скальпелем или маркером, затем отметьте 1,5 мм проксимально и дистально от центра города. Аккуратно возьмитесь за бедра с помощью пары тонких носом щипцы ранее, сделанными в стиле Керна, чтобы предотвратить чрезмерное давление на кости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Точные размеры для модификаций приведены в 3В. Желательно, чтобы проверить щипцы от А эвтаназии образца перед применением, чтобы обеспечить кость не сломается под давлением требуетd для иммобилизации во время резки.
  6. Использование тонкой дрели с тонкой алмазной зернистостью Режущий колеса (диаметр 8 мм х 0,1 мм ширина), сделайте первый разрез с лифтом, в месте, чтобы защитить ткань ниже (рис 4E). Повышение вырезать бедра до 45 °, а крепко держит оконечность диафиза, сделать второй разрез, удаление сегмента 3 мм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: защита лица рекомендуется на данном этапе.
  7. С костью иммобилизованным щипцов, тщательно полосный костномозговой полости каждом конце с тупой 23 G иглы для подкожных инъекций. Использование предварительно сделал глубиномер, сделанный из длины 22 G трубки, помещенной в 19 г трубы (3А, я Tem 8), оценить глубину рассверленной медуллярной полости и убедиться, что он составляет 3 мм (рис 4F-K) , Если медуллярный полость сопротивляется глубиномер 22 г, полосный снова с тупым 22 G иглы для подкожных инъекций.
  8. Осторожно вставьте мозгового штифт в проксимальных затем дистальный медуллярный грavities довести бедра обратно в его первоначальной длины, и создать стабильную 3 мм зазор (фиг.5А, В). При необходимости, нанесите небольшое количество ручного напряжения для достижения хорошего посадку с натягом стержня с кортикальной кости бедра. Убедитесь, что штифт плотно входит мозговых полостей обеих сторон и края разреза кости находятся на одном уровне с воротником. Если имеется зазор, полосный снова с 22 г тупой иглы.
  9. Повторно мышцы и периферических тканей над штифтом и закрыть с непрерывным рассасывающиеся 5-0 шва (рис 5в). Закрыть кожи разрез с 5-7 квадратный узел нейлона 5-0 швов и печатью с хирургическим клеем (рис 5D).

3. Послеоперационные процедуры

  1. После закрытия разрез кожи, снять анестезии, но позволяют O 2 остаться течет до тех пор, мышь не начинает двигаться; это должно занять меньше чем 1 мин. Если мышь остается неподвижной после 5 минO 2 управления, обратитесь к институциональной политики по ветеринарному вмешательства.
  2. Когда мышь начинает двигаться осторожно перенести его в клетку, содержащую предпочтительно сухой, автоклавного постельные принадлежности.
    1. Разместить иглу типа гнездо в каждой клетке и мыши отступить в него, уменьшая движение. Убедитесь, что мышь восстанавливает задних конечностей мобильности 5-10 мин после восстановления сознания.
    2. Выполнять ежедневную послеоперационный мониторинг в соответствии с институциональной политики. Обеспечить желатинизированного увлажнение и питание на полу клетки в течение первых 5-7 дней, а управлять обезболивания и послеоперационного мониторинга в соответствии с институционально утвержденной политики.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы управляем 0,05-0,1 мг кг -1 бупренорфин 24 с 0,25 мл физиологического раствора подкожно дважды в день в течение первых 3 дней, и после этого, если мышь не вернуть нормальную утилиту.
  3. После первого 24 часов восстановления, выполните живой животных рентгеновских изображений недеформированнойR анестезия для визуализации размещение штифта (рис 4д). Если вывод дислоцированных, рассмотреть вопрос о немедленном ревизионных операций.
  4. В 7-й день после операции, удалить швы под наркозом и дом в группах в соответствии с политикой институциональных животноводства.
  5. После 2-5 недель, гуманно усыпить животных в соответствии с Американской Ветеринарной Медицинской Ассоциации одобренных методов эвтаназии 25.
    ПРИМЕЧАНИЕ: внутрибрюшинное введение коммерчески доступного барбитуратом сочетание эвтаназии коктейль является эффективным и гуманным, но местные институциональные политика по эвтаназии должны быть соблюдены.
  6. Тщательно отсечь задних конечностей, подвергая проксимального отдела бедренной кости и таза от медиальной стороны. Аккуратно нажмите на сустав внутрь от боковой стороне конечности, а отсоединения головки бедренной кости от вертлужной впадины (хип розетка) с помощью скальпеля. Вырезать остальные мышцы и кожу острым скальпелем или микро-ножницы, выпускаявсей конечности образуют таз. При резком пары кусачек или тяжелых ножницами, вырезать нижнюю задних конечностей (голень / фибулы), около 5 мм ниже коленного сустава.
    Примечание: Рекомендуется, чтобы все образцы хранятся в идентичным образом до анализа.
  7. Удалить кожу, но оставить мышцы на месте. Закрепить ткани в 10% забуференном формалине с добавлением 10 мМ CaCl 2 фиксатора в течение 1 недели с последующим хранением в фосфатном буферном солевом растворе с добавлением 10 мМ CaCl 2 в течение 1 месяца до визуализации. Выполнение фиксацию и хранение при 4 ° С. Кроме того, сканирование образцов непосредственно без фиксации.

