Методическая статья

Proteoliposome-Based Efflux Анализ для определения одиночных молекул Свойства Cl

DOI:

10.3791/52369

⸱

20 апреля 2015 г.

 , 
1Department of Anesthesiology, Weill Cornell Medical College, 2Department of Physiology and Biophysics, Weill Cornell Medical College, 3Department of Biochemistry, Weill Cornell Medical College

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протеолипосомы используются для изучения очищенных каналов и транспортеров, восстановленных в четко определенной биохимической среде. Проиллюстрирована экспериментальная процедура измерения оттока, опосредованного этими белками. Описаны этапы подготовки протеолипосом, выполнения записи и анализа данных для количественного определения функциональных свойств восстановленного белка.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Последние 15 лет характеризовались взрывом способности сверхэкспрессировать и очищать мембранные белки как у прокариотических организмов, так и у эукариот. Этот рост в значительной степени обусловлен успешным стремлением получить структурную информацию о мембранных белках. Тем не менее, способность функционально исследовать эти белки не развивалась с той же скоростью и часто ограничивается качественными анализами ограниченной количественной ценности, тем самым ограничивая механистические идеи, которые они могут предоставить. Описан анализ для количественного исследования транспортной активности восстановленных Cl-каналов или транспортеров. Анализ основан на измерении скорости оттока Cl- из протеолипосом, следующего за добавлением валиномицина-ионофора К+ для шунтирования мембранного потенциала. Ионочувствительный электрод используется для отслеживания временного хода оттока ионов из протеолипосом, восстановленных с помощью нужного белка. Метод хорошо подходит для механистических исследований, так как он позволяет количественно определить ключевые свойства восстановленного белка, такие как его унитарная скорость транспортировки, доля активного белка и молекулярная масса функциональной единицы. Анализ также может быть использован для определения эффекта низкомолекулярных соединений, которые непосредственно ингибируют/активируют восстановленный белок, а также для проверки модулирующих эффектов мембранной композиции или липид-модифицирующих реагентов. Там, где это возможно, прямое сравнение результатов, полученных с помощью этого метода, хорошо согласуется с результатами, полученными с помощью электрофизиологических подходов. Метод проиллюстрирован на примере CLC-ec1, теплообменника типа CLC H+/Cl-, в качестве модельной системы. Анализ оттока может быть использован для исследования любого Cl-проводящего канала/транспортера и, с минимальными изменениями, может быть адаптирован для изучения любого ион-транспортного белка.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В последние два десятилетия способность сверхэкспрессировать и очистить мембранные транспортные белки, резко возросло: ионных каналов, первичные и вторичные транспортеры настоящее время регулярно очищается от гетерологичных системах экспрессии, а также природных источников. Новые подходы к мониторингу выражение, улучшить и облегчить добычу и повышают устойчивость этих белков постоянно разрабатываются 1-5. Эти технологические прорывы сыграли важную роль в инициировании взрыва структурной информации атомного уровня на мембранных белков, которые, в свою очередь, усилили нашу понимания структурных основ их функции. В отличие от этого, наша способность исследовать функциональные свойства очищенных белков не увеличится с той же скоростью, так что в некоторых случаях структурная информация высокого разрешения сопровождается качественными функциональных данных, тем самым ограничивая нашу способность количественно тестовой структуры на основе прогнозов. Таким образом, РАЗРАБОТКАт количественных и обобщению функциональных анализов является важным шагом на пути к выяснению механистических основ функции мембранных белков.

Здесь мы описываем оттока анализа, который может использоваться для количественного определения ключевых функциональные свойства очищенной и восстановленных Cl - каналов и транспортеров. Принципы, лежащие в основе анализа могут быть обобщены на различных транспортных систем, а также лицам, не являющимся ионно-транспортировки белков. Липосомы восстанавливали с очищенными Cl - канал / Транспортировка в присутствии большого Cl - градиента (рис 1а, б). Cl - истечение инициируется добавлением ионофора, чтобы обеспечить поток контр-ионов, в нашем случае К + ионофор валиномицина, которые шунта напряжение, установленную Cl - градиент и установить начальный мембранный потенциал к равновесному потенциалу К + 6,7. Без тон не ионофором никакого существенного чистый Cl - истечение происходит, как это предотвратить генерации трансмембранного потенциала. Данные количественно описывается двумя измеряемых параметров (Рисунок 1С): τ, постоянная времени Cl - истечение, и F 0, фракции липосом, не содержащих активный белок. С τ и F 0 унитарное Cl - транспорт скоростью, доля активных белков и молекулярная масса активного комплекса может быть получена 8. Способ показан здесь с помощью Протеолипосомы восстановленные с CLC-EC1, хорошо охарактеризованной CLC-типа Н + / Cl - теплообменник известной структуры и функции. Этот анализ легко обобщается на каналы или транспортеры с разной ионной избирательности и чья деятельность зависит от наличия напряжения и / или лигандов. Кроме того, этот анализ может быть использован, чтобы определить, является ли малые молекулы, непосредственно влияет на восстановленный белок,Для количественной оценки влияния этих соединений и, как состав мембраны или липидные модификации реагенты влияют на функцию восстановленных каналов и транспортеров.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. липидов Подготовка