4. Анализ образцов

Примечание: заживление костной ткани может быть оценена с помощью широкого спектра методик, которые выходят за рамки этого протокола. Ниже метод, который мы успешно используют с использованием образца microCT (μCT) тепловизор. Рекомендуется, чтобы следующие параметры аре проверены на начальном этапе, а затем оптимизированы для конкретных нужд проекта.

  1. Оберните образец в тонкий слой пластика уплотнительной пленкой и поместите его вертикально в приборной камеры. Убедитесь, что бедра перпендикулярно к стадии образца во всей проверки. Установите Сканирование на следующие параметры: напряжение = 29 кВ, ток = 661 мкА, мощность = 19 Вт, размер изображения пиксель (мкм) = 21,00; 360 градусов вращения = да; рамка усреднения = на (5); шаг поворота (град) = 1,00, хаотичное движение = на. Сохранение изображений в качестве JPEG файлов в одной папке назначения на сканирование (например, рис 6а).
    ПРИМЕЧАНИЕ: сканирование должно быть завершено в 57 мин.
  2. Использование программного обеспечения восстановления, чтобы генерировать осевые изображений на основе следующих параметров; сглаживание = на (4), несоосности компенсации = ON сокращения кольцо артефактов = о (5), лучевой закалки коррекции (40%), вращение CS (DEG) = 0,00. Установите вывод 2,000-15,000 Хаунсфилда единиц. Сохранение изображений в качестве JPEG файловв одной папке назначения на сканирование.
  3. Использование осевые изображения и аналитическое программное обеспечение, определить область интереса (ROI), сначала установив проксимального и дистального ребра исходной дефекта. Достижение этого выберите разделы, которые охватывают только воротник. Поскольку втулка толще мозгового штифта, эти участки легко определяются (фиг.6В, слева). Исключить воротник из расчетов, опираясь зону отчуждения вокруг нее (с перевесом в 100 мкм) и передачи зону каждой из секций в ROI (рис 6В, справа).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полярные моменты инерции, 3D реконструкции и расчетов, такие как объем новой кости (рис 6C, D) может быть легко достигается с помощью программного обеспечения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мыши обычно выздоравливают сознание и задних конечностей мобильности 5-10 минут после прекращения анестезии. В течение первых 5 дней, желательно, чтобы домовых мышей индивидуально и ввести экологические обогащения для предотвращения избыточного использования конечности. Для этого, гнезда иглу типа снизить потребность в гнезде здания и поощрять отдыхает. Мы также отметили, что предоставление питания и гидрогеля на полу клетки снижает вероятность контактный перемещения. В 5-дневного периода, обезболивания должны быть введ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы опишем простой метод для создания критической величины контактный стабилизированный дефект мышиного бедра с использованием стандартных лабораторных и ветеринарное оборудование. В то время как сборка выводов и самого хирургического вмешательства требует практики, это хорошо в пределах возможностей хорошо подготовленного биомедицинских исследований ученого или ветеринаром.