  1. Алиготе требуемое количество липидов в прозрачной стеклянной трубки. Ты Видишь. палочка полярный липидный экстракт, но большинство липидов композиции могут быть использованы. Если липиды в форме порошка, ресуспендируют их в хлороформе до концентрации 20 мг / мл. Высушите липидов при комнатной температуре под N 2 газа, пока все растворитель испаряется.
  2. Ресуспендируют липидов в пентана и сушат его снова постоянный поток газа N 2 для удаления оставшихся следов хлороформа. Сухая, пока весь растворитель не испарится. В то время как сушка, осторожно повернуть трубку таким образом, что липидный распространяется в однородной пленки, покрывающей нижнюю треть трубки, а не образующего плотную массу в нижней части.
  3. Добавить восстановление буфера, содержащего моющее средство (300 мМ KCl, 50 мМ лимонной кислоты, 25 мМ K 2 HPO 4, pH 4,5, 35 мМ CHAPS), чтобы растворить липиды. Используйте другие мягкие моющие средства для этого шага, если белок плохо терпимо к гл.
  4. ResuspenD липиды ясности с использованием водяной бани ультразвукового. Погрузить трубку в центре обработки ультразвуком воды бане при максимальной мощности короче (30 сек-1 мин) импульсы с короткой (30 сек-1 мин) паузы. Решение должно стать ясно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: конечная степень ясности достигнуто, зависит от конкретного состава липидов используется. Некоторые вариации от партии к партии на этой стадии, даже среди номинально идентичных липидов, также возможно. Остаточный мутности из-за рассеяния света крупными частицами в суспензии, которые могут быть удалены путем центрифугирования.
  5. Инкубируйте ресуспендировали липидов при комнатной температуре в течение 20-60 мин.

2. Proteoliposome Формирование

Примечание: несколько стратегий можно использовать для вставки моющего средства, солюбилизированного белка в липосомы. Для CLC-EC1 диализ работает хорошо и поэтому методом выбора 6,9,10.

  1. Добавить очищенный белок нужный белок-чтобы-липида (P / L) соотношение (выраженное в мкг O F белок / мг липида). Выбор коэффициента P / L зависит от целей эксперимента.
    1. Если цель состоит в том, чтобы оценить активность белка, представляющего интерес, восстановить при высокой P / L с максимально сигнал, так как каждый липосом содержит несколько копий белка. Для количественной оценки активности и / или унитарную скорость транспортного белка, восстановить в разведении режима Пуассона при низких P / единиц, так что каждый пузырек содержит в среднем 1 белка. См Шаг 7 и обсуждение на более глубокий анализ, когда использовать каждый режим.
  2. Для определения оптимальных значений P / L для различных режимов, выполнить полную титрование деятельности в зависимости от концентрации белка 8,11-13. Тем не менее, для любого белка, для которых молекулярная масса (MW, выраженного в кДа) активного блока известны следующие значения P / L могут быть использованы в качестве исходных guesstimates:
    PG "/>
    figure-protocol-1
  3. Загрузка белок и липидной смеси в предварительно увлажненной диализа трубки или кассеты. Поместите диализа устройство в химический стакан, содержащий 500-1,000x объем буфера липидов восстанавливающей (т.е. 1 л буфера для 1 мл липидной ресуспендирования) при осторожном перемешивании.
    1. Изменить буфер 3-4 раза с интервалом в> 3 ч. В каждой смене раствора, промойте кассета / трубки и стакан с дистиллированной водой и заполнить стакан со свежим буфером восстановления. Включить 1-2 O / N интервалов для решения меняются. Точное количество и продолжительность раствора изменяется в зависимости от конкретного липида и моющих средств, используемых.
  4. После последнего шага завершена, удалите липосом из диализной судна, аликвоту их в трубах и флэш заморозить их в жидком N 2 или заморозить при температуре -80 ° C.

3. Запись Set-до

Примечание: запись настройки (2А) состоит из двух палат (плоскодонных цилиндров, ~ 3-4 мл объема), в Cl - (см ниже) электрод, рН-метр с аналоговым или цифровой выходной электрический, дигитайзер, и компьютер с соответствующим программным обеспечением сбора данных.

  1. Подключение Cl - электрод рН-метра, выход рН-метра к цифровым преобразователем, который подключен к компьютеру. Поместите электрод сравнения в одной камере и перекодирования провод в другой (рис 2б).
    ПРИМЕЧАНИЕ: полярность проводов правильная, если у Av Cal (см Шаг 6.4 и 7.2) положительно.
  2. Поместите камеры на мешалке с мешалкой в записи камеры (рис 1б). Убедитесь в том, мешалки не прикасайтесь к электроду.
  3. Подключите камеры, используя агар мост (рис 2B) (100 мМ КСl и 2% агарозном). Храните мосты агара в 100 мМ KCl.

4. Подготовка Cl - Электрод

  1. Возьмите старый и -possibly- нефункционирующих рН электрод. Разбить стекло покрытие полностью раскрыть серебряные провода.
  2. Осторожно снимите покрытие из серебра проводов, используя лезвие скальпеля. Очистите провода, используя обильное количество H 2 O и этанола.
  3. Место в насыщенном растворе FeCl 3 (или отбеливателя) до проводов покрыты однородным слоем темно-AgCl.

5. Получение однослойные везикулы

  1. Ночь перед экспериментов, зыбь 1 г Сефадекса G-50 шариков в 15 мл внешнего буфера (1 мМ KCl, 150 мМ K 2 SO 4, 25 мМ лимонной кислоты, pH 4,5) при осторожном встряхивании (не мешают) для по меньшей мере, 3 ч при комнатной температуре перед использованием. Каждый эксперимент требует ~ 3 мл набухшего бисером. Держите опухшие бисером при 4 ° С в течение нескольких дней максимум.
  2. В то время как липосомы тают при комнатной температуре, влить в каждый столбец ~ 3 мл опухших G-50 шариков. Дайте им высохнуть самотеком при комнатной температуре; это, как правило, занимает 1-2 мин.
  3. Подготовка однослойные везикулы экструзией Протеолипосомы 11 раз через мини-экструдере с использованием 0,4 м тефлоновую среза.
  4. Поместите колонку в пластиковом круглым дном трубки. Спин столбцы, чтобы удалить излишки раствора. Центрифуга в течение 20-30 сек при 1400 мкг в клинической центрифуге.
  5. Выбросить, положите столбец в 13 х 100 мм стеклянной трубки и добавить 100 мкл экструдированных везикул в колонке. Спин колонка течение 1 мин при 500 х г в клинической центрифуге.
  6. Соберите ~ 200 мкл проточные, которые будут добавлены к записи камеры в шаге 6.5.

6. Efflux Измерение

  1. Поместите 2 мл 100 мМ KCl в контрольном (земля) камеры и 1,8 мл внешнего буфера (1 мМ KCl, 150 мМ K 2 SO 4, 25 мМ лимонной кислоты, pH 4,5) в записи камеры. Небольшой осмотическое дисбаланс между внутренними внешние решения не влияет
  2. Запустите программу приобретения. Пусть исходная равновесие, это может занять несколько минут.
  3. После того, как сигнал достигнет стабильного базовой линии (липосомы готовы и столбцы сухой), начните запись (рис 3а).
  4. Добавить 15 мкл 10 мМ KCl решение для калибровки системы (рис 2а).
  5. Добавить липосомы. Небольшой скачок может быть видна из-за неполного удаления внешнего Cl - от протеолипосом (3А). Подождите, пока базовый стабилизируется.
  6. Добавить валиномицина (1 мкл при концентрации 1 мг / мл в этаноле), чтобы инициировать отток (фиг.3А).
  7. Пусть истечение запустить его ход времени, пока не наступит плато (рис 3А).
  8. Добавить 40 мкл 1,5 М β-октилглюкозида (β-OG), полученного в внешнего буфера для растворения всех липосом (фиг.3А). Конец записи.