Контактный позиционируется в костномозговой канал без дополнительной фиксации, что делает процедуру технически бо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Мы благодарим сотрудников и ветеринаров на Скотта и Белый больницы кафедры сравнительной медицины, храм, штат Техас, за их неоценимую консультации и помощь при разработке этой методики. Эта работа была частично финансируется за счет Института регенеративной медицины фондов программы, Скотт и Белый РГП грант № 90172, NIH 2P40RR017447-07 и NIH R01AR066033-01 (NIAMS). Мы благодарим доктора Сьюзан Зейтауни для расстойки рукопись.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
pin assembly
Dremel поворотный инструментDremel8220или эквивалент
Сверхмощное отрезное колесоDremel420
Хирургическая трубка 19  GМелкие детали (Амазонка)B000FMZ8LYOD 1.07  мм, ID 0.889 
мм Хирургические трубки 21  Gмелкие детали (Амазонка)B000FMZ8YQOD 0.82  мм, ID 0.635 
мм Хирургические трубки 22  Gмелкие детали (Амазонка)B000FMYLZSнаружный диаметр 0.719  мм, ID 0.502 
мм Хирургические трубки 23  GМелкие детали (Амазонка)B000FN0SY0OD 0.643  мм, ID 0.444  мм
Цианоакрилатный клейLoctite1365882
Наждачный дискDremel413
Резиновая полировальная точкаDremel462
Войлочный полировальный дискDremel414
Желатиновая губкаSurgifoam/Ethicon1974
Пуансон биопсийный резакMiltex33-34
Хирургия/послеоперационная
Теплая подушка и циркуляционный насосStryker/ThermocareTP700, TP700C, TPP722
Покрытие четвертичным спреемSteris1429-77
Стерилизатор шариковGerminator/CellPoint ScentificGerminator 500
Система анестезииVetEquip Inc901806 или 901807/901809
Изофторновый анестетикVETone/MWI501017, 502017
Хирургическое дезинфицирующее средствоChloraprep/CareFusion260449
Хирургические инструментыFine Science Инструментыразличныерекомендуют
Защита лицанемецкого производства Splash Shield4505
Перезаряжаемая высокоскоростная дрельFine Science Tools18000-17
Алмазный отрезной кругStrauss Diaiond361.514.080HP
Рассасывающиеся шовные нити CovidienUM-213
Наружные швыEthicon668Gили аналог
Vetbond3M1469SBили аналог
Гель для гидратацииClear H2O70-01-1082
Диетический гельClear H2O72-01-1062
БупренорфинReckitt and Benckser12496-0757-01контролируемое вещество
Мышиные иглуBio ServK3328, 3570,3327
Коктейль для эвтаназииEuthasol/Virbac710101контролируемое вещество
Analysis
Live animal imager OrthoscanFD Pulseили эквивалентный
аппарат микро-компьютерной томографии и программное обеспечениеBrukerSkyscan1174или эквивалент
Герметизирующая пленка/парапленка MVWR или Fisher100501-338, S37441
*Универсальные источники подходят для всех других предметов, таких как гаузы, шторы, защитная одежда, оборудование для ухода за животными.