7. Данныенализ

  1. Экспорт файла трассировки из в формате ASCII или текстовом и импортировать его в программу анализа выбора.
  2. Измерьте напряжение в следующих пунктах (3А):
    В начале записи (V 0);
    После добавления калибровочного импульса (V CAL);
    После того липосом (V липо);
    В конце оттока (V ребра);
    После добавления моющего средства (V TOT);
    Базовый уровень напряжения, так что V 0 = 0.
  3. Используя уравнение Нернста-Планка для определения экспериментальное значение figure-protocol-2 путем измерения
    figure-protocol-3
    Где Vol Кэл объем калибровки импульса в мкл, 1800 в объем камеры в начале эксперимента выражается в1, л, [Cl] кал / в являются Cl - концентрация калибровочного импульса и внешнего буфера в мм и у Av кал является скачок в мВ измеряется после калибровки импульса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это эмпирическое определение α служит трем целям: он гарантирует, что система должным образом реагирует, предлагает меру согласованности ответ прибора между экспериментов, а также проверьте, нет ли ошибки не были сделаны в процессе становления решений.
  4. Рассчитайте концентрации хлора после каждого следующего шага:
    figure-protocol-4
    figure-protocol-5
    figure-protocol-6
    Коэффициент 3/400 происходит от разведения калибровки импульса 15 мкл в 2000 мкл конечного объема.
  5. Calculели изменения в [CL] на каждом шаге, ΔCl липосакции / FIN / малыш.
  6. Преобразование V (T) в Cl (Т) с
    figure-protocol-7
    Непосредственно определить [CL] значения в критических точках и сравнить их с расчетными значениями в качестве внутреннего контроля.
  7. Нормализация проследить, чтобы Cl отн липо = 0 и Cl отн малыш = 1
    figure-protocol-8
  8. Установите время отток курс к следующему уравнению:
    figure-protocol-9
    Там, где L представляет собой скорость Cl - утечки, что определяется экспериментально путем измерения Cl - отток из небелковых липосом, полученных в тех же условиях, и τ является постоянной времени процесса.
  9. Рассчитать V, начальную скорость:
    figure-protocol-10
    Там, где ΔCl ребра выражается в миллимолей и V представляет собой объем камеры в мкл.
  10. Рассчитайте транспорт / скорость проводимости
    figure-protocol-11
    Где р P / L, МВт является молекулярная масса активного комплекса выражены в кД

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем подробный и надежный протокол для измерения Cl - транспорт, опосредованный очищенной CLC-EC1, прокариотической CLC-типа Н + / Cl - теплообменник, восстановленного в липосомы. Схематическое представление опыта показана на рисунке 3 Протеолипосомы восстановленные с очищенной CLC-EC1 и содержащий большой внутренней Cl -. Погружены в растворе ванны, содержащем низкую Cl -. В этих условиях чистой Cl - истечение препятствует накопл...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описали подробный протокол для измерения Cl - транспорт, опосредованный очищенных анион-селективным каналов или перевозчиков восстановленных в липосомы. Пример был использован прокариотической H + / Cl - теплообменник CLC-EC1. Тем не менее, методика может быть легко адаптированы для изучения каналов стробированных лигандами 12,13,15, 11,12 напряжения или спортивных другую анионную селективность 15,16 заменой Ag: электрод AgCl с одним подходящим для рассматриваемо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантом NIH GM085232 и премией Ирмы Т. Хиршль / Моник Вейл-Колье (для A.A.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Липосомикатор, Avanti Polar Lipids Inc.  Avanti Polar Lipids Inc.610200
IEC Centra CL2 НастольныйThermo Scientific
Orion Research Model 701A Цифровой измерительИх можно найти на Ebay.
Нефункциональный pH-зондПодойдет любой pH-метр с серебряными проводами. Стеклянное/пластиковое покрытие необходимо удалить, а провода очистить.
DI-710 Регистратор данныхDATAQ instruments
Программное обеспечение для сбора данных WinDAQ Программное обеспечение для сбораDATAQ
Одноразовые пластиковые колонки, гравитационные, 2млПрокол (Thermo Scientific)29922
Пробирки для культуры KIMAX, одноразовые, боросиликатное стеклоKimble Chase73500-13100
Набор экструдеров с держателем/нагревательным блокомAvanti Polar Lipids Inc.610000
Компьютер
pH-mV данных instruments

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14, 673-681 (2006).
  2. Drew, D., et al. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nat Protocols. 3, 784-798 (2008).
  3. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20, 1293-1299 (2012).
  4. Almo, S. C., Love, J. D. Better and faster: improvements and optimization for mammalian recombinant protein production. Curr Opin Struct Biol. 26, 39-43 (2014).
  5. Xiao, S., Shiloach, J., Betenbaugh, M. J. Engineering cells to improve protein expression. Curr Opin Struct Biol. 26, 32-38 (2014).
  6. Accardi, A., Miller, C. Secondary active transport mediated by a prokaryotic homologue of CLC Cl- channels. Nature. 427, 803-807 (2004).
  7. Nguitragool, W., Miller, C. Uncoupling of a CLC Cl-/H+ exchange transporter by polyatomic anions. J. Mol. Biol. 362, 682-690 (2006).
  8. Walden, M., et al. Uncoupling and turnover in a Cl-/H+ exchange transporter. J. Gen. Physiol. 129, 317-329 (2007).
  9. Accardi, A., Kolmakova-Partensky, L., Williams, C., Miller, C. Ionic currents mediated by a prokaryotic homologue of CLC Cl- channels. J. Gen. Physiol. 123, 109-119 (2004).
  10. Basilio, D., Noack, K., Picollo, A., Accardi, A. Conformational changes required for H(+)/Cl(-) exchange mediated by a CLC transporter. Nat Struct Mol Biol. 21, 456-463 (2014).
  11. Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels. Journal of Molecular Biology. 387, 1055-1060 (2009).
  12. Terashima, H., Picollo, A., Accardi, A. Purified TMEM16A is sufficient to form Ca2+ activated Cl- channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 19354-19359 (2013).
  13. Malvezzi, M., et al. Ca2+-dependent phospholipid scrambling by a reconstituted TMEM16 ion channel. Nature Communications. 4, 2367(2013).
  14. Picollo, A., Malvezzi, M., Houtman, J. C., Accardi, A. Basis of substrate binding and conservation of selectivity in the CLC family of channels and transporters. Nat Struct Mol Biol. 16, 1294-1301 (2009).
  15. Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner. J Biol Chem. 287, 36639-36649 (2012).
  16. Stockbridge, R. B., et al. Fluoride resistance and transport by riboswitch-controlled CLC antiporters. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 15289-15294 (2012).
  17. Menon, I., et al. Opsin is a phospholipid flippase. Curr Biol. 21, 149-153 (2011).
  18. Nimigean, C. M., Miller, C. Na+ block and permeation in a K+ channel of known structure. J Gen Physiol. 120, 323-335 (2002).
  19. Picollo, A., Xu, Y., Johner, N., Bernèche, S., Accardi, A. Synergistic substrate binding determines the stoichiometry of transport of a prokaryotic H(+)/Cl(-) exchanger. Nat Struct Mol Biol. 19, 525-531 (2012).
  20. Tsai, M. F., Fang, Y., Miller, C. Sided functions of an arginine-agmatine antiporter oriented in liposomes. Biochemistry. 51, 1577-1585 (2012).
  21. Heginbotham, L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. Functional reconstitution of a prokaryotic K+ channel. J Gen Physiol. 111, 741-749 (1998).
  22. Lundbaek, J. A., Collingwood, S. A., Ingólfsson, H. I., Kapoor, R., Andersen, O. S. Lipid bilayer regulation of membrane protein function: gramicidin channels as molecular force probes. J R Soc Interface. 7, 373-395 (2010).
  23. Lim, H. H., Stockbridge, R. B., Miller, C. Fluoride-dependent interruption of the transport cycle of a CLC Cl(-)/H(+) antiporter. Nat Chem Biol. 9, 712-715 (2013).
  24. Stockbridge, R. B., Robertson, J. L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. A family of fluoride-specific ion channels with dual-topology architecture. Elife. 2, e01084(2013).
  25. Nimigean, C., Shane, T., Miller, C. A cyclic nucleotide modulated prokaryotic K+ channel. J Gen Physiol. 124, 7(2004).
  26. Brohawn, S. G., del Mármol,, J,, MacKinnon, R. Crystal Structure of the Human K2P TRAAK, a Lipid- and Mechano-Sensitive K+ Ion Channel. Science. 335, 436-441 (2012).
  27. Jayaram, H., Robertson, J. L., Wu, F., Williams, C., Miller, C. Structure of a slow CLC Cl-/H+ antiporter from a cyanobacterium. Biochemistry. 50, 788-794 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CLC ec1

Похожие статьи