Ссылки

  1. Brinker, M. R., O'Connor, D. P. The incidence of fractures and dislocations referred for orthopaedic services in a capitated population. J Bone Joint Surg Am. 86, 290-297 (2004).
  2. Cheung, C. The future of bone healing. Clin Podiatr Med Surg. 22, 631-641 (2005).
  3. Rosemont, I. L. United States Bone and Joint Decade: The burden of musculoskeletal diseases and musculoskeletal injuries. , American Academy of Orthopedic Surgeons. (2008).
  4. Tzioupis, C., Giannoudis, P. V. Prevalence of long-bone non-unions. Injury. 38, Suppl 2. S3-S9 (2007).
  5. Marsh, D. Concepts of fracture union, delayed union, and nonunion. Clin Orthop Relat Res. , S22-S30 (1998).
  6. Spicer, P. P., et al. Evaluation of bone regeneration using the rat critical size calvarial defect. Nat Protoc. 7, 1918-1929 (2012).
  7. Green, E., Lubahn, J. D., Evans, J. Risk factors, treatment, and outcomes associated with nonunion of the midshaft humerus fracture. J Surg Orthop Adv. 14, 64-72 (2005).
  8. Kanakaris, N. K., Giannoudis, P. V. The health economics of the treatment of long-bone non-unions. Injury. 38, Suppl 2. S77-S84 (2007).
  9. Dimitriou, R., Mataliotakis, G. I., Angoules, A. G., Kanakaris, N. K., Giannoudis, P. V. Complications following autologous bone graft harvesting from the iliac crest and using the RIA: a systematic review. Injury. 42, Suppl 2. S3-S15 (2011).
  10. Boer, H. H. The history of bone grafts. Clin Orthop Relat Res. , 292-298 (1988).
  11. Aro, H. T., Aho, A. J. Clinical use of bone allografts. Ann Med. 25, 403-412 (1993).
  12. Burstein, F. D. Bone substitutes. Cleft Palate Craniofac. J. 37, 1-4 (2000).
  13. Kao, S. T., Scott, D. D. A review of bone substitutes. Oral Maxillofac Surg Clin North Am. 19, 513-521 (2007).
  14. Boden, S. D. Overview of the biology of lumbar spine fusion and principles for selecting a bone graft substitute. Spine. (Phila Pa 1976). 27, S26-S31 (1976).
  15. Hollinger, J. O., Kleinschmidt, J. C. The critical size defect as an experimental model to test bone repair materials). J Craniofac Surg. 1, 60-68 (1990).
  16. Key, J. The effect of local calcium depot on osteogenesis and healing of fractures. J. Bone Joint Surg. (Am). 16, 176-184 (1934).
  17. Holstein, J. H., et al. Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration). J Orthop Trauma. 23, S31-S38 (2009).
  18. Histing, T., et al. Small animal bone healing models: standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49, 591-599 (2011).
  19. Cheung, K. M., et al. An externally fixed femoral fracture model for mice. J Orthop Res. 21, 685-690 (2003).
  20. Hiltunen, A., Vuorio, E., Aro, H. T. A standardized experimental fracture in the mouse tibia. J Orthop Res. 11, 305-312 (1993).
  21. Manigrasso, M. B., O'Connor, J. P. Characterization of a closed femur fracture model in mice. J Orthop Trauma. 18, 687-695 (2004).
  22. Garcia, P., et al. Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review. Eur Cell Mater. 26, 1-12 (2013).
  23. Garcia, P., et al. Development of a reliable non-union model in mice. J Surg Res. 147, 84-91 (2008).
  24. Flecknell, P. A. The relief of pain in laboratory animals. Lab Anim. 18, 147-160 (1984).
  25. Guidelines on the Euthanasia of Animals. , American Veterinary Medical Association. Schaumburg, IL 60173. (2013).
  26. Neill, K. R., et al. Micro-computed tomography assessment of the progression of fracture healing in mice. Bone. 50, 1357-1367 (2012).
  27. Bagi, C. M., et al. The use of micro-CT to evaluate cortical bone geometry and strength in nude rats: correlation with mechanical testing, pQCT and DXA. Bone. 38, 136-144 (2006).
  28. Hadjiargyrou, M., et al. Transcriptional profiling of bone regeneration. Insight into the molecular complexity of wound repair. J Biol Chem. 277, 30177-30182 (2002).
  29. Clough, B. H., et al. Bone regeneration with osteogenically enhanced mesenchymal stem cells and their extracellular matrix proteins. J Bone Miner Res. , (2014).
  30. Lu, C., et al. Cellular basis for age-related changes in fracture repair. J Orthop Res. 23, 1300-1307 (2005).
  31. Jepsen, K. J., et al. Genetic variation in the patterns of skeletal progenitor cell differentiation and progression during endochondral bone formation affects the rate of fracture healing. J Bone Miner Res. 23, 1204-1216 (2008).
  32. Thayer, T. C., Wilson, S. B., Mathews, C. E. Use of nonobese diabetic mice to understand human type 1 diabetes. Endocrinol Metab Clin North Am. 39, 541-561 (2010).
  33. Jee, W. S., Yao, W. Overview: animal models of osteopenia and osteoporosis. J Musculoskelet Neuronal Interact. 1, 193-207 (2001).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Критический дефект размерамодель бедренной кости мышиимплантация интрамедуллярного штифтаанализ заживления костимикро-КТ визуализациягистологическая оценкаметод хирургической фиксацииисследование регенерации костной тканисегментарный дефект костирентгенологическая оценка
Простой Critical размера бедренной кости Дефект Модель на мышах
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.